9-电泳和电色谱.pptx

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极 作定向移动的现象称为电泳。显然带电粒子的大小，形状，所带的静电荷多少以及介质的,pH,，粒子强度粘度等都会影 响粒子的电泳速度,从电泳现象可以获得胶粒或大分子的结 构，大小和形状等有关信息。,电泳的基本原理,带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为,电泳,。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的,pH,及其组成。,由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。,在电场中，推动带电质点运动的力（,F,）等于质点所带净电荷量（,Q,）与电场强度（,X,）的乘积。,F,QX,质点的前移同样要受到阻力（,f,）的影响，对于一个球形质点，服从,Stoke,定律，即：,f,6 r,（,r,为质点半径，,为介质粘滞系数，,为质点移动速度）,当质点在电场中作稳定运动时：,F,f,即：,QX,6r,迁移率,u,：单位电场强度下的电泳速度，,粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。,u,v/E=q/6r,v=QX/6r,在具体实验中，移动速度,V,为单位时间,t,（单位为,s,）内移动的距离,d,（单位为,cm,），即,V,d/t,。电场强度,X,为单位距离,L,（单位为,cm,）内电势差,E,（单位为伏特），即,X,E/L,。将这两个公式代入上述公式，得到,U=v/X=dL/Et d=u*Et/L,由此可以得到两种物质移动距离的差为,d=(d,A,-d,B,)=(u,A,-u,B,)Et/L,从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。,影 响 因 素,1.,待分离大分子的性质,：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快,2.,缓冲液,pH,和离子强度,：,pH,值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是,pH,过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持,PH,恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为,0.02-0.2,之间。,3.,电场强度,：,过高,，产热，样品和,Buffer,扩散增加，条带增宽；蛋白变性。,过低,，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置,4.,电渗：,在 电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。,5.,支持介质的筛孔：,筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大,分 类,按,支持介质,的不同可分为：纸电泳（,Paper electrophorisis,）醋酸纤维薄膜电泳（,Cellulose Acetate electrophoresis,）琼脂凝胶电泳（,Agar Gel electrophoresis,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,Polyacrylamide Gel electrophoresis,）（,PAGE,）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS,PAGE,）。,按,支持介质形状,不同可分为：,薄层电泳；,板电泳；,柱电泳,分类,区带电泳,不同的离子在均一的缓冲液体系中分离形成独立的区带。,等速电泳,区带相随分成清晰的界面，等速移动。,等电聚焦,影响因素,电荷，电场强度（强，快），溶液,pH,，离子强度（高，慢），电渗现象（区别分析），支持物（均匀，吸附力小），温度（高，快，扩散也快）,Electrophoresis,(,电泳,)Nucleic acids,DNA&RNA,的分离,琼脂糖凝胶电泳,EB(,溴化乙啶,),或,Goldenview,染色,蛋白质分离,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(SDS-PAGE),考马斯亮蓝染色,蛋白质电泳,生物大分子及细胞分离纯化：研制了连续自由流电泳仪，在神舟四号飞船上我国首次成功地进行了空间生物大分子分离纯化实验，取得了完整的工程参数和科学实验数据。科学实验结果分析表明牛血红蛋白,(Hb),和细胞色素,C(Cyt.C),两峰值距离，比地面提高约,38%,，说明在微重力条件下比地面分离得好，有明显优势；,Hb,条带比地面窄；尖峰高度比地面高,2.65%,，表明样品扩散小，分辨率高。,区带电泳,区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。,区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（,PAGE,）和琼脂糖凝胶。,蛋白质分离,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）,原理,:,分子筛,(,区别于过滤的分子筛,)+,电荷效应,聚丙烯酰胺凝胶的优点：,1.,样品不易扩散；,2.,控制凝胶浓度形成不同孔径；,3.,不产生电渗，化学惰性；,4.,制成的多聚物再现性高，重现性好；,5.,机械强度好，,6.,需要设备简单，时间短。,SDS,与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。,SDS-,蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，,它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的,SDS,复合物的短轴长度都一样（约为,18,，即,1.8nm,），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化,。,这样的,SDS-,蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。,由于,SDS,和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。