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2023 年第 3 期 纺织标准与质量 49 测试技术 影响羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检验结果关键因素分析郑权莉 张美英 刘亚和 陈园园(中纺标检验认证股份有限公司，100025)【摘要】为了掌握影响羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检验结果的关键因素，采用单因素试验的方法分析了过滤方式、培养基成分、厌氧条件和加热条件等 4 个因素。该试验结果表明，采用薄膜过滤法测定羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的量并不可取；亚硫酸盐是亚硫酸还原梭状芽孢杆菌生长不可或缺的营养物质，且该菌为专性厌氧菌，只有在无氧条件下才能生长繁殖。同时，加热温度高于或低于 75，加热时间大于或小于 10 min，都会直接影响亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量。该试验表明，薄膜过滤法不适用于定量测试羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽孢杆菌；亚硫酸盐为亚硫酸还原梭状芽孢杆菌实现自身生长所必需的营养物质；厌氧环境和加热条件是影响亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量的关键因素。【关键词】亚硫酸还原梭状芽孢杆菌；亚硫酸铁琼脂；厌氧环境；加热条件【中图分类号】TS 107 【文献标志码】B【文章编号】1003-0611(2023)03-0049-051 引言亚硫酸还原梭状芽孢杆菌是羽毛羽绒检测中主要微生物指标之一，也是引起产品不合格的主要污染菌。据资料记载，羽绒羽毛及其制品中亚硫酸还原梭状芽胞杆菌的污染率高达 20%1。在检测羽绒羽毛及羽绒服装填充物的过程中发现，确实存在亚硫酸还原梭状芽孢杆菌超标的情况。本文参照相关标准并结合亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验的工作实际，分析了过滤方式、培养基成分、厌氧条件和加热条件对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检出量的影响，以期掌握影响羽毛羽绒中亚硫酸还原梭状芽胞杆菌检验结果的关键因素，提高检验结果的准确性和稳定性。第一作者简介：郑权莉（1987），女，工程师，研究方向：纺织材料检测。收稿日期：2023 年 2 月 1 日。2 试验2.1 原理与方案2.1.1 原理首先，采用 0.1%的无菌蛋白胨水萃取羽毛羽绒中的微生物；其次，采用 75水浴加热 10min、接种亚硫酸铁多黏菌素 B 琼脂、厌氧培养实现亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的选择性培养；最后，计数典型的暗棕色或黑色菌落，进行验证试验，并以传统的统计方法计算出每克羽绒样品中的平均菌落数。2.1.2 方案2.1.2.1 过滤方式为探讨过滤方式对亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量的影响，除了采用传统的无菌纱布过滤外，先采用 0.45m 无菌滤膜过滤原始样液，再用 5mL 的0.1%无菌胨水充分洗脱滤膜，再加热至 75处理50 纺织标准与质量 2023 年第 3 期10min 等步骤。不同过滤方式的试验方案见表 1：表 1 不同过滤方式方案编号标准依据实施方案1GB/T14272-2011C.9.4.3采用消毒纱布将两个原始萃取液过滤后混合，制成样液。2GB/T10288-2003A.6.3.3用 0.45m 膜 过 滤 100mL样液，再用 5mL0.1%的无菌胨水充分洗脱滤膜，将洗脱液作为待测样液。2.1.2.2 厌氧条件厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在空气(18%氧气)或 10%二氧化碳浓度下固体培养基表面生长的细菌。根据对氧气的耐受程度，厌氧菌可分为专性厌氧菌、微需氧厌氧菌和兼性厌氧菌三大类。由于缺乏对亚硫酸还原梭状芽胞杆菌的厌氧程度的了解，尝试分析不同含氧量下的亚硫酸还原梭状芽胞杆菌生长状况。不同厌氧环境控制方案见表 2：表 2 不同厌氧环境控制方案培养环境类型控制措施有氧将接种后的培养皿放置在普通生化培养箱内培养。微氧在干燥器内放入酒精棉，将接种后的培养皿置于干燥器内，随即点燃酒精棉，盖好干燥器皿盖。待酒精棉熄灭（即环境中的氧气消耗殆尽）后，将干燥器放入生化培养箱内培养。无氧将接种后的培养皿放入厌氧袋内，同时放入厌氧包和厌氧指示条，压紧厌氧袋封口，然后将其置于生化培养箱内培养。其中，厌氧包用于消耗厌氧袋中的氧气，厌氧指示条用于指示环境中的含氧量。