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分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达

第一节 基因操作概述 2
一、聚合酶链式反应(PCR) 2
二、质粒概述 4
三、凝胶电泳 5
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 6
五、重组质粒的连接 7
六、限制性内切酶消化 7
七、SDS-PAGE蛋白质电泳 7
第二节 材料、设备及试剂 7
一、材料 8
二、设备 8
三、试剂： 9
第三节 操作步骤 10
一、目的基因的获得： 10
二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： 11
三、pET-21b等与目的片段的连接作用 12
四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定 13
五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE电泳。 14
六、融合蛋白的毒力测定 16
第四节 本实验的实验报告 16

第一节 基因操作概述
一、聚合酶链式反应(PCR)
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
　　（一）、PCR反应中的主要成份
　　1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1～2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2～1.0μmo L /L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。
　　2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20～200μmol/L。
3、Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5～2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1～5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
4、模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102～105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
　　5、Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环。在100μlPCR反应中，1.5～2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
　　6、反应缓冲液：反应缓冲液一般含10～50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为8.3～8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性。
　　（二）、PCR反应参数
　　1、变性：在第一轮循环前，在94℃下变性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为94℃1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
　　2、退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。通常退火温度和时间为37℃～55℃，1～2min。
　　3、延伸：延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃～85℃。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。
　　4、循环次数：当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25～30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25～30轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增。
二、质粒概述
　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1～200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA， 简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
三、凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)染色，在紫外光下至少可以检出1～10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
　　琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。
　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：
　　1、DNA的分子大小：
　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。
　　2、琼脂糖浓度
　　一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2～1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3～0.7%，DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8～1.0%。
　　3、DNA分子的构象
　　当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关，还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，开环DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
　　4、电源电压
　　在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
　　5、嵌入染料的存在
　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。
　　6、离子强度影响
　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

　　转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于～70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率， 实验中要考虑以下几个重要因素：
　　1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，密度过高或不足均会影响转化效率。
　　2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
　　3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR或AR)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
　　4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
五、重组质粒的连接

　　外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
　　1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
　　2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物， 而且正反两种连接方向都可能有。
　　3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
六、限制性内切酶消化
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
第二节 材料、设备及试剂
一、材料

不同来源的模板DNA；
E.coli DH5α菌株：Rˉ，Mˉ，Ampˉ；
E.coli BL21Plyst（DE3）FˉompT hsdSB(rBˉmBˉ) gal dcm(DE3)；
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：购自Beijing Tianwei Corporation。
本实验所用的特异引物：
表2-1 设计Cry1Ac结构域基因特异引物

引物序号
引物序列
1
5'-CGCGGATCCGGGTGGAGAAAGAATA-3'
2
5'-CGCGTCGACATGTCGATGGGAAGTG-3'
3
5'-CGCGGATCCGGATTGGGTAAGGTAT-3'
4

5
5'-CGCGGATCCGGTTCGTGTACGGTATG-3'
6
5'-CGCGTCGACTTAGCCCTAGTTGGT-3'
7

8

9
5'-CGCGTCGACTATACCTTACCCAATCTC-3'

表2-2 Cry1Ac结构域菌体阳性克隆子的引物
引物名称
引物序列
T7
5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
SP6
5'-GATTTAGGTGACACTATAG -3'

注：Tm=4（C+G）+2（A+T）
二、设备

PCR小管；离心管；DNA扩增仪(PE公司或eppendorf)；琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)；台式高速离心机；恒温振荡摇床；高压蒸汽消毒器(灭菌锅)；涡旋振荡器；恒温水浴锅；台式高速离心机；微波炉或电炉；紫外透射仪；数码相机及其附件；电热恒温培养箱；无菌工作台；低温冰箱；制冰机；分光光度计；微量移液枪(20μl，200μl，1000μl)及吸头；电热恒温鼓风干燥箱；蛋白电泳系统ProteawIIBio-Rad；超声波破碎仪；Millipore纯水仪；空气浴振荡器；电子天平。
三、试剂：
1、限制性内切酶(BamHI，SalI，NdeI)
2、10×PCR反应缓冲液
3、MgCl2 ：25mmol/L
4、4种dNTP混合物
5、Taq DNA聚合酶
6、异丙醇
7、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。
8、LB固体培养基：液体培养基中每升加13g琼脂粉，高压灭菌。
9、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
10、溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8。0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。
11、50×TAE（Tris-乙酸）：Tris碱24.2g、冰乙酸5.71mL、5mol/LEDTA(PH8.0)10mL加去离子水定容至100mL，使用时用去离子水作50倍稀释，即为工作液。
12、溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。
13、溶液Ⅱ：0.2 mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1％SDS。
14、溶液Ⅲ：5mol/LKAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
15、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7。5)，15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。
16、饱和酚：市售酚
17、按体积/体积＝1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1：1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
18、TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
19、电泳所用试剂：上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。
20、溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
21、1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml0.5×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TAE），即可上样。
22、含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。
23、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/LTris·Cl(pH7.6)，100mol/LMgCl2，100mol/L二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml牛血清清蛋白(组分V.Sigma产品）（可用可不用），10mol/LATP（过滤灭菌）。
24、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
25、IPTG储液(200mg/ml)：在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
26、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
27、1.5M Tris-HCl(pH8.0)：Tris18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100ml。
28、1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。
29、10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶，浓盐酸调至pH72，定容至100ml。
30、10´电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解，定容至100ml。
31、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。
32、2´SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。
33、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.5g，甲醇200ml，冰醋酸50ml，ddH2O 250ml。
34、脱色液：甲醇50ml，冰醋酸50ml，ddH2O400ml。
35、0.05mol/LCaCl2溶液：称取0.28gCaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。
第三节 操作步骤
一、目的基因的获得：
（一）、建立PCR操作程序