,在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和扩张强度都有所增加，并形成,SDS,蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近,1,：,20,时孔径达到最小值。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为,1,：,29,配制，试验表明它能分离大小相差只有,3%,的蛋白质。,凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图,(A,为正面,B,为剖面,),(1),样品胶,pH6.7 (2),浓缩胶,pH6.7 (3),分离胶,pH8.9 (4),电极缓冲液,pH8.3,凝胶浓度的计算,聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数,T,和,C,，,T,是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。,C,是与,T,有关的交联百分浓度。,T,与,C,的计算公式是：,上式中,a,为丙烯酰胺的克数，,b,为甲叉双丙烯酰胺的克数，,m,为水或缓冲液体积（,ml,）。式中,a,与,b,的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，,a,与,b,的重量比应在,30,左右。,）,实验过程,1.,将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备,2,个干净的锥形瓶,.2.,把玻璃板在灌胶支架上固定好,.,固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板,.,3.,按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约,5,厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置,40,分钟,.,凝胶配制过程要迅速,催化剂,TEMED,要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶,.,注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡,.,水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气,凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面,.,4.,倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘,5mm,处,迅速插入样梳,静置,40,分钟,.,样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平,.,5,.,在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳,。,要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果,.,实验过程,6,、,加样,（,1,）,取,10l,标准蛋白溶解液于,EP,管内，再加入,10l 2,倍样品缓冲液，上样量为,10l,。,（,2,）,取,10l,样品溶液，再加入,10l 2,倍样品缓冲液，上样量分别为,5l,和,3l,。,7.,用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热,3,分钟，去掉亚稳态聚合。,注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散,.,为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样,8.,电泳槽中加入缓冲液,，,接通电源，进行电泳,，开始电流恒定在,10mA,，当进入分离胶后改为,20mA,，溴酚蓝距凝胶边缘约,5mm,时，停止电泳。,9.,凝胶板剥离,与,染色,：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色,1,小时左右。,10.,脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,11.,胶的干燥与保存,The gels are first soaked in,30%Methanol/,10%Glycerol,solution for 30 minutes.It is carefully removed and sandwiched between a double layer of,gel drying membrane,on the,drying frame,(keep drying overnight).,Gel Drying:30%Methanol/10%Glycerol.,Gel drying membrane,Gel drying frame.,异常现象的可能原因及解决方案,凝胶未聚合,单体纯度不够，需重结晶；,溶解氧抑制，去除；,过硫酸铵失效或量少,聚合速度太快,加催化剂前冷却凝胶溶液,减少过硫酸铵的用量,异常现象的可能原因及解决方案,电泳后未检测出样品,样品量少,染色,加样操作失误如样品浮出,分离胶浓度（高，未进入；低，已跑出）,降解酶降解,注意事项,1.,不是所有的蛋白质都能用,SDS-,凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白,F1,，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的,SDS,，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是,21,000,，但,SDS-,凝胶电泳测定的结果却是,35,000,。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。,2,有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如,-,胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在,SDS,和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，,SDS-,凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与,SDS-,凝胶电泳的结果互相参照。