一种印加果籽油组合物改善皮肤屏障功效研究.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2023年8月第4期Aug.2023,No.4原料与配方51www.ffc-收稿日期：2022-12-05；修回日期：2022-12-13作 者时垠（上海）生物科技有限公司，上海 201702 胡嘉奂 樊雨梅 魏春花 李金华#廖 峰一种印加果籽油组合物改善皮肤屏障功效研究摘 要为了探究印加果籽油、神经酰胺和角鲨烷的组合物在皮肤屏障修复和保湿方面的作用，采用重组人表皮模型，通过测量跨膜电阻、测定皮肤屏障与保湿相关基因和蛋白的表达，评价组合物对皮肤屏障功能的改善和保湿效果。跨膜电阻试验结果显示，印加果籽油、神经酰胺和角鲨烷的组合物相较单独组分和双成分组合能够显著提升跨膜电阻（TER）值；相关基因和蛋白试验结果显示，组合物显著提高丝聚蛋白（FLG）、角蛋白 10（K10）、转谷氨酰胺酶（TGM）和紧密连接蛋白（CLD）的 mRNA 和 FLG 蛋白的表达，显著提升水通道蛋白 3（AQP3）的 mRNA 表达水平，优于单独组分和双成分组合。所以，印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物具有改善皮肤屏障和保湿的效果。关键词印加果籽油 神经酰胺 皮肤屏障 保湿 重组人表皮模型Function of Plukenetia Volubilis Seed Oil Composite on Skin BarrierHU Jiahuan FAN Yumei WEI Chunhua LI Jinhua#LIAO Feng(Shin Biotechnology Co.,Ltd.,Shanghai 201702,China)Abstract:To investigate the effects of the combination of Plukenetia volubilis seed oil,ceramides and squalane on skin barrier repair and moisturization,a recombinant human epidermal model was used to measure transepithelial resistance(TER)and the expression of genes and proteins related to skin barrier and moisturizing were detected.The repair and moisturizing effects of the combination on skin barrier function were evaluated.The results of TER showed that the combination of Plukenetia volubilis seed oil,ceramide and squalane could significantly improve the TER value.The results of expression of genes and proteins showed the combination of Plukenetia volubilis seed oil,ceramide and squalane can significantly increase the expression of FLG,K10,TGM,CLD mRNA and FLG protein,as well as the expression of AQP3 mRNA,which was better than individual component and two-ingredient combinations.As a result,the combination of Plukenetia volubilis seed oil,ceramide and squalane has the effect of improving the skin barrier and moisturizing.Keywords:Plukenetia volubilis seed oil ceramides skin barrier moisturize recombinant human epidermal model皮肤是人体和环境之间一道重要的屏障，能够保护机体内环境稳态并抵御有害因素侵袭。皮肤屏障受损不仅会导致皮肤干燥、瘙痒和易过敏，还与许多皮肤疾病密切相关 1。表皮脂质是构成皮肤物理性屏障结构的重要组分，表皮脂质的组成和结构对于维持皮肤屏障功能非常重要。