霉菌毒素检验案例.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,课后复习,抗生素类分类：四环素类、,氯霉素类、,磺胺类药物、硝基呋喃类,CAPs,是禁止用于食品动物并不得在动物性食品中检出的抗生素。,盐酸克伦特罗毒性,第九章 食品中真菌毒素检验,9.1,概述,9.2,黄曲霉毒素的检验,9.3,赭曲霉毒素,A,的检验,9.4,展青霉素的检验,9.5,脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验,9.6,T-2,毒素的检验,9.7,玉米赤霉烯酮的,检验,第一节 概述,1.1,霉菌及霉菌毒素,1.2,霉菌毒素的命名及分类,1.3,霉菌毒素的产生条件,1.4,毒性与危害,1.1,霉菌及霉菌毒素,霉菌（,fungi,）：是菌丝体比较发达而又没有较大子实体的一部分真菌的通称。,霉菌毒素,（,Mycotoxin,）：,指少数霉菌在污染食品上繁殖所产生的有毒代谢产物，它对人、牲畜引起损害。,霉菌产毒的特点,1,）霉菌中仅少数菌种能够产毒，少数,产毒 霉菌只有一部分菌株可以产毒。,2,）霉菌产毒具有,可变性,3),产毒的菌种所产生的霉菌毒素,无,严,格专一性,4,）产毒霉菌产生毒素,需一定条件,。,常见霉菌和霉菌毒素名称,曲霉菌属,：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、,杂色曲霉毒素,青霉菌属,：黄绿青霉素、展青霉素、黄天,精、桔青霉毒素,镰刀菌属,：单端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸内酯、串珠镰刀菌毒素,1.2,霉菌毒素的命名及分类,霉菌毒素的命名常按产生毒素的霉菌名称来确定,霉菌毒素的分类尚无统一的系统命名方法，常用的分类法是按毒素作用部位分为肝脏毒素、肾脏毒素、神经毒素等；按毒素来源分为霉菌毒素类、青霉毒素类、镰刀菌毒素类；按作用机理分为抑制蛋白质合成类、作用于离子通道类、作用于细胞骨架类、作用于细胞突触类；按毒素化学结构分为二呋喃类、内酯环类、醌类。,1.3,霉菌毒素的产生条件,霉菌毒素产生过程：是霉菌的次级代谢产物。在生长后期，初级代谢产物：如三羧酸循环的中间产物乙酰辅酶,A,、丙酮酸等大量堆积，使其启动另外合成途径。,产生条件：,水分、,pH,值、环境温度、湿度及氧气等因素。粮食水分在,17,18,、湿度在,80,90,、温度在,25,30,及有氧条件、中性附件处有利于霉菌的繁殖。,1.3,霉菌毒素的产生条件,食品菌相：共存于食品中的细菌种类和相对数量的构成。,如：粮谷中以曲霉和青霉常见，小麦和玉米以镰刀菌污染为主。因此，通过对食品霉菌菌相的分析，大致可判断可能产生的毒素种类。,黄曲霉毒素：玉米、花生等,青霉菌毒素：大米、水果等,镰刀菌及毒素：小米、玉米等,霉菌污染食品质量的评定及食品卫生意义,1),霉菌菌相构成,田野霉：新鲜，交链孢酶素,曲霉、青霉,:,可检毒素，但不表示变质,毛霉、根霉：粮食霉变,2),霉菌的污染度,：即单位重量或容积的食品或,100,粒粮食上霉菌总数，表示食品带染霉菌情况。,1.4,毒性与危害,霉菌引起食品和饲料霉变造成的经济损失很大，据介绍，世界上平均每年由于霉变而不能食用的各类谷物约占总量的,2,。,60,年代以来，不断发现霉菌污染食品引起中毒的事件，研究其原因是由于不少霉菌的代谢产物为有毒物质。,1960,年英国的,10,万只火鸡发生肝损害而死亡，后来证实是饲料中黄曲霉菌的代谢产物黄曲霉毒素所致。,可引起急性中毒，更多是慢性中毒。致癌、致畸和致突变的物质。特别是黄曲霉毒素。,第二节 黄曲霉毒素的检验,2.1,概述,2.2,薄层色谱法,2.3,酶联免疫吸附测定法,2.4,高效液相色谱测定法,2.5,微柱筛选法,2.1,概述,理化性质：结构，黄曲霉毒素（,aflatoxins,AFT,）是含有二呋喃环和香豆素（氧杂萘邻酮）一类化合物的总称；溶解性，难溶于水、乙醚、,石油醚、己烷,等，易溶于,甲醇、三氯甲烷、苯、乙腈,等极性较小的有机溶剂；稳定性，对光稳定，一般烹调加工温度不被破坏，中性和弱酸性条件下稳定，碱性条件下易分解为无毒物质；对氧化剂不稳定。