,连续凝胶电泳和不连续凝胶电泳,连续电泳体系中缓冲液,pH,值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,不连续系统中由于缓冲液离子成分，,pH,，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,等速电泳,电荷分离方法（分子电荷差别）,仅适用于同种电荷分离,样品离子最初在不同的速率下迁移，直到他们按照各自的有效迁移率，分离成不同的区带。,这时，由于通过系统的电流强度达到相同，在每条区带中的离子的速率将减慢，也就是说，所有区带在相同的速度下迁移，即为等速电泳。,通过分布，形成稳定的状态。在每条区带中，电位强度是常数，但各区带之间界面处是逐级变化的，因此可以用任何区带中的电场强度来确定已知物系的存在，取代的宽度可用于确定存在的相对量。,等电聚焦,等电聚焦电泳,不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分离。,蛋白质具有许多可解离的酸性基团（,COOH,）和碱性基团（,NH2,）及其它基团,在一定溶液的,pH,条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一,pH,时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的,pH,称为蛋白质的等电点。,NH,3,+,+OH,NH,3,+,+OH,NH,2,P P P,COOH,H,COO,H,COO,蛋白质的阳离子 蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子,两性电解质的种类,(1)Ampholine(,瑞典,LKB),安福灵,它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的,pH,范围,2.5-4.5,，,4-6.5,，,5-8,，,3.5-9.5.,(2)Servalyte(,德国,Serva,公司,),它是在,由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合,并蒸馏得到的多胺混合物中,再,引入磺酸基团或磷酸基团,合成的,.pH,范围,:2-4,3-5,、,4-6,、,5-7,、,6-8,、,7-9,、,9-11,、,2-11,、,3-10.,(3)Pharmalyte(,瑞典,Pharmacia),七氨基多羧基组成的,pH,范围,:2.5-5,4-5.5,5-8,8-10,3-10,等,(4),载体两性电解质,(,军事医学科学院,),合成的方式与,Ampholine,基本相同,.pH,范围,:3-9.5,3.5-5.5,4.0-6.0,5.0-7.0,6.0-9.0,7.0-10.0,等电聚焦电泳（,IFE,）,利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个,pH,梯度。,每种蛋白质都将迁移至与它的,pI,相一致的,pH,处。,凝胶中加有两性电解质溶液（,pH9-3,）,加电场后在凝胶内形成一个稳定,pH,梯度,加样品，然后继续电泳,凝胶染色表明样品按照各自,pI,值沿着,pH,梯度分布,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,高,pH,高,pH,低,pH,低,pH,操作步骤及注意要点,凝胶配制：,a,取,10 0.5cm,内径的玻璃管，从一端量出,7cm,作好标记，用橡皮片封底（,用两条橡皮圈扎紧,），垂直放置。,b,按实验指导,page 17,配制凝胶液（,按顺序，每加一种试剂后都要轻轻充分摇匀，,TEMED,最后才加入，加入摇匀后要立即灌胶,），用长滴管吸取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至,7 ml,标记平面，缓缓注入，,避免产生气泡,。,c,立即用,5ml,注射器配针头注入约,0.5cm,高的蒸馏水，垂直放置（,将长滴管及时清洗,）,注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。,电 泳,将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，,注意不要漏液,。上槽注入,5%H,3,PO,4,，,下槽注入,2%NaOH,，,检查凝胶管上下口内有无气泡,，如有必须排除。,上槽接正极,，,下槽接负极,，,50V,预电泳,30min,，然后将电压维持在,250 V,，电泳,2,小时,。,剥 胶,用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与水之间，使针头慢慢螺旋前进。靠水流压力将胶与玻璃管分开，最后可用吸耳球在一端轻轻施压，将其取下。,测 量 样 品,pI,直接用,pH,试纸插入所需测定的蛋白区带中测量,问题及可能原因,1,.,蛋白带的拖尾和纹理现象,样品溶解不好，有沉淀,加样器或加样滤纸片在凝胶上放置时间太长,样品分子量大，慢慢进入并堵塞凝胶,样品放置时间太长或已变性,2.,蛋白带偏斜,凝胶形状不规则,阴阳电极条长度不一致,阴阳电极条放置不平行,操作过程,蛋白带不细窄,小分子蛋白未被凝胶稳定住,聚焦时间不够,聚焦后没有及时或充分固定,在碱性侧可能由于,pH,梯度的原因,“,一种,”,蛋白质聚焦成几条带,蛋白质分子被解聚、被水解或形成复合物,样品在准备、保存或电泳期间被氧化,样品在含尿素时发生氨基甲酰化作用,主要影响因素,pH,梯度（范围、不稳定性）,蛋白质样品（等电点沉淀、蛋白质的不均一性）,其他影响因素,温度对等电点的影响,CO,2,对等电点的影响（碱性溶液）,蔗糖（降低介质的介电常数，改变氨基的解离常数，进而影响,pI,）,载体电解质,蛋白质自身性质（构象变化、聚合等）,二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（,2DPAGE,）,二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。,这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。,双向电泳,第一向,：,等电聚焦电泳,第二向,：,SDS-PAGE,双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：,水平方向反映出蛋白在,pI,上的差异，,垂直方向反映出它们在分子量上的差别,。