新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响.pdf

新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.334 基金项目：河北省重点研发计划(20277746D)通信作者：闫会敏，Email： 引用格式：丁芳，江平，李力，等.新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响J/CD.新发传染病电子杂志，2023,8（3）：34-38.Ding Fang,Jiang Ping,Li Li,et al.Effect of novel coronavirus spike protein on the secretion of inflammatory factors by mononuclear macrophagesJ/CD.Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,2023,8(3):34-38.论著丁芳，江平，李力，张鑫，戴二黑，闫会敏（石家庄市第五医院临床医学研究所，河北 石家庄 050021）新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的 影响【摘要】目的 探讨SARS-CoV-2对单核巨噬细胞分泌炎症因子的作用及机制。方法 纳入石家庄市第五医院2020年1月21日至2月10日以及2021年1月3日至1月7日住院的COVID-19确诊患者（病例组）与健康对照者（对照组）各53例，收集病例资料与血常规检测结果。采用SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞，细胞增殖-毒性检测细胞活力，荧光定量PCR法检测炎症因子IL-6、IL-1和CCL2与信号通路分子JAK1、STAT1和NF-B的表达。结果 COVID-19患者的单核细胞比值与中性粒细胞比值高于对照组，而淋巴细胞比值、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞比值、嗜酸性粒细胞计数与红细胞压积低于对照组。SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞后，在100ng/ml与300ng/ml的浓度下细胞活力高于对照组（P=0.046），在浓度为500ng/ml时IL-6、IL-1与CCL2的mRNA表达含量最高（P0.01，P=0.036，P0.001），在浓度100ng/ml时JAK1与STAT1的mRNA表达明显升高（P0.001），在300ng/ml与500ng/ml刺激下，NF-B表达增高（P0.001）。结论 COVID-19患者的单核细胞升高，SARS-CoV-2刺突蛋白可能通过JAK1/STAT1信号通路促进单核巨噬细胞分泌炎症因子，在细胞因子风暴中发挥作用。【关键词】新型冠状病毒；刺突蛋白；单核巨噬细胞；炎症因子；细胞因子风暴；信号通路 DOI：10.19871/ki.xfcrbzz.2023.03.007 【中图分类号】R512.99Effect of novel coronavirus spike protein on the secretion of inflammatory factors by mononuclear macrophagesDing Fang,Jiang Ping,Li Li,Zhang Xin,Dai Erhei,Yan Huimin(Clinical Research Center,Shijiazhuang Fifth Hospital,Shijiazhuang Hebei 050021,China)【Abstract】Objective The aim of this study was to investigate the role and mechanism of SARS-CoV-2 virus on the secretion of inflammatory factors by mononuclear macrophages.Method Fifty-three patients with confirmed COVID-19 hospitalized from January 21 to February 10,2020 and January 3 to January 7,2021 were selected from Shijiazhuang Fifth Hospital,fifty-three healthy controls each were included,and the results of medical records and routine blood test were collected.Mononuclear macrophages were stimulated with SARS-CoV-2 virus spiked protein,cell viability was detected by CCK-8 assay.The level of pro-inflammatory cytokines IL-6,IL-1 and CCL2 and the expression of signaling pathway molecules JAK1,STAT1 and NF-B were detected by quantitative RT-PCR.Result The monocyte ratio and neutrophil ratio were higher,while the lymphocyte ratio,lymphocyte count,eosinophil ratio,and eosinophil count,and hematocrit were lower in COVID-19 patients than those in controls.After stimulation of mononuclear macrophages by SARS-CoV-2 virus spiked protein,cell viability was higher at concentrations of 100ng/ml and 300ng/ml(P=0.046).The highest mRNA expression levels of IL-6,IL-1 and CCL2 at a concentration of 500ng/ml(P0.01,P=0.036,P0.001).The expression of JAK1 and STAT1 at a concentration of 100ng/ml(P0.001),the expression of NF-B expression was increased at 300 and 500ng/ml stimulation(P0.001).Conclusion SARS-CoV-2 viral spike protein may promote inflammatory cytokine secretion by mononuclear macrophages through the JAK1/STAT1 signaling pathway,which play a role in the cytokine storm.