,天然食品中常检出,AFTB,1,、,AFTB,2,、,AFTG,1,、,AFTG,2,、,AFTM,1,。,从结构上看,，可把它们分成两大类：即,B,族和,G,族，从,B,族和,G,族又派生出许多衍生物。所谓,B,族和,G,族的来源是在研究,AFT,初期，用氧化铝板作薄层板，在紫外光照射下，,可观察到一些物质发蓝色荧光,(blue),，称为,B,族；另一些物质发绿色荧光,(green),称为,G,族。,主要来源：主要是黄曲霉,（,Aspergillus flavus,部分产毒）,、寄生曲霉,(Aspergillus parasitlas,所有菌株产毒,),等代谢产物。,AFT,主要污染粮油及其制品，如,花生、花生油、玉米,、大米、棉子等。此外，在核桃、乳及乳制品、干辣椒中也有发现,AFT,的污染。,常检出,AFTB,1,，奶和奶制品中易检出,AFTM,1,。,在我国，产生黄曲霉毒素的菌种主要是黄曲霉，一般湿热地区产毒株多、产毒量大。,黄曲霉菌丝状菌落,毒性与危害：,是一类毒性很大的物质，对动物能造成急性中毒，其毒性是氰化钾,10,倍；,还能引起慢性中毒和致癌、致畸、致突变。其慢性中毒的主要表现是动物生长发生障碍，肝脏出现亚急性或慢性损伤,AFT,是目前发现的最强的化学致癌物质。比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大,75,倍，所以，世界卫生组织,(WHO),在确定重点研究的毒物中，,AFT,被列在首位,。其作用部位主要是肝脏。,AFTB,1,在动物体内经羟化反应生成两种主要代谢产物,AFTM,1,和,AFTQ,。前者与,AFTB,1,的毒性和致癌性近似。,牛饲料、牛奶。,名称,LD,50,倍数,AFB,1,0.335,1,666,300,1360,DDT,200,630,CDT,59,201,As,2,O,3,30,63,KCN,3,10,AFB,1,与其它毒物的,LD,50,慢性毒性,A,肝组织学变化：肝细胞变性，坏死，再生结节，肝管上皮增生及肝纤维化、肝硬化,B,肝功能变化：血清转氨酶，,ATP,，碱性磷酸酶,球蛋白升高,C,其它症状：生长发育迟缓，体重下降，食物利用率降低，母畜不育或产仔,少等,。,性别,AFB,1,饲料,ppm,喂饲时间,平均周数,肝癌发病率,雄,1,41,18/22,雌,1,64,4/4,雄,0.3,52,6/20,雌,0.3,70,11/11,雄,0.015,68,12/12,雌,0.015,82,13/13,AFB,1,对大鼠致癌性,AFT,对人类毒性,A,人体细胞体外试验：抑制细胞分裂、,DNA,合 成、染色体破碎,B,人类急性中毒：非洲、印度、中国等均有,摄入,AFT,污染食品中毒报道,2005,年,5,月肯尼亚,7,人食用,AFT,污染玉米中毒死亡,C,人类肝癌流行病学：,AFT,污染程度与人群肝癌发病率死亡率正相关,；,AFT,增加乙肝患者肝癌发病率,国家,地区,AFTB,1,摄入量,（,ng/Kg,体重,/,日,原发性,病例数,肝癌,发病率（,1/10,万人年）,肯尼亚,高地势区,3.5,4,1.2,泰国,Songkhla,5.0,2,2.0,斯威士兰,高原,5.1,11,2.2,肯尼亚,中地势区,5.9,33,2.5,斯威士兰,温暖草原,8.9,29,3.8,肯尼亚,低地势区,10.0,49,4.0,斯威士兰,Lebombo,15.4,4,4.3,泰国,Rntburi,45.0,6,6.0,斯威士兰,低温草原,43.1,42,9.2,莫桑比克,Inhamba,222.4,462,13,黄曲霉毒素摄入量与原发性肝癌发病率,卫生标准：污染食品的主要是,AFTB,1,、,B,2,、,G,l,、,G,2,、,M,1,等，其中尤以,AFTB,1,最为重要。