据报道，原料与配方胡嘉奂，等作 者 简 介胡嘉奂（1991），男，硕士，工程师，主要从事化妆品配方研发。#通信作者：李金华（1962），男，博士，主要从事化妆品原料开发、化妆品配方技术及研发、亚洲消费者皮肤研究。联系电话：[phone]E-mail:lijinhua_DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0286原料与配方2023 年 8 月香料香精化妆品52www.ffc-皮肤脂质分泌过程，主要组成成分的结构、含量和比例的变化均会影响皮肤屏障功能 2。添加适当的神经酰胺、脂肪酸、胆固醇或皮肤脂质的混合物均可修护皮肤屏障功能 3-5。Sator 等 6发现，皮肤屏障损伤对皮肤水脂膜有显著的影响。也有研究证实，在急性皮肤屏障损伤后，几种源自皮脂成分及其氧化产物的化合物发生了改变，包括角鲨烷、角鲨烯、辛醛和壬醛 7。然而，大多数研究关注细胞间脂质对皮肤屏障的修复作用，很少考察细胞间脂质与皮脂膜脂质结合物对皮肤屏障的修复效果。神经酰胺是细胞间脂质的主要成分之一，神经酰胺合成和代谢异常与多种皮肤病密切相关，添加神经酰胺的护肤品已被用于多种皮肤疾病的辅助治疗 8。印加果籽油含有丰富的 omega 3 和omega 6 脂肪酸，常被用于皮肤护理，能够修复伤口和治疗感染 9。角鲨烷是角鲨烯氢化后的一种烃类油脂，具有良好的稳定性，是最接近人体皮脂的一种脂类，能够很好地渗透皮肤和滋润皮肤。因此，构建一种包含细胞间脂质和皮脂膜的组合物，应用重组人表皮模型，检测角质形成细胞跨膜电阻，研究皮肤屏障与保湿相关基因和蛋白的表达，研究神经酰胺、印加果籽油与角鲨烷组合物对皮肤屏障功能的影响，旨在为神经酰胺、印加果籽油与角鲨烷的组合物应用于改善表皮屏障提供一定的理论依据。1 试验材料1.1 细胞原代人角质形成细胞（NHEK），广东博溪生物科技有限公司。1.2 主要试剂神经酰胺 NP（批号：E821201886），赢创特种化学(上海)有限公司；印加果籽油（批号：II210807-AI-D-BIO），法国 Greentech 公司；角鲨烷（批号：DHG2021042801），宜春大海龟生命科学有限公司；Epilife 培养基、人角质形成细胞生长添加剂（HKGS）、成纤维细胞生长因子 7（FGF7）、乙二胺四乙酸（EDTA）、Trizol 裂解液、插入式培养 皿（Transwell）、AQP3 Rabbit/IgG 抗 体、FLG Rabbit/IgG 抗体、Goat anti-Rabbit HRP，赛默飞世尔(中国)有限公司；CellnTec 3D 培养基，瑞士CellnTec 公司；引物，生工生物（上海）有限公司；cDNA 反转录试剂，天根生物科技（北京）有限公司；荧光定量试剂（SYBR），瑞士 Roche 公司。1.3 主要仪器设备1300 型 生 物 安 全 柜、Il60 型 CO2培 养 箱、EVOS FL 型荧光倒置显微镜、Qubit3 型荧光定量仪、自动化细胞计数器，赛默飞世尔（中国）有限公司；EVOM2 型跨膜电阻仪，美国 WPI 公司；Light Cycler 96 型荧光定量 PCR 仪，瑞士 Roche公司；冷冻切片机，德国 Lecia 公司；组织研磨低温均质仪，天根生物科技（北京）有限公司。2 试验方法2.1 样品制备按照表 1 的配制所需组合物母液，均用二甲基亚砜（DMSO）进行溶解配制。1 号样品为空白对照组，2 8 号样本为试验组。1 8 号组合物按照体积分数 1%加入 Epilife 培养基中，每组重复3 次，加样结束后在培养箱（37 、体积分数 5%CO2）中培养 24 h，供后续试验使用。表 1 分组与样品信息组别样品编号样品质量分数空白对照组1/试验组24%角鲨烷30.5%印加果籽油44%角鲨烷+0.5%印加果籽油50.1%神经酰胺64%角鲨烷+0.1%神经酰胺70.5%印加果籽油+0.1%神经酰胺84%角鲨烷+0.5%印加果籽油+0.1%神经酰胺2.2 NHEK 细胞体外培养NHEK 细胞使用 Epilife 完全培养基（500 mL Epilife+5 mL HKGS），在 体 积 分 数 5%CO2、37 的条件下培养，每 2 天更换 1 次培养基，细胞达到 70%左右的密度后使用质量分数 0.25%胰酶/EDTA 消化 5 min，中和离心计数。2.3 重组人表皮的模型的构建CellnTec 3D 培 养 基 和 插 入 式 培 养 皿（Transwell）建立重组人表皮模型。前期使用完全Epilife 培养基和 140 mol/L Ca2+，根据标准方法使用 I 型胶原蛋白铺底插入式培养皿并将细胞按照8105/cm2的密度接种于 Transwell 中，上下均加入 0.5 mL Epilife 完全培养基。