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在,SDS,凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：,SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH3,pH9,pH,3,第一维电泳是等电聚焦，在细管中（,1,3 mm,）中加入含有两性电解质、,8M,的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有,SDS,的缓冲液处理,30 min,，使,SDS,与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。,在第二维电泳过程中，结合,SDS,的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入,SDS,聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。,细胞提取液的二维电泳可以分辨出,1000,2000,个蛋白质，有些报道可以分辨出,5000,10000,个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。例如将某个蛋白质的,mRNA,转入到青蛙的卵母细胞中，通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较，转入,mRNA,的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点，这样就可以直接检测,mRNA,的翻译结果。,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N,端测序,肽序列质谱数据,肽指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,双向电泳分析中的样品制备,制备原则,：,应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。,防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。,防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。,完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。,尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,第一向 等电聚焦电泳,蛋白质二维电泳,第二向,SDS-PAGE,2-D Electrophoresis,of,E.coli,proteomic,More than 1000 proteins,could be identified,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,二维电泳,二维电泳的处理量也很小；,蛋白质组学研究的重要工具。,蛋白质二维电泳,蛋白质二维电泳,Densitometer(Visible),Laser(Fluorescence),CCD Camera(Multiple Stain Technologies),蛋白质二维电泳,电泳,electrophoresis,是指溶液中带电粒子在电场作用下发生迁移的电动现象。,毛细管电泳,capillary electrophoresis,是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。,毛细管电色谱,可以分离离子和中性分子。它是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。,毛细管电泳,毛细管电泳的基本原理,电泳分离的基础,=,e,E,为离子移动的速度,e,为电泳迁移率,E,为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。,离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离,。,电荷,-,尺寸,只有一个相！,毛细管电泳,1,离子移动的速率,=,e,E=,e,U/L,U,是毛细管柱两端施加的压力,L,是毛细管柱总长。采用高电压可以达到使离子迅速移动和快速分离。,2,毛细管电泳中的板高,N,=,e,U/2D,由于分离度随塔板数的增加而增加，因此为了获得高的分离度应采用高电压。,在凝胶板形电泳中，一般最高使用的电压约为,500 V,。在毛细管电泳中，一般可采用,20,000,60,000 V,的高电压。,3,电渗流,在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。,在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，离子的洗脱顺序是,:,首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。,毛细管电泳装置,一般在一根长,40,100 cm,内径,10 100,m,的毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。在两个缓冲池之间的毛细管接有两个铂电极。试样从一端进入，而检测器则在另一端。使用的高电压可以反相，以能分析阴离子。,一般的进样方式是,电动进样,和,压力进样,。,电动进样,是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。,压力进样,是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空，或者通过提高试样端液面。,毛细管电泳的分离模式与应用,细管区带电泳,capillary zone electrophoresis,CZE,毛细管凝胶电泳,capillary gel electrophoresis,CGE,毛细管等速电泳,capillary isota-chophoresis,CITP,毛细管等电聚焦,capillary isoelectric focus,CIEF,细管区带电泳,是基于试样中各个组分间荷质比的差异进行分离的。