世界卫生组织的粮农组织,(FA0,WHO),规定食品中,AFTB,1,不得超,15ppb,；美国不得超过,25ppb,；日本规定不得超过,10ppb,；以色列和瑞典规定不得检出。我国对各种主要食品中,AFT B,1,允许含量是：玉米、花生仁、花生油及其制品不得超过,20ppb,；大米和其他食用油不得超过,10ppb,；其他粮食、豆类、发酵食品不得超过,5ppb,；婴儿代乳品不得检出。,预防措施,去毒：,挑选霉粒,物理方法,:,碾轧加工法,加水搓洗,吸附法,化学方法：,加碱处理法,二甲基乙醚去油脂中的,AFB,1,新方法：,高压破坏、臭氧、微生物去毒,二、霉菌毒素的检测,黄曲霉毒素的检测,我国涉及黄曲霉毒素的限量及检测的国家标准有,GB 27611981(,食品中黄曲霉毒素,B,1,允许量标准,),、,GB 9676-1988(,牛乳及其制品中黄曲霉毒索,M,，限量卫生标准,),、,GB,T 17480-1998(,酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素,B1),、,GB,T 5009,22-1996,薄层色谱法,(,第一法,),ELISA(,第二法,),测定食品中黄曲霉毒素,B,，,GB,T 5009,231996,薄层色谱法,(,第一法,),微柱筛选法,(,第二法,),测定食品中黄曲霉毒素,B,1,、,B,2,、,G,1,、,G,2,2.2,薄层色谱法,原理：样品中,AFTB,1,经,甲醇,-,水溶液提取后，浓缩、苯,-,乙腈溶液定容、点样于硅胶,G,薄层板上，经展开分离后，在波长,365nm,紫外光下观察,蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的强度于标准比较来确定含量。,样品处理：样品经正己烷或,石油醚,和,甲醇,-,水溶液,（,55,45,）振荡提取，样品中油脂、色素等杂质进入正己烷层，而,AFTB,1,和水溶性杂质留在甲醇,-,水层。用,三氯甲烷,反提取甲醇,-,水层，由于,AFTB,1,更易溶于三氯甲烷层，从而进入三氯甲烷层，杂质留在水层。将三氯甲烷层通过盛有,无水硫酸钠,的慢速定量滤纸过滤于蒸发皿中，水浴通风挥干，冷却后用苯,-,乙腈（,98,2,）混合液溶解残渣，作点样液。,定性测定：将样液与标准液点样，用丙酮,-,三氯甲烷（,8,92,）展开，晾干在,365nm,紫外光下观察，若在,R,f,值,0.6,附近有蓝紫色荧光点，可能有。然后在点样处滴加三氟乙酸，则,AFTB,1,水解成,AFTB,2a,，极性增大，,R,f,值由,0.6,降为,0.1,。,定量测定：以最低检出限量,0.0004,g,为标准。,双向展开法：先用无水乙醚作横向展开，将干扰的杂质展至样液点外而,AFTB,1,不动，然后再纵向展开。,2.3,酶联免疫吸附测定法,原理：,将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分及,游离的抗原抗体复合物,，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。,样品处理：粉碎均匀样品用乙腈,-,水（,50,50,）（碳酸盐缓冲液,pH,至,8.0,）进行提取，滤纸过滤，滤液用含,0.1,牛血清白蛋白（,BSA,）的洗液稀释后，供,检测。,测定：用包被抗原（,AFTB,1,和牛血清白蛋白结合物）包被酶标微孔板，,4,过夜。用洗液洗去酶标微孔板多余抗原后，加入毒素标准溶液或样品提取液，然后再加入,AFTB,1,抗单克隆抗体，,37,孵育。多余抗体用洗液洗去，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠,IgG,，,37,孵育。再次洗涤酶标微孔板，加底物四甲基联苯胺溶液，,37,孵育后用硫酸中止反应。,方法说明：最低检出限浓度为,0.01ppb,；,ELISA,试剂盒低温保存。