培养 48 h 后，上下第 4 期原料与配方胡嘉奂，等：一种印加果籽油组合物改善皮肤屏障功效研究53www.ffc-室更换为 CellnTec 3D 培养基，继续孵育 24 h 后抽取上室内培养基，建立气液培养，继续培养 14 天后进行后续试验，每隔 2 天换 1 次液。2.4 跨膜电阻测量EVOM2 用来测量经皮跨膜电阻值（trans-epithelial electrical resistance value，TER）。STX2电极用体积分数 75%乙醇消毒，移除 Transwell 下方的培养基，转移到新孔板中，上下加入适量的磷酸盐缓冲液 PBS，将 STX2 电极插入 Transwell中并且长电极结构接触到孔板底部，功能开关调节到欧姆档，读数并记录，同一个表皮不同位置测量 3 次。跨膜电阻提升率（transmembrane resistivity，TR）采用式（1）进行计算。100%TRTTTTconcontesttest1010#=-（1）式中，Ttest1，表示试验组加样后的 TER；Ttest0，表示试验组加样前的 TER；Tcon1，表示空白对照组加样后的 TER；Tcon0，表示空白对照组加样前的TER。2.5 RNA 提取和实时荧光定量(qPCR)将 重 组 人 表 皮 从 Transwell 切 下 来，放 入Trizol 中，使用组织研磨低温均质仪将样本破碎，按照 Trizol 标准操作流程提取 RNA，使用超微量分光光度计（NanoPhotometer）测量 260、280 mm 处的吸光度，使用 Qubit3.0 进行定量。将定量后的 RNA 使用 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA并 用 DNA Green Master 和 Light Cycler 96 型 荧光定量 PCR 仪检测阈值循环数（cycle threshold，CT）值。表 2 中列出了 qPCR 所需要的引物。使用 CT 阈值法进行相关数据分析，并将每个基因的相对表达水平使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化处理并进行计算。表 2 引物序列基因正向序列反向序列AQP3GGGGAGATGCTCCACATCCAAAGGCCAGGTTGATGGTGAGCLDN1CCTCCTGGGAGTGATAGCAATGGCAACTAAAATAGCCAGACCTHAS1GAGCCTCTTCGCGTACCTGCCTCCTGGTAGGCGGAGATK10TGATGTGAATGTGGAAATGAATGCGTAGTCAGTTCCTTGCTCTTTTCAFLGGCAAGGTCAAGTCCAGGAGACCCTCGGTTTCCACTGTCTCTGM1GCACCACACAGACGAGTATGAGGTGATGCGATCAGAGGATTCGAPDHGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG2.6 免疫荧光将重组人表皮切下后泡在质量分数 4%多聚甲醛中固定 30 min，使用冷冻切片机切片，按照免疫荧光常规流程固定，通透，封闭，孵育一抗（AQP3和 FLG）、二 抗（Goat anti-Mouse IgG 488）,荧光显微镜下进行拍照，采集图片使用 ImageJ 软件分 析。2.7 数据统计和分析所有数据以平均值 标准差（MeanSD）表示，数据统计使用 Origin 8 实现，荧光强度使用ImageJ 计算，试验组间显著性分析使用单因素方差分析，=0.05，*表示 P 0.01，*表示 P 0.05。3 结果与讨论3.1 组合物对 TER 值的影响皮肤表面的角质层可起到保护皮肤屏障的作用，当皮肤屏障损伤时，会增加皮肤通透性，导致电阻值降低。因此，可以通过检测TER值的改变，来判断皮肤屏障的完整度。不同组合物的跨膜电阻值提升率见图 1。图 1 不同组合物对 TER 的影响情况15372648*跨膜电阻提升率/%150100500样品编号单独加入角鲨烷，重组皮肤模型的 TER 值下降，可能与角鲨烷的促渗效果有关。Momoko 等 10的研究证实，角鲨烷作为甘油油酸酯的载油剂，原料与配方2023 年 8 月香料香精化妆品54www.ffc-图 2 组合物对基因表达的影响15372648*相对表达倍数43210样品编号（a）FLG15372648*相对表达倍数543210样品编号（c）TGM10210110010 115372648*相对表达倍数样品编号（b）K1015372648*相对表达倍数6420样品编号（e）AQP315372648*相对表达倍数 43210样品编号（d）CLD15372648*相对表达倍数43210样品编号（f）HAS1在稳定状态下能使烟酰胺的皮肤渗透性提高25倍。