透室壁性心肌血运重建生物可降解支架的制备与优化.doc

透室壁性心肌血运重建生物可降解支架的制备与优化吕丰1，刘天军1，赵健2，刘晓程2， 宋存先11中国医学科学院 北京协和医学院 生物医学工程研究所天津生物医学材料重点实验室，天津3001922泰达国际心血管病医院心外科，天津300457通信作者：刘天军 电话/传真:[phone]，电子邮件:liutianjun摘要：目的 制备心肌内生物可降解性支架，优化支架制备方式，评估其保持心肌孔道通畅的可行性。 方法 以聚己内酯（PCL）为材料，聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）为药物载体，分别通过静电纺丝法、溶液浇注-溶剂挥发法和熔融挤出法制备成生物可降解性支架。采用万能材料测定仪测定支架的力学性能，制备猪慢性心肌局部缺血模型，在体评估该支架在TMR后对心肌孔道的作用效果。结果 通过三种支架制备方式的比较，熔融挤出法制备的PCL支架具有较好的力学性能，支架压缩80时承受的应力为1.7MPa，在TMR后可保持心肌孔道通畅。结论.成功制备心肌内生物可降解性药物缓释支架，能承受心肌压力，可维持TMR后的心肌孔道通畅，具有广泛的临床应用前景。关键词：生物可降解性支架；聚己内酯；聚乳酸-聚乙醇酸共聚物；透室壁性心肌血管重建术基金项目:天津自然科学基金项目（09）和天津科技发展计划项目(05YFGZSF02900)Preparation and Optimization of Biodegradable Stent for Transmyocardial Revascularization LU Feng1，LIU Tian-jun1，ZHAO Jian2，LIU Xiao-cheng2，SONG Cun-xian11 Tianjin Key Laboratory of Biomaterial Research，Institute of Biomedical Engineering, CAMS and PUMC, Tianjin 300192, China2Department of Cardiovascular Surgery，TEDA International Cardiovascular Hospital, Tianjin 300457, ChinaCorresponding author：LIU Tian-jun Tel/Fax:[phone]，E-mail:liutianjunABSTRACT: Objective To prepare biodegradable stents for transmyocardial revascularization and optimize the preparative method of stent, evaluate its feasibility on myocardium channel after transmyocardial revascularization (TMR).Methods The stents were prepared using poly (-caprolactone)(PCL) and poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) as the materials of stents by electrospinning, solution spraying or melting extrusion. The mechanical strength of stent was tested by universal material testing machines. The effect of stent on myocardium channel after TMR was evaluated in vivo by a standard animal model of chronic myocardial ischemia in Miniswine. Results The stent has beneficial mechanical property by melting extrusion. The stent diminished 80% of initial scale under the stress of 1.7Mpa.It can keep the myocardium channel patency after TMR. Conclusions A