,包被固相载体,:,用已知抗原包被,固相载体,加待检标本,:,使相应抗体与固相抗原结合,洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体,:,与固相载体上抗原抗体,复合物结合；洗涤，除去,未结合的酶标抗抗体,加底物,显色,根据颜色反应的程度进行,该抗原的定性或定量测定,饲料中盐酸克伦特罗的测定,饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，,赭,曲霉毒素）,饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）,甲胺磷残留分析,甲基对硫磷残留分析,呋喃丹残留分析,ELISA,在饲料安全检测中的应用,ELISA,用于农药残留的检测,河豚毒素,植物毒素如罌粟碱、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类,例如杀暝松（,FN,）、,甲氟磷酸异已酶（,SOMAN,）、,草不绿（,Alachor,）、,西维因（,Carbaryl,）、,多菌灵及克菌丹（,Captan,）等。,农药的检测,：,2.4,高效液相色谱测定法,原理：样品中的黄曲霉毒素经,C18,柱分离，用带荧光检测器的,HPLC,检测，时间定性面积定量。,样品处理：（,1,）样品提取，适量样品加水浸润后加入,三氯甲烷,振摇提取，加无水硫酸钠滤纸过滤于量筒中。（,2,）样品净化和衍生化反应，将少量提取液通过,多功能净化柱,层析管，用三氯甲烷,-,正己烷、三氯甲烷,-,甲醇淋洗液洗除杂质，用丙酮,-,水洗脱，水浴挥干用三氯甲烷溶解残渣，取部分溶液加入正己烷、三氟乙酸（,TFA,）混匀静置,30min,，使,AFTB,1,衍生为,AFTB,2a,。氮气吹干，加入少量流动相溶解供,HPLC,测定。,方法说明：,提取时也可使用水溶性有机溶剂，如乙腈,-,水（,9,1,）或甲醇,-,水（,8,2,）。,本法流动相含有磷酸盐，用完后应用去离子水彻底冲洗，再用甲醇冲洗，以保护色谱柱。流动相也可用不含盐的组分如乙腈,-,甲醇,-,水（,50,150,300,）。,衍生化的目的是确证样品中是否含有,AFTB,1,二、免疫亲和层析,-,高效液相色谱法,原理：试样用甲醇,-,水提取后，用,免疫亲和层析柱,净化，以水或含吐温,-20,的磷酸盐缓冲液洗柱除去杂质，再用甲醇洗脱交联在柱上的黄曲霉毒素，洗脱液经高效液相色谱分离，柱后衍生后，荧光检测器检测，标准曲线法定量,2.5,微柱筛选法,原理：样品经提取后通过装有氧化铝、硅镁吸附剂的微柱管，,AFT,被吸附后在,365nm,下显示蓝紫色光环，其荧光强度与,AFT,在一定浓度范围成正比。,样品处理：磨细混匀样品用甲醇水振荡提取过滤，再加三氯甲烷反萃取，无水硫酸钠脱水即样品提取液。,测定方法：三支管中分别加入样品、标准品和三氯甲烷。加展开剂（,1,9,）后照射。若出现微黄色荧光环，则未检出,AFT,，若出现蓝紫色荧光则进一步分析。,方法说明：所测结果为,AFT,总含量；吸附剂应活化；柱管要保持垂直；洗脱废液要密闭。,由于,AFT,是一剧毒且强致癌性物质，使用时应特别小心应按以下规定进行实验操作和实验后的清洗消毒工作。,实验时应戴口罩；配标准溶液时戴手术手套。,若衣服被污染，需用,5,次氯酸钠溶液浸泡,15 30,分钟再用清水洗净。,对于剩余的,AFT,标液或阳性样液，应先用,5,次氯酸钠处理后方可倒到指定的地方。,实验中所用的或被污染的玻璃器皿需经,5,次氯酸钠溶液浸泡,5,分钟再清洗之。,实验完毕应用,5,次氯酸钠清洗消毒实验台等。,万一皮肤被污染，可用次氯酸钠溶液搓洗，再用肥皂水洗净。,第三节 赭曲霉毒素,A,的检验,3.1,概述,3.2,薄层色谱法,3.1,概述,理化性质：赭曲霉毒素（,ochratoxin,）是由曲霉菌和青霉属的几个种属产生的有毒代谢产物。基本结构是异香豆素连接到,-,苯丙氨酸上的衍生物，有,A,、,B,、,C,、,D,四种化合物。其中赭曲霉毒素,A,（,OTA,）最重要。