单独加入印加果籽油，重组表皮模型的 TER 值下降。这与 Kandimalla 等 11的报道一致。不饱和脂肪酸的经皮水分流失与大鼠皮肤的渗透增强存在正相关。不饱和脂肪酸能够增强皮肤渗透，可能与不饱和脂肪酸在角质层脂质中形成单独的区域、有效减少扩散路径的长度或阻力有关。同时，单独添加神经酰胺并没有提升重组皮肤模型的 TER值。Choi 等 12也发现，与基础膏霜相比，添加神经酰胺 NP（质量分数 0.5%）的膏霜并不能显著提升人体角质层的完整性。由图 1 可知，印加果籽油联合神经酰胺能够提升 TER 值，这与 Nojiri 等 13和 Lim 等 3的报道一致。这可能与神经酰胺和脂肪酸相互作用后导致采用正交组织排列的脂类比例增高有关 14。与印加果籽油联合神经酰胺的组合物相比，角鲨烷+印加果籽油+神经酰胺的组合物能够显著提升TER 值（P 0.05），跨膜电阻提升率为 15.72%，体现了角鲨烷、印加果籽油和神经酰胺在屏障改善的协同效果，这可能与角鲨烷能进一步促进脂类的正交组织排列相关。3.2 组合物对皮肤屏障和保湿基因表达的影响表皮分化需要高度协调以建立具有必要机械、化学和渗透稳定性的皮肤屏障，角蛋白 10（keratin 10，K10）15、丝聚蛋白（filaggrin，FLG）、转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGM）16、紧密连接蛋白 Claudin 家族蛋白 17等都参与了表皮分化及其屏障功能的稳定。因此为明确各组合物对皮肤屏障的修复效果，探究了不同组合物对皮肤屏障和保湿相关基因表达的影响，结果见图 2。FLG 在表皮细胞终末分化、皮肤屏障构建等过程中发挥着重要的作用。由图 2（a）可知，不同含量的印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物均能够显著提升 FLG mRNA 的表达水平，约2.6 2.9 倍（P 0.05）。说明，印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物可通过促进 FLG 的表达，加快角化套膜的形成，从而稳定表皮屏障结构。然而，单独使用神经酰胺并不能提升 FLG mRNA的表达。这与 Choi 等 12的报道一致，神经酰胺 3不会影响 FLG 的表达。角蛋白是表皮细胞的纤维状结构蛋白，角蛋白细胞骨架的完整性是物理性皮肤屏障的基础，K10 是角蛋白家族的代表性蛋白。图 2（b）显示，使用不同含量的印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物后，与空白对照组相比，K10 mRNA 的表达提升了约 100 倍，提示印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物能够修复皮肤屏障功能。TGM 在有棘层表达，催化末端分化蛋白如兜第 4 期原料与配方胡嘉奂，等：一种印加果籽油组合物改善皮肤屏障功效研究55www.ffc-甲蛋白、内披蛋白和 FLG 等交联形成不溶于水的角质膜结构，这种膜结构能够有效地包裹角蛋白从而构成完整的皮肤屏障。图 2（c）中，与空白对照组相比，各组合物均能够有效提升 TGM mRNA的表达，且印加果籽油与神经酰胺的组合物的提升效果显著高于单独使用印加果籽油和神经酰胺（P 0.01）。但是，添加角鲨烷后，组合物对 TGM mRNA表达的提升效果有所下降，但无显著性差异，仍高于各自单独使用的效果。说明，印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物可通过提升 TGM 加快角质套膜的形成，稳定皮肤的角质层屏障结构。紧密连接蛋白中的 Claudin 家族蛋白对于皮肤细胞屏障的渗透特异性和物质跨膜运动起着重要作用。如图 2（d）所示，与空白对照组相比，各组合物均能够有效提升 CLD mRNA 的表达，与姚骐羽等 18的报道一致，亚油酸能够刺激角质形成细胞 CLD-1 的表达。水通道蛋白 3（aquaporin 3，AQP3）是一种双向转运甘油、尿素和水的通道，还能起到一些蛋白质的修复屏障的协同作用。图 2（e）显示，角鲨烷联合神经酰胺、印加果籽油+神经酰胺和印加果籽油+神经酰胺+角鲨烷的组合物均显著提升了 AQP3 mRNA 的表达水平，然而三者联合的提升效果却低于角鲨烷+神经酰胺或印加果籽油+神经酰胺组合物的效果。透明质酸是角质形成细胞外基质的重要成分，具有保水、润滑和调节细胞内外渗透压等功能。透明质酸主要有透明质酸合成酶（hyaluronic acid synthetase）合 成，分 为 HAS1、HAS2 和 HAS3。