biodegradable stent in myocardium channel was prepared successfully. It can sustain the pressure from the heart. The stent can ensure the myocardium channel patency after TMR. Its clinical application should be widespread.Key words: biodegradable stent; poly(-caprolactone)；poly (D, L-lactide-co-glycolide)；transmyocardial revascularization 透室壁性心肌血运重建术近些年在世界范围内的基础研究和临床应用取得了很大进展，其减轻心绞痛、提高缺血心肌灌注、改善心功能的作用已得到广泛关注12。但是TMR术后短时间内，心肌管道便因凝血而闭塞，从而直接影响血流灌注效果3，因此需要采用支架保持TMR通道开放，促进血流灌注4。腔道内支架能够起到支撑人体内各种腔道，保持人体管道畅通的作用，而不需要打开或再造腔道，因而病人的生活质量能够得以大大提高。在介入医学中，金属支架被广泛应用于临床中，但由于金属支架的不可降解性，其永久存在将会引发损伤部位的免疫反应，远期疗效并不理想。生物可降解性聚合物支架能够在一定时间内保持支架的支撑性能，随后可降解为无毒物质5，当其完成支撑作用后，可被组织完全吸收，副作用较少，因此较金属支架更具优势，在临床上有较大的应用前景。本部分摸索不同的方法和工艺来优化满足心肌孔道通畅的生物可降解性药物支架的制备。1.材料和方法1.1材料与仪器聚乳酸-聚乙醇酸共聚物poly (D, L-lactide-co-glycolide) , PLGA；聚乳酸：聚乙醇酸50/50(mol %)，Mw=45000购自中国科学院成都有机化学研究所；己内酯单体（99.9%）购自美国Aldrich公司；实验用中国小型猪，猪龄34个月，体重1215kg，购自北京琉璃科兴实验动物养殖中心，标准饲料喂养；其他试剂均为国产分析纯。实验用中国小型猪， 猪龄3-4个月，12-15kg，购自北京琉璃科兴实验动物养殖中心；静电纺丝设备，北京仪器定制中心；聚四氟乙烯模具，自制；螺杆挤出机(SJ-400/20，上海轻工业机械公司)， 扫描电镜（XL30ESEM，荷兰Philips公司），光学显微镜，BX51，日本OLYMPUS公司，万能材料测试仪（MS00-10KN, 英国Testometric公司）。1.2方法1.2.1静电纺丝法制备支架 以氯仿为溶剂, 配制浓度为0.15g/ml 的PLGA 溶液, 在电压为15kv、喷丝头与接收转桶的间距为6cm、流速为0.4ml/h 的条件下进行静电纺丝, 收集、干燥后获得PLGA 纤维支架。1.2.2溶剂挥发法制备支架 本实验以聚合物PLGA为材料，采用溶液浇注-溶剂挥发法制备薄膜。将聚合物溶于有机溶剂二氯甲烷制成质量浓度为10%聚合物溶液，浇注成聚合物薄膜，在真空烘箱中充分干燥以除去有机溶剂，用切割法加工成条状薄膜，然后在金属棒上卷绕成型后溶剂固定成外径3mm的管状支架。1.2.3熔融挤出法制备PCL支架 采用己内酯单体开环聚合制备聚己内酯poly (-caprolactone)，PCL，参照文献6 合成PCL共聚物。PCL投料到螺杆挤出机中，挤出温度设定为120，挤出后在25流水中冷却，真空干燥，最后切成长度为10mm，外径、内径分别为3.0/2.8mm的空心管状支架。 1.2.4支架形貌与性能表征的检测 分别取支架和薄膜样品, 将其表面经离子溅射仪喷金镀膜后, 用扫描电镜观察支架的表面及其断面，万能材料测定仪测定支架的力学性能。1.2.5支架的动物实验评估 参照文献7建立猪慢性心肌局部缺血模型：（1）经肌肉注射0.25 mg/kg甲苯噻嗪和2 mg阿托品，静脉注射10 mg/kg 硫戊巴比妥钠(2.5%)，气管插管，接呼吸机辅助呼吸，再注射0.5%异氟烷和1 mg/kg利多卡因。（2）取胸骨正中切口，打开胸腔及心包，暴露心脏，直视下在左心室前壁用微型钻（直径3mm）进行心肌打孔，实验组为穿透心壁后迅速将制备的支架放入心肌孔道内，并于管道外口处结扎固定；对照组为心肌打孔后未放入支架。（3）关闭胸腔，缝合，静脉注射肝素，待其恢复，应用Philips Sonos 7500超声心动图仪，S3探头频率为1.63.2 MHz，于心尖左室短轴切面采集图像，并记录存盘。于术后6周处死，取出心肌组织进行HE染色分析。2.