,OTB,没有氯元素，,OTC,是,A,的乙酯，,OTD,是,4-,羟基,A,。,OTA,酸性条件下溶于苯、三氯甲烷和稀碳酸氢钠溶液，加碱成盐，其盐溶于水。,主要来源：寒冷条件下由纯绿青霉产生，温暖气候下由赭曲霉产生。谷物、大豆和香辛料，特别是红辣椒易受污染。动物饲料优甚。,与人体健康关系：存在于动物的肾、肝、肌肉和血液中，猪是最敏感的动物，肾是主要靶器官。,1956,年巴尔干地方性肾病。,特定的癌症基因变异，,p53,龙胆泻肝汤（丸），原药方以木通入药，至,1983,年因木通资源短缺，中国大陆地方标准便以关木通代替木通。关木通是马兜铃科草药，含马兜铃酸，,2003,年底 。,卫生标准：食品中没有限量标准。,分析方法：,薄层色谱法,、,HPLC,、,ELISA,。,3.2,薄层色谱法,原理：用三氯甲烷,-,磷酸（,0.1mol/L,）或石油醚,-,甲醇,/,水提取样品中,OTA,，净化浓缩后薄板展开，根据样品在紫外光灯下，,OTA,标准点相应处产生黄绿色荧光的强度，与标准比较确定含量。,样品处理：样品用三氯甲烷和,0.1mol/L,磷酸提取，,OTA,在酸性条件下进入有机相，过滤加碳酸氢钠溶液碱化，,OTA,进入水相分离后碳酸氢钠水层用稀盐酸溶液调节,pH2-3,，用三氯甲烷振摇提取分层后，挥干三氯甲烷加入苯,-,乙腈（,98,2,）溶解残渣，供,TLC,用。,测定方法：滴加标准、样品、样品标准三个点。先用横展剂乙醚或乙醚,-,甲醇,-,水（,94,5,1,），将薄层板纵展,2-3cm,，此时,OTA,不动而杂质向前移动。取出挥干，再将该薄层板靠近标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂进行横展，使杂质偏离点样点，与,OTA,分离，避免了杂质荧光的干扰。然后将经横展后的薄层板纵展，纵展剂为甲苯,-,乙酸乙酯,-,甲酸,-,水（,6,3,1.2,0.06,）或甲苯,-,乙酸乙酯,-,甲酸（,6,3,1.4,），苯,-,冰乙酸（,9,1,）。,365nm,下紫外观察，若与标准点处有荧光点则估计稀释倍数，再点样。同时做确证实验。,确证实验：用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒薄层色谱板，干燥于长波紫外灯下观察，这时,OTA,荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加。,方法说明：点样量若超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留的溶剂在横展中可将,OTA,点横向拉长，可根据荧光强度于标准对比，估计减少的加样体积或所需稀释的倍数；,OTA,标准液应用黑纸遮光；最低检出限为,10ppb,。,第四节 展青霉素的检验,4.1,概述,4.2,双向薄层扫描测定法,4.1,概述,理化性质：展青霉素（,patulin,）为无色结晶，,70-100,可,升华,，分子式,C,7,H,6,O,4,，溶于水和乙醇。在碱性溶液中很不稳定，酸性溶液中较稳定，,耐热,。,展青霉素（,Patulin,Pat),OH,结构,O,O O,展青霉素（,Patulin,Pat),毒性,3.,毒性作用,(1),急性和亚急性毒性,啮齿类动物的急性毒性中毒：痉挛、肺出血、皮下组织水肿、无尿，死亡。,(2),致癌、致畸和致突变性,皮下注射部位引起雄性大白鼠发生局部肉瘤，经口服的实验动物未发现致癌现象。,Pat,对大鼠和小鼠没有致畸作用，但对鸡胚有明显的致畸作用。,展青霉素（,Patulin,Pat),毒性,(3),细胞毒性：,Pat,能改变细胞膜的通透性，更利于,K,+,外流。,(4),对免疫系统的影响：亚致死剂量的,Pat,对小鼠和兔的免疫系统均有影响，,Pat,的免疫抑制作用是可逆的而且,Pat,对免疫球蛋白水平 的影响具有时间依赖性,。,展青霉素的污染,食品中的主要来源：是由荨麻青素、扩张青素和棒曲霉等霉菌代谢产生的，存在于腐烂水果及果汁制品中。