这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通过时，缓冲溶液中的阴，阳离子分别以一特定的速度分别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按各自的恒定速度移动，形成背景电解质离子流动中伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁移率差别很大，就能将不同离子分离。,毛细管区带电泳可以分离小离子，而且能分离那些衍生化或反应生成离子的物质，如抗炎药物，氨基酸，蛋白质等物质。,毛细管凝胶电泳,是将生物大分子如蛋白质，,DNA,片断，按相对分子质量大小进行分离的一种分离方法。,毛细管凝胶电泳一般是在多孔的凝胶基质上进行，如聚酰胺聚合物。在凝胶的孔穴中含有缓冲混合物，分离是在穴中进行。最常用的凝胶是在交联剂的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取决于单体与交联剂的比例，增加交联剂的量可以得到小孔穴凝胶。,毛细管等速电泳,是基于试样中各组分电泳迁移率的差异而进行分离的。在等速电泳中试样是引入在两种不同的电解质之间，其中一种是迁移率较高的前导离子电解质溶液,另一种是迁移率较低的尾随离子电解质溶液。当加上电场后，由于各种离子迁移率不同，向正极迁移的速度不同，故电解质溶液将形成由负极到正极增加的离子浓度梯度，而电位梯度与电导率呈反比，故低浓度离子区即低电导区有较高的电位梯度。因此点泳池内电解质溶液的电位梯度有正极向负极增加。由于离子的迁移速度与电场强度呈正比，随着电泳的进行，离子进入等速状态，此时形成紧紧相邻而又彼此完全分离的单组分区带。,特 点,瑞典化学家,Tiselius,建立了,“移界电泳”，成功地将人血清中的蛋白质分为,5,个主要成分，为蛋白质化学的发展奠定了基础。,诺贝尔奖,优点,:,操作简单，试样量少，分离效率高，成本低等。,在迁移时间上的重现性，进样的准确性和检测灵敏度方面比高效液相色谱法稍逊。,毛细管等电聚焦,是基于不同蛋白质或多肽之间等电点,pH,的差异进行分离。分子中既有酸性基团又有碱性基团的两性物质，如蛋白质，有一个等电点,pI,即电荷为零时的,pH,。当溶液中的,pH,正好是两性物质的等电点时，它们在电场中不移动。高于此,pH,时，它们失去质子带负电荷，在电场作用下向正极移动 低于此,pH,时，移向负极。若在毛细管柱中置一,pH,梯度缓冲溶液，从一端向另一端递增。当两性物质，如蛋白质进入毛细管柱置于高于它的,pI,的地方，它就带负电荷，趋向正极 而朝这个方向,pH,逐渐变小，最后达到,pH,等于它的,pI,值的部位，此时净电荷为零，速度也为零。,通过等电点聚焦，将试样中不同物质浓缩在不同的等电点处，从而达到分离的目的。,毛细管电色谱,填充柱毛细管电色谱。,基于填充柱的电色谱是各种电泳中最新出现的一种技术。它是利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。,胶束电动毛细管色谱。,是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。该方法也可用来改善带电有机化合物的分离选择性。,毛细管电动色谱的优点,像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。,像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离,通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。明显地简化了输送体系。,电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。,毛细管电色谱,CEC:,以电渗流驱动流动相，,开管和填充两种,比高效液相色谱具有更高的柱效,高效毛细管电泳仪器（,1,）,高效毛细管电泳仪器（,2,）,高效毛细管电泳仪器（,3,）,一、高效毛细管电泳基本原理,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。,1.,经典电泳分离法的不足,所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于,HPLC,），温度影响大,。,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。,2.,高效毛细管电泳技术上的重要突破,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：,一是采用了,0.05mm,内径的毛细管,；,二是采用了高达数千伏的电压。,毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。,电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，,高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块,/,米，特殊柱子可以达到数百万。,3.,电泳现象与电渗流现象,电泳现象,：,带电离子在电场作用下的迁移，速度,电泳,电渗流现象,：,玻璃表面存在硅羟基,pH3,时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度,电渗流,。,4.,分离过程,电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度,=,电泳和电渗流两种速度的矢量和。,正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；,中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；,阴离子：两种效应的运动方向相反，,电渗流,电泳,时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,5.,分离类型,八种分离类型,(1),毛细管区带电泳（,CZE,）,最普遍、最基本的一种分离模式。,(,2),毛细管凝胶电泳（,CGE,）,将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、,DNA,等。,(3),毛细管胶束电动色谱（,MECC,）,在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且,电渗流,电泳,，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围,。,二、仪器装置,电压：,0,30KV,。