2.1.2.3 培养基成分亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的主要特征之一是将亚硫酸盐还原为硫化物，利用亚硫酸盐实现自身生长。考虑到平板计数琼脂适用于各种微生物的菌落计数，尝试将其用于亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的培养计数。不同类型培养基的情况说明见表 3。为进一步探究培养基成分对亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量的影响，选取 3 种适用于检验厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的培养基进行比对试验。培养基信息见表 4。表 3 不同类型培养基培养基品牌及货号产品说明平板计数琼脂陆桥 CM101用于测定菌落总数。亚硫酸铁琼脂陆桥 CM186用于检验厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌。表 4 同类型培养基培养基品牌及货号产品说明亚硫酸铁琼脂陆桥CM186用于检验厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌。亚硫酸铁多黏菌素 B琼脂陆桥CM197用于计数羽绒羽毛中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌(GB标准)。海博HB0304-2用于计数亚硫酸还原梭状芽孢杆菌。2.1.2.4 加热条件加热处理是选择性筛选亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的过程，与检出量存在一定关系。为了探讨其中的关联性，选取不同的加热温度和加热时间分别对同一样液加热处理。具体实施方案详见表 5 和表 6：表 5 不同温度加热处理方案加热温度()加热时间(min)控制措施6510水浴锅设置至指定温度，并用温度计同期监测水浴锅内水温，保证实际加热温度满足设定要求。7075表 6 不同加热时间处理方案加热时间(min)加热温度()控制措施575水浴锅内水温达到指定温度时，放入装有接种液的试管，并用计时器计时。达到规定时间时取出试管，随即从中取液定量。10202.2 标准GB/T142722011羽绒服装2C.9.5.3亚硫酸还原的梭状芽孢杆菌的测定；GB/T102882003羽绒羽毛检验方法3附录 A.6.4亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的计数；SN/T10712002进出口食品中厌氧亚硫酸盐梭状芽孢杆菌检验方法4。2.3 材料与制备2.3.1 试验材料2.3.1.1 1%的灭菌胨水成分：1g 胰蛋白胨，8.5g 氯化钠，1000mL蒸馏水，pH 值为 7.0。2023 年第 3 期 纺织标准与质量 51将配制的溶液用（1211）高压灭菌 15min。2.3.1.2 亚硫酸铁琼脂成分：15.0g 胰蛋白胨、5.0g 大豆蛋白胨、5.0g 酵母粉、1.0g 偏重亚硫酸钠、1.0g 柠檬酸铁铵和20.0g 琼脂。称取 40.0g 置于 1L 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，用 121高压灭菌 15min。2.3.1.3 亚硫酸铁多黏菌素 B 琼脂培养基成分：15.0g 胰蛋白胨、10.0g 酵母浸粉、0.5g柠檬酸铁铵、1.0g 亚硫酸钠和 16.0g 琼脂；称取 42.5g 于 1L 蒸馏水中，加热煮沸灭菌，冷却至50左右，在每100mL基础液中加入P-36F多黏菌素 B 硫酸盐溶液（2g/支）和 P-110 硫酸锌霉素溶液（0.05mg/支）各 1 支，混匀备用。2.3.1.4 亚硫酸铁多黏菌素 B 琼脂培养基成分：15.0g 胰蛋白胨、10.0g 酵母浸粉、0.5g柠檬酸铁铵、1.0g 亚硫酸钠和 16.0g 琼脂。称取 42.5g，加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，分装，每瓶 200mL,用 121高压灭菌 15min，冷至4550时，无菌条件下加入多黏菌素 B（4g）和硫酸新霉素（100g）各 1 支，混匀备用。2.3.1.5 平板计数琼脂培养基成分：5.0g 胰蛋白胨、2.5g 酵母浸粉、1.0g葡萄糖和 15.0g 琼脂。称取 23.5g 置于 1L 蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，用 121高压灭菌 15min。2.3.2 制备试样2.3.2.1 戴消毒手套取出样品并制备试样，取两个约 12 g 的试样，分别称量精确至 0.1 g。2.3.2.2 将每个试样加入 1200mL 的 0.1%无菌胨水，以机械方式搅拌振荡 3h。2.3.2.3 在无菌条件下，将两个原始萃取液通过消毒纱布过滤后混合，制成样液。