,品 种,指标,(g/Kg),半成品（原汁、原酱）,100,原汁、果酱,50,果酒,50,罐头,50,山楂条（饼）,50,苹果和山楂制品中展青霉素限量卫生标准,4.2,双向薄层扫描测定法,原理：用乙酸乙酯提取果汁，用,1.5,碳酸钠净化样品。经双向薄层展开分离后，用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。,样品处理：鲜果、果酱加适量无水硫酸钠研磨吸收多余水分，加乙酸乙酯震荡提取过滤，滤液加稀碳酸钠振摇去杂质，乙酸乙酯在水浴上真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷定容供,TLC,用。果汁、果酒直接提取。,测定：在薄板上滴加标准液、样品液。在样品点同一垂直线上距顶端,2cm,处点标准液，作为位置参考点。先用横展剂三氯甲烷,-,丙酮横向展开后再用甲苯,-,乙酸乙酯,-,甲酸纵向展开，,254nm,下观察，若在,R,f,0.35,处有黑色斑点需做确证实验。将,薄板喷,3-,甲基，,2-,苯并噻唑酮腙盐酸溶液,，,135,烘烤,15min,，,360nm,下观察，呈橙黄色斑点即可确认。稀释后点样使其在线性范围内，双向展开后进行扫描定量。,最低检出限,3,g/L,。,图,3.9 -(1,3)-D-,葡聚糖水解产物的层析,水解产物与标准葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖溶液对照进行薄板层析，展开剂为正丁醇：无水乙醇（酸）：水,4:1:5,（,V/V,，上层液），以苯胺邻苯二甲酸为显色剂，得到右图。,镰刀菌毒素,1.,单端孢霉烯族类,（,T-2,毒素、脱氧雪腐镰孢菌烯醇等）,2.,玉米赤霉烯酮类,3.,丁烯酸内酯,4.,串珠镰刀菌素,单端孢霉烯族化合物,1,）主要产毒菌株：镰刀菌属,2,）结构与性质,基本结构：倍半萜烯,毒性化学结构：,C,12,，,C,13,环氧基,3,）性质：稳定、烹调过程不易破坏,碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性。,单端孢霉烯族化合物种类与毒性,种类：,40,余种,毒性作用：,共同特点表现为较强的,细胞毒性,、免疫抑制及致畸作用，部分有较弱的致癌性，,急性毒性强,，可致人与动物的呕吐。,第五节 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验,5.1,概述,5.2,脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法,5.3,酶联免疫吸附测定法,5.4,薄层色谱法（同时测定）,5.1,概述,理化性质：镰刀菌属产生的有毒代谢产物主要是单端孢霉素类，只含有,C,、,H,、,O,三种元素。谷物种天然污染的有,A,、,B,两型，,12,、,13,碳原子上形成的环氧基可能为毒性的化学基础。,脱氧雪腐镰刀菌烯醇（,deoxynivalenol,，,DON,）和雪腐镰刀菌烯醇（,nivalenol,，,NIV,）属,B,型结构式，,DON,的结构式中,R,1,为,-OH,，,R,2,为,-H,，,R,3,、,R,4,为,-OH,。分子式为,C,15,H,20,O,6,，,NIV,分子式为,C,15,H,20,O,7,，溶于甲醇、乙醇和水。,主要来源：主要是雪腐镰刀菌污染谷物和饲料的代谢产物。,毒性与危害：主要为细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌。人中毒后易呕吐，又称呕吐毒素（,vomitoxin,）。,NIV,在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比,DON,强。,卫生标准：我国建议人食用谷物中,DON,1mg/kg,。,分析方法：我国规定标准为,TLC,和免疫测定法，其他有,GC,、,HPLC,和微柱法。