结果2.1静电纺丝法制备支架 制备出了中空管状支架，图2.2为给定电纺条件下SEM照片，由图可以清楚的看出纤维无规的排列,纤维间存在一定程度的粘结，该方法制备出的膜及支架力学性能极差，几无力学承重作用，不能耐受心肌挤压这一基本前提，因其质地柔软，甚至难以植入心肌孔道，未进行径向应力-应变测试，不能满足后续动物实验要求。 图1不同方法制备在管状支架(A.静电纺丝法制备PLGA管状支架SEM图片; B. 静电纺丝法制备PLGA管状支架表面SEM图片；C.溶剂挥发法制备PLGA支架;D.熔融挤出法制备PCL支架2.2溶剂挥发法制备支架 以聚合物PLGA为材料制备薄膜如图所示，然后在金属棒上卷绕成管状支架，最后利用有机溶剂将其固定成型，可以得到如图1所示的管状支架。将其置入心肌通道进行体内实验，24h后取出，发现支架已严重变形，不能保持管状形状，不能继续起到支撑作用。图2为组织切片HE染色后显微镜下观察，支架孔道轮廓被挤压近似三角形，并且三条边向内侧管腔凹陷，管腔几乎完全压闭，不能保持植入前的中空管形。图2 溶剂挥发法制备PLGA支架作用后心肌组织切片HE染色图片（HE, 40）2.3熔融挤出法制备PCL支架 通过熔融法制备了PCL管状支架，力学性能测试结果显示，支架压缩80时，其承受的应力为1.7MPa（图3）。制备出的PCL裸支架进行初步动物实验，超声探头经左室短轴切面可见左室前壁内支架回声影像，管壁回声偏强，管腔回声弱，其形状规则，无挤压变形征象（图4）。动物大体观察显示，支架垂直于心室壁，内侧开口位于肌小梁间，管腔保持最初的管形，无挤压变形，管腔内部似有血液充盈，周围心肌无异常改变。部分支架与心肌组织结合紧密，支架周围心肌局部缺血得到改善（图5）。图3 支架的应力-应变关系曲线图图4 左室心尖短轴切面PCL支架超声影像图5 心肌内支架作用效果A.动物处死后心肌照片，黑色箭头处为支架；B.心肌内支架的扫描电镜照片；C.心肌内支架周围组织HE染色照片3.讨论生物可降解性药物缓释支架在血管、胆管和食管内的应用已有广泛研究8，但由于心肌内支架研究较少，而其他用途的支架也不能完全满足于心肌血运重建的需要，因此应该针对心肌血运重建的需要进行专门设计。支架需要在TMR孔道起到一定的支撑作用，该药物支架需要一定的强度。但是蛋白类药物的热稳定性较差，在支架制备过程中不能经过高温处理，因此不能运用常规生物降解性药物支架制备方法，将药物与聚合物共混后通过熔融挤出制备成药物支架，或者通过制备成药物薄膜后通过热定型的方法来制备支架。本部分摸索不同的方法和工艺来优化满足本课题需要的生物可降解性药物缓释支架的制备。静电纺丝法近年来在组织工程方面的应用发展较快，是制备生物材料的一种新方法，同时在药物载体方面也有较大的优势9。通过溶液纺丝的方法将含有药物的聚合物溶液进行湿法纺丝可以制备药物支架，该方法不仅能保持药物活性，同时能够均匀分布药物，达到长时间缓慢释放。本实验中通过静电纺丝法制备了PLGA支架，但该支架力学承重作用较差，不能耐受心肌挤压这一基本前提。溶剂挥发法是制备聚合物薄膜的一种常规方法，本实验以聚合物PLGA为材料制备薄膜，然后在金属棒上卷绕成管状支架，最后利用有机溶剂将其固定成型，将其置入心肌通道进行体内实验，24h后取出，发现支架已严重变形，不能保持管状形状，不能继续起到支撑作用。PLGA为生物相容性较好的生物医用材料 10，由于以PLGA作为支架材料通过溶剂法制备的支架力学强度较弱，而熔融挤出方法可以加强支架的力学性能，但是作为药物载体时不能通过高温的方法制备。基于以上原因，设计具有药物缓释和支架支撑双重性能的PLGA药物支架不能满足实际要求，通过改变支架设计方法，根据药物缓释和支架支撑性能不同的要求选择材料和制备方法，再将两者进行有效结合来制备药物缓释支架。采用半结晶性聚合物PCL为支架材料，PCL玻璃化温度较低，具有一定的回弹性，抗疲劳能力较强，通过熔融挤出法制备支架结构层可以赋予支架更强的力学性能，通过研究发现，PLGA支架均不能满足动物实验要求，需要在材料和制备方式上改变。分别从两方面来考虑支架的设计，一方面选用具有较好力学性能的材料制备支架架构层，另一方面制备药物缓释载体，再将其结合起来制备成药物缓释支架。采用熔融挤出的方法制备支架结构层，该方法通过挤出定型过程中的拉伸作用可以使支架有一定的取向，进而赋予支架较好的力学性能。支架结构层的材料选用半结晶性聚合物聚己内酯PCL，该材料玻璃化温度较低，可以保持支架一定的弹性，提高支架抗疲劳能力，而且降解时间相对缓慢一些，使支架降解一段时间后还可以保持其支撑能力。另外，该材料在室温下就可以结晶，提高了支架的强度。