2.3.2.4 用灭菌试管采取十进制稀释法逐步稀释原始萃取液。2.4 仪器与试剂2.4.1 仪器LBX-203 型水平振荡器（绍兴力必信仪器有限公司）；GI54TW 立式压力蒸汽灭菌器（致微厦门仪器有限公司）；BHC-1300IIA2 生物安全柜（苏洁医疗器械有限公司）；SPX-250-Z 型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；干燥器。厌氧培养袋、厌氧产气包、厌氧指示条均购自日本三菱瓦斯化学株式会社公司。2.4.2 试剂胰蛋白胨、亚硫酸铁琼脂、亚硫酸铁多黏菌素B 琼脂培养基、平板计数琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；氯化钠（西陇科学股份有限公司）；亚硫酸铁多黏菌素 B 琼脂培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。2.5 步骤2.5.1 样液处理培养 分别将部分样液（按 2.3.2.3 制得）和十进制稀释液（按 2.3.2.4 制得）在水浴锅中 75加热处理10min，并将 1mL 的上述原液和十进制稀释液分别接种在盛有亚硫酸铁多黏菌素 B 琼脂的培养皿内的培养基上，并用至少 5mL 的相同培养基盖住被接种的培养基，使其在厌氧条件和（362）的温度下培养 48h。2.5.2 计数菌落数计数在不同稀释液下形成的黑点状菌落数。2.5.3 验证试验镜检为革兰氏阳性梭状芽胞杆菌，且过氧化氢酶试验阴性。2.5.4 过氧化氢酶试验方法取干净载玻片，在上面滴一滴新鲜配制的 3%过氧化氢溶液，挑取一环试验菌，在过氧化氢溶液中混匀，溶液中若有气泡产生，过氧化氢酶试验结果则为“阳性”；若无气泡产生，结果则为“阴性”。2.6 结果的计算与表示根据公式（1）计算结果：24102400CXn#=（1）式中：C每克羽绒羽毛样品中的亚硫酸还原梭状芽孢杆菌数，CFU/g；X平均每个平皿上的黑色菌落数，CFU；n原始滤液的 10 倍稀释次数；2400常数，0.1%无菌胨水的体积，单位为毫升（mL）;24常数，羽绒样品的取样量，单位为克（g）。3 结果与讨论3.1 过滤方式3.1.1 试验结果以 GB/T14272 为依据，将试验结果分为“检52 纺织标准与质量 2023 年第 3 期出”“未检出”两部分汇总分析。结果见表 7：表 7 不同过滤方式结果汇总 单位为 CFU/g样品检出未检出方案 1方案 2方案 1方案 21#6.51022.6102 1022.2102#6.51021.0102 1023#2.0102 1024#1.5102 1025#1.21031.2106#2.0102 1027#1.11033.0108#1.01039.5109#2.31035.5103.1.2 分析与讨论由表 7 可以看出，当亚硫酸还原梭状芽胞杆菌有“检出”时，方案 2 检出量明显低于方案 1，两种方式对检出量的影响较大；当亚硫酸还原梭状芽胞杆菌“未检出”时，2 种方案检出结果基本一致，1#数据偏差不影响结果判定（即两种过滤方式的试验结果均满足标准中“102”的指标要求）。以上分析表明，采用薄膜过滤再行洗脱法对于过滤是否充分、洗脱是否完全等关键环节仍缺乏有效、可行的控制措施。因此，较原液制样定量方法的结果，前者的检出量更低，数据更不稳定。因此，薄膜过滤再行洗脱法不适用于定量检测亚硫酸还原梭状芽胞杆菌。3.2 厌氧条件3.2.1 试验结果不同氧气条件下亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出情况见表 8。3.2.2 分析与讨论由表 8 可以看出，亚硫酸还原梭状芽孢杆菌属于专性厌氧菌，只有在无氧环境下才能有效生长繁殖。含氧量直接影响到亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量，从而影响检验结果的准确性。表 8 不同氧气条件下的检出情况 单位为 CFU/g样品有氧环境环境微氧无氧环境1#102 102 1022#2.71023#5.010因此，在定量检测亚硫酸还原梭状芽孢杆菌时需严格控制厌氧环境。3.3 培养基成分3.3.1 试验结果不同类型培养基对检出量的影响见表 9：表 9 不同类型培养基的影响 单位为 CFU/g样品培养基类型平板计数琼脂亚硫酸铁琼脂1#1022.01022#1023#1.01024#2.01025#3.01036#1.61037#1.51028#3.51023.3.2 分析与讨论由表 9 可以看出，亚硫酸还原梭状芽孢杆菌可以在亚硫酸铁琼脂上正常生长，但无法在平板计数琼脂中生长。这是因为，亚硫酸盐为亚硫酸还原梭状芽孢杆菌实现自身生长所必需的营养物质。由 2.3.1 可以看出，同样适用于检验亚硫酸盐梭状芽孢杆菌培养基的成分及含量并不完全一致。为探讨不同来源的同种培养基对检出量的影响，现分别选用表 4 中的 3 种培养基测试亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的含量。