图 2（f）显示，印加果籽油+神经酰胺的组合物能够显著提升 HAS1 mRNA 的表达（P 0.01），提升了 3.5 倍。这与 Lim 等 3的报道一致。然而，角鲨烷+印加果籽油+神经酰胺的组合物却不能显著提升 HAS1 mRNA 的表达（P 0.05）。3.3 组合物对皮肤屏障和保湿相关蛋白表达的影 响AQP3 对皮肤外观和生理机能有着重要的影响，并且受到多种因素如湿度、皮肤屏障、炎症和小分子物质等的影响。皮肤屏障破损会使皮肤保湿能力下降。AQP3 的表达量与表皮中的位置有关，主要表达于基底层和有棘层，颗粒层较少，角质层几乎没有，具有一定的空间层次 20。AQP3免疫荧光的结果与Yao等 20的一致。图3结果显示，角鲨烷+神经酰胺的组合物和印加果籽油+神经酰胺的组合物均显著性提升了 AQP3 的蛋白表达（P 0.05），与 AQP3 mRNA 表达的结果相一致。然而，与空白对照组相比，印加果籽油+神经酰胺+角鲨烷的组合物能够提升 AQP3 的蛋白表达水平，但是不具有统计学意义。图 3 AQP3 和 FLG 蛋白平均荧光强度表达1155337722664488荧光强度荧光强度1 5001 000500 08006004002000样品编号样品编号（a）AQP3（b）FLGFLG 基因编码丝聚蛋白原，丝聚蛋白原是一种大分子的非水溶性蛋白，在表皮的颗粒层中形成，是丝聚蛋白的重复单元组成，在不断分化过程中丝聚蛋白原在角质层中磷酸化并水解成相对分子质量为 3.7104的丝聚蛋白。在图 4 中，FLG 免疫荧光的结果与 Jia 等 21的描述一致。图4 显示印加果籽油+神经酰胺+角鲨烷的组合物能够显著地提升角质层中 FLG 蛋白的表达水平（P 0.01），优于印加果籽油、神经酰胺和角鲨烷单独使用的效果。4 结论选择印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物，探究组合物对皮肤屏障的改善和保湿效果。跨膜电阻结果表明印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物能够显著提升 TER 值。qPCR 和免疫荧光试验结果显示组合物能显著提高屏障修复相原料与配方2023 年 8 月香料香精化妆品56www.ffc-www.ffc-关基因 FLG、K10、TGM、CLD mRNA 的表达和FLG 蛋白的表达，改善皮肤的角质层屏障结构。组合物也能显著提升 AQP3 和 HAS1 的表达，具有保湿的效果。这为印加果籽油、神经酰胺与角鲨烷的组合物在化妆品保湿和改善皮肤屏障方面提供了理论基础。参考文献番晓清,何黎.皮肤屏障受损与相关性皮肤病的研究进展 J.1 皮肤病与性病,2021,43(6):741-743.SMEDEN J V,JANSSENS M,GOORIS G S,2 et al.The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function J.Biochimica et Biophysica Acta,2014,1841(3):295-313.LIM S H,KIM E J,LEE C H,3 et al.A lipid mixture enriched by ceramide np with fatty acids of diverse chain lengths contributes to restore the skin barrier function impaired by topical corticosteroid J.Skin Pharmacology and Physiology,2022,35(2):112-123.KENDALL A C,KIEZEL-TSUGUNOVA M,BROWNBRIDGE 4 L C,et al.Lipid functions in skin:differential effects of n-3 polyunsaturated fatty acids on cutaneous ceramides,in a human skin organ culture model J.Biochimica et Biophysica Acta,2017,1859(9):1679-1689.KIRCIK L H,ROSSO J Q D,AVERSA D.Evaluating clinical 5 use of a ceramide-dominant,physiologic lipid-based topical emulsion for atopic dermatitis J.The Journal of Clinical and Aesthetic 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