,品种,指标,(g/Kg),小麦,1000,面粉,1000,玉米,1000,玉米粉,1000,小麦、面粉、玉米及玉米粉中,DON,限量标准,5.2,免疫亲和层析净化,-,高效液相色谱法,原理：样品中的,DON,经聚乙二醇提取后，滤液过免疫亲和层析柱净化，用高效液相色谱紫外检测器检测，标准曲线法定量。,5.3,脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法,原理：谷物及其制品中的,DON,经提取、净化、浓缩后经硅胶展开，加热薄板。由于有三氯化铝因此在,365nm,紫外光下显蓝色荧光，与标准比较。,样品处理：,提取,，准确称取粉碎样品加三氯甲烷,-,无水乙醇（,8,2,）提取，过滤后水浴挥干；,净化,，石油醚溶解残渣转入分液漏斗再用甲醇,-,水（,4,1,）分次洗涤，转入同一漏斗振摇，,DON,留在甲醇,-,水层，油脂进入石油醚层，将甲醇,-,水层加入装有氧化铝和活性炭的层析柱再用甲醇,-,水（,4,1,）洗脱；,浓缩,，洗脱液水浴挥干趁热加入乙酸乙酯加热至沸腾，将残渣中,DON,溶出，冷却后转入浓缩瓶浓缩定容。,测定方法：在硅胶板上点样液，同时在板上端与样品点相对位置上点一个标准点作为定位参考，用乙醚,-,丙酮（,95,5,）或无水乙醚横展使,DON,偏离原点，挥干后再点上,2,个等量标准点，其中一个加上样液。用纵展开剂三氯甲烷,-,丙酮,-,异丙醇（,8,1,1,）或三氯甲烷,-,丙酮,-,异丙醇,-,水（,75,10,15,1,）展开。晾干后,365nm,下观察，干扰点显蓝紫色荧光,DON,无荧光。将薄板,130,加热后冷却，再观察，,DON,和干扰点均有荧光且斑点明显分开。,横展后,DON,移动,0.7-1.0cm,。,5.4,酶联免疫吸附测定法,原理：将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。,样品处理：同,5.2,，浓缩瓶,95,水浴挥干，用,pH7.4,含,20,甲醇的碳酸盐缓冲液定容，供检测。,测定方法：同,2.3,，用酶标仪在波长,450nm,下测,A,值。,5.5,薄层色谱法（同时测定）,原理：,同,5.3,样品处理：,提取，准确称取粉碎样品用甲醇,-,水（,96,4,）提取,2,次过滤。加石油醚洗涤取甲醇,-,水层，水浴浓缩；净化，浓缩液加水稀释后加入,XAD-4,树脂，蒸馏水淋洗，用甲醇分次洗提毒素，水浴挥干用甲醇溶解,测定方法：取,2,块板同,5.2,处理。,DON,用乙醚横展,NIV,用三氯甲烷,-,丙酮,-,异丙醇,-,水（,4,2.5,3.5,0.6,）横展。再分别用三氯甲烷,-,丙酮,-,异丙醇（,8,1,1,）展开,DON,，用三氯甲烷,-,丙酮,-,异丙醇,-,水（,3,2.5,4.5,1.2,）展开,NIV,。,第六节,T-2,毒素的检验,6.1,概述,6.2,酶联免疫吸附测定法（间接法）,6.1,概述,理化性质,：,T-2,毒素（,T-2 toxin,）属单端孢霉烯族化合物中的,A,型化合物，难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯。,T-2,毒素的三甲硅衍生物具有强的特征质量碎片，可采用,GC-,质谱联用。,主要来源：三线镰刀菌和拟枝孢镰刀菌代谢产物。小麦、玉米、大麦和燕麦等。,毒性与危害：严重可引起死亡。,卫生标准：我国小麦、玉米及制品低于,1000ppb,。,分析方法：,ELISA,、,TLC,、,GC,等。,T-2,毒素,6.2,酶联免疫吸附测定法（间接法）,原理：,同,2.3,或,5.3,样品处理：同,5.3,测定：同,5.3,第七节 玉米赤霉烯酮的,检验,7.1,概述,7.2,分析方法,7.1,概述,理化性质：玉米赤霉烯酮,（,zearalenone,，,ZEN,），又称,F-2,毒素，,ZEN,白色结晶，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈，不溶于水、二硫化碳，短波紫外光下呈绿色荧光。