试验结果见表 10。由表 10 可以看出，采用 Grubbs 检验分析不同来源的同种培养基亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量的结果为 Gmax/Gmin G95（3），其中未发现离群值。表 10 不同来源的同种培养基对检出量的影响样品培养基（CFU/g）均值标准偏差GmaxGminG95（3）CM186CM197HB0304-21#8.01026.01023.5102583.33225.461.030.071.1532#9.51027.51021.2103966.67225.461.030.073#4.01025.01022.5102383.33125.831.060.134#6.01021.01034.5102683.33284.311.110.292023 年第 3 期 纺织标准与质量 53分别用 3 种不同来源的同种培养基试验结果均在平均值的二倍标准偏差范围内。故认为，以上 3 种不同来源的同种培养基对亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量的影响在允许的误差范围内。因此，亚硫酸盐为亚硫酸还原梭状芽孢杆菌实现自身生长所必需的营养物质，且适用于亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检验的不同来源的培养基对检出量的影响在允许的误差范围内。3.4 加热条件3.4.1 不同温度加热3.4.1.1 试验结果不同加热温度下亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量见图 1：图 1 不同加热温度下的检出量3.4.1.2 分析与讨论由图 1 可以看出，不同的加热温度会直接影响到亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量。其中，1#、3#、4#的加热温度为 70时的检出量最大，加热温度为 75时的检出量最小。而伴随加热温度的上升，2#和 5#的亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量呈递减趋势。这是因为，当加热温度为 75时，部分菌种由于温度过高而死亡，使检出量锐减；当加热温度为 65时，由于温度较低，菌种选择性不强，导致亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量检测数据不稳定。因此，在定量检测亚硫酸还原梭状芽孢杆菌时，需将加热温度严格控制在 75。3.4.2 不同加热时间3.4.2.1 试验结果不同加热处理时间下的亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量见图 2：图 2 不同加热处理时间下的检出量3.4.2.2 分析与讨论由图 2 可以看出，加热处理时间对亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量具有显著影响。当加热时间为 10min 时，亚硫酸还原梭状芽孢杆菌的检出量最大；而加热时间不足 10min 或超过 10min 时，检出量均呈现不同程度的下降。这是因为，当加热时间过长时，会导致部分菌种对长时间的高温环境不耐受而死亡；当加热时间不足时，对菌种的选择性筛选效果下降，从而影响检出量的稳定性。因此，在定量检测亚硫酸还原梭状芽孢杆菌时，需将加热时间严格控制在 10min。4 结论4.1 薄膜过滤法不适用于定量分析羽毛羽绒中的亚硫酸还原梭状芽孢杆菌。4.2 亚硫酸盐为亚硫酸还原梭状芽孢杆菌实现自身生长所必须的营养物质。4.3 不同来源的亚硫酸铁琼脂培养基对亚硫酸还原梭状芽孢杆菌检出量的影响在允许的误差范围内。4.4 试验过程中需严格控制厌氧条件、加热温度和加热时间，以确保检验数据的准确和稳定。参 考 文 献1 杨闯.羽绒羽毛的还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的检测J.纺织标准与质量.2007(6)45-46.2 中国纺织工业协会.羽绒服装:GB/T142722011S.北京：中国标准出版社，2012.3对外贸易经济合作部.羽绒羽毛检验方法:GB/T102882003S.北京：中国标准出版社，2004.4 国家认证认可监督管理委员会.进出口食品中厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验方法：SN/T10712002S.北京：中国标准出版社，2002.35035030050500100100501#2#3#样品编号含菌量/CFU.g-10501001502002503003504005min10min20min76210810102283280600151763723909.8141#2#3#4#5#样品编号含菌量/CFU.(0.1g)-10100200300400500600700800900657075