制备出的PCL裸支架进行初步动物实验，初步结果表明6周后该支架仍能够保持TMR孔道通畅，表明了PCL支架保持TMR通道开放的可行性。综上所述，本实验分别以PLGA、PCL为支架材料，通过溶剂挥发法、静电纺丝法、熔融挤出法制备了生物可降解性支架。以PLGA作为药物载体制备的支架不能满足实际要求。PCL通过熔融挤出法制备的管状支架力学性能较好，初步结果表明该支架可以承受动物心肌压力，其结合TMR术后可以保持心肌孔道的通畅，因此，PCL支架作为心肌血运重建药物支架的结构层有较好的可行性。参考文献：1 Hughes GC, Biswas SS, Yin BL, et al. A comparison of mechanical and laser transmyocardial revascularization for induction of angiogenesis and arteriogenesis in chronically ischemic myocardiumJ.J Am Coll Cardiol, 2002,39(7):12201228.2 Aaberge L, Nordstrand K, Dragsund M, et al. Transmyocardial revascularization with CO2 laser in patients with refractory angina pectorisJ. J Am Coll Cardiol, 2000,35(5):1170-1177.3 Chu VF, Giaid A, Kuang JQ, et al. Angiogenesis in transmyocardial revascularization: comparison of laser versus mechanical puncturesJ. Ann Thorac Surg, 1999, 68(8):301-308.4Meerkin D, Pellerin M, Thomas AH.,et al. Transmyocardial Coil Implants: A Novel Approach to Transmyocardial RevascularizationJ, Ann Thorac Surg 2002;74:488 -4925 Venkatraman SS, Tan LP, Joso JF. Biodegradable stents with elastic memoryJ. Biomaterials, 2006,27(8):1573-1578. 6 Sun HF, Mei L, Song CX, et al. The in vivo degradation, absorption and excretion of PCL-based implantJ. Biomaterials, 2006,27(9):1735-1740.7 Horvath KA, Lu CY, Robert E, et al. Improvement of myocardial contractility in a porcine model of chronic ischemia using a combined transmyocardial revascularization and gene therapy approachJ.J Thorac Cardiovasc Surg, 2005,129(5):1071-1077.8 Zilberman M, Eberhart RC. Drug-eluting bioresorbable stents for various applicationsJ. Annu Rev Biomed Eng, 2006,8:153-180.9Stitzel J,Liu J,Lee SJ,et al. Controlled fabrication of a biological vascular substituteJ.Biomaterials,2006,27:10881094.10 Jeon O, Kang SW, Lim HW，et al. Long-term and zero-order release of basic fibroblast growth factor from heparin-conjugated poly(L-lactide-co-glycolide) nanospheres and fibrin gelJ.Biomaterials,2006,27:15981607.8