PCR反应体系 PCR反应程序
Cry1Ac基因模板
2µL
正向引物
2µL
反向引物
2µL
10×Buffer
5µL
dNTP
4µL
TaqDNA 聚合酶
1µL
去离子水
34µL
总体积
50µL
Step1
94℃
3 min
Step 2
94℃
1 min
Step 3
60℃
1 min
Step4
72℃
2min
Step 5
Go to step2
30cycles
Step 6
72℃
10 min

（二）、进行琼脂糖凝胶电泳并且作柱回收
DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）
1、用干净的刀片将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，尽量切除多余凝胶。
2、加入溶胶液500µL，50℃水浴放置10min。
3、将上一步所的溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液。
4、加700µL漂洗液，12000r/min离心30s，弃掉废液。
5、加500µL漂洗液，12000r/min离心30s，弃掉废液。
6、将离心吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。
7、再将离心柱放在30～40℃温箱中烘干10min。
8、将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间位置加入40µL洗脱缓冲液，室温放置2min，12000r/min离心1min。
注意事项
紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
（三）、进行目的片段的双酶切：

结构域基因的双酶切反应体系
组分

目的片段
模板DNA
10µL
限制性内切酶
BamHI 2µL；SalI 2µL
缓冲液
T buffer 3µL
去离子水
3µL
总体积
20µL

在此条件下，37℃反应1h。接下来作柱回收。
二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得：
（一）、取菌 37℃过夜摇菌 提取质粒。
1、取1.2mL培养物倒入离心管中，4℃8000r/min离心1min，重复一次。
2、吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
3、加入100uL预冷的溶液Ⅰ，在涡旋混合器上剧烈振荡直至看不见沉淀。
4、加入200uL新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不要振荡，室温3～5min。
5、加入150uL预冷的溶液Ⅲ，温和地振荡混匀，可见白色絮状沉淀，然后放冰上5～10min。
6、加入400uL饱和酚：氯仿（1：1）进行抽提，以除去蛋白质。12000r/min离心5min。
7、上清液加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃放置10～30min。15000r/min离心3min。去上清得到质粒DNA沉淀。
8、沉淀用200uL预冷70%的乙醇冲洗沉淀。
9、用一小条滤纸小心吸去管壁残留的上清，将离心管放在超净台中通风干燥，直至无乙醇气味。
10、加入适当浓度Rnase的TE缓冲液（或去离子水）重溶质粒DNA，振荡混匀，-20℃备用。
（二）进行高效表达载体的双酶切：

载体的双酶切反应体系
表达载体
10µL
限制性内切酶
BamHI 2µL；SalI 2µL
缓冲液
T buffer 3µL
去离子水
3µL
总体积
20µL

