禽类抗HBV抗体IGY检测方法的建立.doc

蛋鸡抗HBV-IgY的制备与酶标检测方法的建立
摘要: 目的：制备出特异性的抗HBV-IGY抗体, 探索ELISA检测条件。方法：用人乙肝疫苗免疫蛋鸡, 分别收集鸡蛋, 4 ℃下保存备用; 用鸡蛋抗体IgY提取系统（EGGstract IgY Purification System，EIPS）提取鸡蛋黄中IgY 抗体; 用改进的酶联免疫吸附法检测IgY 抗体含量，探索最佳检测条件。结果在免疫后第一至三周, IgY 抗体含量开始上升，第六周达到高峰，并可持续两个月，结论采用乙肝疫苗免疫母鸡,，可持续性获得特异性抗HBV-IgY抗体。
关键词：乙肝病毒;卵黄抗体；ELISA
鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)具有与血清IgG一样的抗体活性。鸡的IgY类似于哺乳动物IgG，其分子量约为180 kb，等电点接近5．2。其重链有4个稳定区，无交链区，而哺乳动物的IgG 只有3个稳定区。IgY的含氮量为14．8％，氨基酸组成及含糖量与人和兔的免疫球蛋白有显著的差异。特异性鸡卵黄抗体IgY对病原体感染的防御无动物种属的差异，这为IgY防治人类疾病的应用奠定了基础。乙型肝炎病毒((Hepatitis B virus,HBV)的感染，不仅引起急、慢性病毒性肝炎，而还与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的关系。接种重组乙肝疫苗或合成肽疫苗能够增强乙肝患者的抗HBV免疫应答，通过接种疫苗对机体施加HBV抗原刺激有助于乙肝的治疗，为探讨禽类抗乙肝病毒卵黄抗体（抗HBV-IgY）的特性，我们利用重组酵母乙型肝炎疫苗，对蛋鸡进行免疫后，用EIPS提取蛋黄中的IgY，利用改进的人乙肝表面抗体检测试剂盒检测所得IgY中HBV-IgY含量变化,为进一步开发应用HBV-IgY做准备。
1 材料与方法
1.1 试剂材料
重组酵母乙型肝炎疫苗购自北京天坛生物制品股份有限公司，批号 ；EGGstract IgY：Purification System购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，批号 ；乙型肝炎病毒表面抗体诊断 试剂盒（酶联免疫法）购自上海科华生物技术有限公司，批号20081006，羊抗鸡-HRP购自 ；一般化学试剂采用国产分析纯试剂。
1.2 产蛋母鸡的免疫
选择15月龄、体重1.5Kg左右的健康 蛋鸡两只采用胸部皮下及双腿肌肉注射疫苗，剂量为10μg/只，每周一次，连续三次后追加一次同剂量静脉注射。收集免疫前至免疫后三个月的鸡蛋，按对应母鸡编号，4°保存备用。
1.3 IgY的分离提取
按EIPS鸡蛋IGY提取系统试剂盒说明，分离蛋黄后加入三倍体积A液搅拌混匀后4℃ 10000rpm离心15min，纱布过滤，在滤液中加入三分之一倍体积B液再次4℃ 10000rpm离心15min弃上清得IgY,-50℃真空冷冻干燥后4℃冰箱保存。
1.4 间接ELISA法检测抗体
抗HBV-IgY抗体采用ELISA法检测，检测前先用PBS将IgY抗体稀释到1：250，羊抗鸡-HRP稀释到1：500.按实验设计依次在乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒96孔板中加入50μl稀释好的IGY样品，50微升羊抗鸡-HRP溶液，混匀，封板，37℃孵育30min后洗板，每孔加入显色剂A液、B液各50微升，混匀，封板，37℃15min后每孔加入50微升终止液混匀，酶标仪450nm波长检测。
2 结果
鸡蛋中抗HBV-IgY免疫前及免疫后各时间点酶联免疫检测吸光度OD值
一号鸡
免疫前
第1周
第2周
第3周
第4周
第5周
第6周
0.81±0.11
1.27±0.22
1.1±0.14
1.06±0.16
0.92±0.03
0.94±0.06
1.17±0.01
第7周
第8周
第9周
第10周
第11周
第12周
第13周
1.2±0.06
1.23±0.16
1.21±0.22
0.98±0.09
1.14±0.12
0.84±0.19
0.79±0.2

二号鸡
免疫前
第1周
第2周
第3周
第4周
第5周
第6周
0.48±0.05
0.45±0.1
0.55±0.03
0.77±0.1
0.69±0.05
0.92±0.05
0.73±0.09
第7周
第8周
第9周
第10周
第11周
第12周
第13周
1.03±0.21
0.86±0.09
0.77±0.15
0.96±0.15
0.85±0.18
0.51±0.14
0.55±0.11

讨论与结论
本研究用重组酵母乙型肝炎疫苗免疫蛋鸡，获得抗HBV-IGY，经初步提取后得到鸡蛋中的总IGY，并利用人乙型肝炎病毒表面抗体诊断 试剂盒（酶联免疫法）结合羊抗鸡辣根过氧化物酶检测总IGY中的抗HBV-IGY。从以上数据可见，免疫后鸡蛋中的抗HBV-IGY明显上升，但是上升的时间，上升的多少，均有差异。并且，免疫前出现较高的数值说明总IGY中非特异性结合比较高，有待进一步纯化抗HBV-IGY。本方法能利用了现有试剂盒达到快速方便地检测出鸡蛋中抗HBV-IGY的变化情况的目的。