对热稳定。,毒性与危害：类雌激素有毒物质。,卫生标准：我国未制定。,分析方法：,TLC,、,GC,、,ELISA,、,HPLC,等。,主要来源：镰刀菌，污染玉米、小麦、大麦、燕麦、小 米、芝麻、干草和青贮饲料等。,7.2,免疫亲和层析净化,-,高效液相色谱法,原理：试样中玉米赤霉烯酮用乙腈和氯化钾溶液提取，提取液经,ZEN,免疫亲和层析柱净化，甲醇洗脱后进样，高效液相色谱分离，荧光检测器检测，标准曲线法定量。,样品处理：提取，试样用乙腈 提取，溶液经滤纸、玻璃纤维滤纸过滤,。,净化、洗脱、测定。,7.3,分析方法,原理：试样中玉米赤霉烯酮用乙腈和氯化钾溶液提取，经异辛烷脱酯、无水硫酸钠脱水、浓缩至干。残渣三氯甲烷溶解，溶液经硅胶柱净化，薄板分离，用薄层扫描仪测定。,样品处理：提取，试样用乙腈和,4,氯化钾提取，滤液加异辛烷洗涤，乙腈层经无水硫酸钠脱水浓缩，用少量三氯甲烷溶解残留物；净化，将溶液加入硅胶柱中用三氯甲烷,-,丙酮,（,8,2,）洗脱，水浴浓缩。,测定：取等量标样和样品液在硅胶板上点样，展开剂三氯甲烷,-,丙酮,-,乙酸,-,水（,18,2,8,1,），薄层色谱扫描仪进行测定。,课后复习,食品菌相,天然食品中常检出,AFTB,1,、,AFTB,2,、,AFTG,1,、,AFTG,2,、,FATM,1,，,按照结构分为,B,族、,G,族；毒性。,酶联免疫吸附测定原理,NIV,在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比,DON,强。,分光光度法测海带中碘含量,原理：在碱性条件下灰化，海带中碘生成碘化物，在酸性条件下碘化物可被重铬酸钾氧化，析出游离碘，游离碘在三氯甲烷中呈紫红色，于,510nm,波长,下，测定吸光度值，以标准曲线法定量。,1.,样品处理,准确称取切碎的均匀海带试样,0.20-0.3g,，移入瓷坩埚中，加入,10mol/L KOH,溶液,1ml,，置于电炉上炭化，然后置,600,高温炉灰化,45min,，取出放至室温。以,40ml,水分数次洗涤坩埚内容物，将洗涤液一并转入漏斗中。,2.,加样测定,漏斗编号,1,2,3,4,5,6,7,水 （,ml,）,40,38,36,34,32,30,0,碘标准溶液,（,ml,）,0,2,4,6,8,10,0,KOH,（,ml,）,1,1,1,1,1,1,0,H,2,SO,4,（,ml,）,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,K,2,Cr,2,O,7,（,ml,）,10,10,10,10,10,10,10,CHCl,3,（,ml,）,10,10,10,10,10,10,10,721,型分光光度计,TU,1810,型分光光度计,752,型分光光度计,752,型分光光度计,五、,752,紫外,-,可见分光光度计操作步骤,1,通电开机预热,30min,。,2,调整合适的波长。,3,开机后自动显示在,T,位置，,开盖调,0,，若不为,0,则按,0,键；然后关,闭盖调,100,，若不为,100,则按,0A/100,键；调整,A/T/C/F,键至,Abs,处调,0,，若不为,0,则按,0A/100,键调,0,。,4,测样。,人有了知识，就会具备各种分析能力，,明辨是非的能力。,所以我们要勤恳读书，广泛阅读，,古人说“书中自有黄金屋。,”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，,培养逻辑思维能力；,通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，,培养文学情趣；,通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。,有许多书籍还能培养我们的道德情操，,给我们巨大的精神力量，,鼓舞我们前进,。,