在此条件下，37℃反应1h。接下来作柱回收。
三、pET-21b等与目的片段的连接作用
1、在离心管中建立下列连接体系
10×T4DNA Ligase Buffer
2。5µL
目的片段
10µL
表达载体
2µL
T4DNA Ligase
1µL
dH2 O
up to 25µL
2、16℃过夜反应。
四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
（一）大肠杆菌感受态细胞制备（DH5α、BL21plyst）
注：常规CaCl2法，要求无菌操作。
1、从37℃培养的16～20h的新鲜平板中挑取一个DH5a单菌落，接种于5mLLB培养基中，37℃，180r/min震荡过夜。
2、 按1%的接种于小三角瓶中，37℃震荡培养3h至OD600为0.5。
3、4000r/min离心5min，收集菌体，倒去上清，加入1/2体积预冷的0.05mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀，置冰上30min。
4、4000r/min离心5min，倒去上清，加入1/10体积预冷的0.05mol/LCaCl2轻轻悬浮沉淀。
5、进行分装，向每一个离心管中加约200uL的感受态细胞。
6、 4℃保存备用（一星期用完）。
（二）连接产物转化
1、5uL～10uL连接产物和200uL感受态细胞在无菌条件下混匀
2、冰浴30min
3、42℃热击，1.5min。
4、冰浴2min
5、加入500uL～800uLLB液体培养基（无菌条件下）。
6、37℃扩培，180r/min进行60min。
7、取100uL～200uL涂含有氨苄抗性的LB平板。
8、放在恒温培养箱中37℃培养过夜。
（三）从平板中调取30个菌落编号1～30，经T7、SP6特异引物进行PCR扩增，来筛选阳性克隆子，最后只需选择一个阳性重组质粒，分别进行单酶切、双酶切及及原始目的片段PCR扩增以确保目的片段真正地连接到表达载体上。
Cry1Ac结构域菌体阳性克隆子的PCR扩增
建立以下体系每PCR管分装500µL/30=16µL。
PCR反应体系 PCR反应程序
Cry1Ac菌体模板
少量
SP6引物
20µL
T7引物
20µL
10×Buffer
50µL
dNTP（10mmol/L）
10uL
TaqDNA 聚合酶
5µL
去离子水
400µL
总体积
500µL
Step1
94℃
5min
Step 2
94℃
1 min
Step 3
52℃
1 min
Step4
72℃
2min
Step 5
Go to step2
30cycles
Step 6
72℃
10 min

当载体上T7、SP6特异引物P调后，应在原目的片段基础上加约200bp长度，再经过琼脂糖凝胶电泳应得到得到我们所要的重组DNA。筛选出阳性克隆子进行质粒提取及单、双酶切
五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE电泳。
（一）Cry1Ac结构域基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达
1、将阳性克隆子分别进行质粒提取，再分别转化大肠杆菌（Escherichia coli)BL21Plyst表达菌株，涂平板，37℃培养过夜。
2、菌种活化：5mL培养基的试管中各加入氨苄，摇匀。用10uL无菌枪头挑取单菌落，接种。放入到摇床中，180r/min，37℃，振荡培养12h。取出活化好的菌种。先在100mL的培养基中滴入氨苄，摇匀。按1%的量接种，放到摇床中，230r/min，37℃，振荡培养2h~3h。
3、 融合蛋白的诱导表达：向菌液中分别加入终浓度0.8mmoL/L的IPTG作诱导剂。28℃，180r/min，振荡培养8h。取以上诱导培养液，倒入离心管中，5000r/min，4℃离心10min。弃去上清，加入5mL10mmoL/L的Tris-HCl（pH8.0），悬浮沉淀，加入适当浓度的溶菌酶进行破壁处理，4℃12000r/min离心10min，收集沉淀，再用5mL50mmol/L的Na2CO3（pH9.5）溶解，于4℃冰箱保存备用，按常规溶解SDS-PAGE方法检测表达产物。
（二）Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、根据厂家说明书安装玻璃板。
2、确定所需凝胶溶液体积配制15mL的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
3、迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以防止氧气进入凝胶溶液。
4、分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。
5、配制5mL的浓缩胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
6、聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
7、在样品中按1：1体积比加入2×样品缓冲液，在100℃加热3min以使蛋白质变性。
8、浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定在电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电级缓冲液。
9、按预定顺序加样，加样量通常为10~25uL。
10、将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。
11、从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
12、 用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行1~2小时或过夜染色。
13、换脱色液脱色，需3~10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。
14、对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。
注意事项：
1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。
2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。
3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。
六、融合蛋白的毒力测定
生物测定采用叶片浸渍饲喂法：先将供试药剂Bt制剂和Cry1Ac毒蛋白按等比级数稀释法，顺次配制成系列浓度，药液中加入0.2‰的Triton X-100，以清水为对照进行预备试验，根据预备试验的结果，以校正死亡率在10%～90%的浓度范围作为正式试验的浓度范围，然后按上述原则和方法配制出5～6个系列浓度，供正式试验用。取新鲜甘蓝苗嫩叶片，用打孔器打下直径6㎝的圆片，分别在各种供试药液中浸渍约10s，取出自然凉干后，放入12cm直径培养皿中(垫有滤纸保湿)，并接入供试小菜蛾幼虫，每处理4次重复，每重复接虫10头。饲养温度