,分离柱不涂敷任何固定液，,紫外或激光诱导荧光检测器,（可检测到：,10,-19,10,-21,mol/L,）,三、影响柱效的因素及改进方法,热效应：,焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于,200,微安，一般几十微安。,电渗流控制,：,电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。,使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加,NaCl,和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂,则可以改变电渗流的方向。,四、主要特点和应用,高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。,高灵敏度：可检测出低至,10,-21,mol/L,浓度的物质。,高分析速度：可在,3,分钟内分离,30,种阴离子；,1.7,分钟分离,19,种阳离子,;4,分钟可分离,10,种蛋白质,.,试样用量少：仅需几,nL,（,10,-9,L,）的试样,仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。,不足之处：,进样不够方便。应用范围相对较窄。,分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。,逆向作用色谱电泳,counteracting chromatographic electrophoresis,，,CACE,连续逆向色谱电泳结合了凝胶电泳的高分辨率和液相色谱的大处理能力，成为一种新型高效的蛋白质分离与纯化方法。,CACE,在,O,Farrell 1981,年提出之后已进行了大量的理论与实验研究，研究工作主要集中在间歇操作过程。,I,区凝胶颗粒内孔隙度小，蛋白质能渗入的体积小，为排阻区；,II,区凝胶颗粒内孔隙度大，蛋白质能渗入的体积大，为渗入区。,蛋白质随载液流过分离柱时，,I,区内流速大于,II,区内流速。调节直流电场强度，使目标蛋白质逆向电泳速度介于两区流速之间，目标蛋白质就在两区交界面处富集，交界面处蛋白质浓度增加，导致平衡离子浓度增加，电导增加，电场强度下降，电泳速度下降，使目标蛋白质运动速度为零，结果加入分离柱内的目标蛋白质富集在交界面，并随加入量的增加向,II,区发展,.,为实现连续操作和满足在线检测的需要，在分离柱中设置不含凝胶的富集区，使目标蛋白质在此区域内连续富集,.,把图,1,中的交界面沿轴向扩展,(,图,2),成为不含凝胶的富集区,(A,区,),，,A,区内流速小于,I,区、,II,区内流速,.,在,I,区，目标蛋白质流速大于电泳速度而向,A,区运动,;,在,II,区，目标蛋白质流速小于电泳速度，也向,A,区运动，因而目标蛋白质向,A,区积累。,在,A,区电泳速度大于流速，并随着浓度增加而逐渐下降，最后电场与流场达到逆向动态平衡，目标蛋白质在,A,区连续富集,.,高效毛细管电泳,应用与进展,一、,离子分析,analysis of ion,阳离子分析,迁移方向和电渗流方向一致；,4.5min,内分离了,24,种金属离子；,阳极进样，阴极检测；,具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；,质量小、电荷密度大的离子如：,SO,4,-2,、,Cl,-,、,F,-,等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；,加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在,3.1min,内分离,36,种阴离子；阴极进样，阳极检测；,离子价态及存在形态分析；,二、药物分析,analysis of pharmaceutics,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；,尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；,采用毛细管区带电泳方式，在,11min,内分离,17,种药物；,采用,MEKC,模式，鉴定违禁药物；效果优于,HPLG,法,胶束电动力学色谱,三、手性化合物分析,analysis of chiral compounds,合成获得单一手性化合物相当困难；,528,种手性合成药物，,61,种以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；,R-,反应停是安眠药，,S-,式致胎儿畸形；,HPCE,分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；,形成配合物的稳定常数有差异，结合,HPCE,的高效率；,常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）,四、氨基酸与蛋白质分析,analysis of amino acids,采用,MEKC,模式，在,25,分钟内分离了,23,种丹酰化氨基酸；,HPCE,可取代传统的氨基酸分析仪；,问题：吸附和检测；,蛋白质分析,五、核酸分析及,DNA,排序,analysis of nucleic acids and sequence,of DNA,重要分析手段；,图，酶解的双螺旋,DNA,限制性片段的分离；,六、新进展,advances and special topics,1.,微型化,整体化学分析系统（,TAS,）及,TAS,微型化,在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管,，,理论塔板数,10,5,/m,；,2.,联用仪器,CE-MS,；,3.,阵列毛细管凝胶电泳,应用于人类基因,DNA,测序；,5,10,万个基因，,30,亿个碱基对，目前最有效的,DNA,序列分析仪，,10,小时,/,次；可同时电泳,24,个样品；速度,1200,碱基对,/,小时，提高速度！,100,支毛细管阵列电泳；速度,280,碱基对,/,小时,/,支,20,世纪,30,40,年代,蒂塞利乌斯,(,A.,W.K.,Tiselius,）,建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术,获得,1948,年诺贝尔化学奖,1981,年,J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs,实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。,上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。,