【Key words】Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2;Spike protein;Mononuclear macrophages;Inflammatory cytokine;Cytokine storm;Signal pathway 35 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3COVID-19疫情在全球大流行过程中出现了多种SARS-CoV-2变异毒株，部分毒株传播能力强，波及范围广1。大多数感染SARS-CoV-2的患者可出现轻度至中度症状，部分患者可发展为重症或危重症，甚至死亡2。研究发现SARS-CoV-2感染导致的严重损伤，除与病毒借助血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受体直接进入攻击靶细胞外，还与免疫系统过度反应造成炎症因子风暴有密切关系3-4。激活的单核巨噬细胞是炎症因子的重要来源。由于单核细胞不表达ACE2受体，而巨噬细胞的ACE2含量也很低，目前普遍认为SARS-CoV-2主要是通过间接方式来影响单核巨噬细胞，即病毒在肺部上皮细胞等靶细胞内进行复制，继而引起单核巨噬细胞异常激活产生促炎症细胞因子，这些促炎症细胞因子又趋化更多的炎症细胞参与，从而加剧肺组织损伤5。然而，SARS-CoV-2是否对单核巨噬细胞具有直接作用尚存在争议。SARS-CoV-2基因组编码29种蛋白，其中刺突蛋白（spike protein,S蛋白）是SARS-CoV-2最大的结构蛋白，负责使病毒进入宿主细胞，也可介导机体免疫反应3-4,6-7。本研究旨在阐明SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的作用，并初步解析其分子机制。1 资料与方法1.1 研究对象选择石家庄市第五医院2020年1月21日至2月10日以及2021年1月3日至1月7日所有住院的COVID-19确诊患者共53例，平均年龄（50.6815.75）岁，男性25例，女性28例；其中轻型患者4例，普通型患者39例，重型患者10例。新型冠状病毒感染患者的临床诊断以国家卫生健康委员会发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第八版）为依据，所有患者均经过SARS-CoV-2核酸检测和胸部CT扫描进行确诊，治疗措施包括对症治疗、抗病毒治疗和呼吸支持等。同时收集年龄和性别相匹配的53例健康成人作为对照组。每例患者入院后采集患者清晨空腹静脉血进行检测，使用血细胞分析仪以及配套试剂检测血常规指标。通过医院电子病例系统以及检验系统收集研究对象的病例资料与实验室指标。本研究经石家庄市第五医院伦理委员会批准（编号：2020007）。1.2 CCK-8法检测细胞活力 SARS-CoV-2 S蛋白购买自美国R&D公司，来自人胚胎肾细胞HEK293。将J774A.1小鼠单核巨噬细胞（武汉普诺赛）培养在含15%的胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的改良伊格尔高糖培养基中，放置于5%CO2，37细胞培养箱，细胞生长至汇合度80%90%进行细胞传代。取100l的1.2105个/ml的细胞悬浮液接种细胞至96孔板，预培养24h后，加入含不同浓度的重组SARS-CoV-2 S蛋白（美国R&D公司）的完全培养基刺激单核巨噬细胞，每组3个复孔，培养24h后加入CCK-8液，测量450nm处吸光度值。1.3 荧光定量PCR（qPT-PCR）法检测mRNA的表达 将单核巨噬细胞培养在6孔板中，分别加入含100ng/ml（7.46102nmol/ml）、300ng/ml（2.24103nmol/ml）和500ng/ml（3.73103nmol/ml）终浓度S蛋白的培养基中，培养6h后收集细胞，加入天漠生物公司的TRIcom RNA裂解液，使用小量总RNA提取试剂盒提取RNA。利用ABScript RT反应混合物（ABclonal公司），将样本放入PCR仪中反转录合成cDNA，反应程序为25 5min，42 15min，85 5s。采用2通用型SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒（ABclonal公司）进行实时荧光定量PCR，反应参数：95 3min；95 5s，60 34s，45个循环，在退火阶段收集荧光信号，记录溶解曲线和扩展曲线，使用2-ct法计算相对表达量。PCR引物序列见表1。蛋白正向引物（5-3）反向引物（3-5）IL-6TGCCTTCTTGGGACTGATGCTGAAGTCTCCTCTCCGGACTIL-1GCAGTGGTTCGAGGCCTAATGCTGCTTCAGACACTTGCACCCL2GTCTGTGCTGACCCCAAGAAAAGGCATCACAGTCCGAGTCNF-BCGGCCTCATCCACATGAACTATGTGAGAGGACAGGGGTCAJAK1AAGGAAAGCGTCTGCCATGTAAATGGCTTGGGAGAGAAGGASTAT1GATGGTTCTGGTCGTGGGTTAGGACTGTGCACACTTACCG表1 荧光定量RCR检测基因对应的引物序列1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布时用（x-s）表示，两组之间使用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验（方差齐）或Dunnett-t检验(方差不齐)；不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数)M（P25，P75）表示，两组或多组间比较采用秩和检验；计数资料采用卡方检验。以P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 COVID-19患者外周血细胞的变化 COVID-19患者中性粒细胞比值和单核细胞比值高于正常值的比例分别为16.98%和15.10%，明显高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；而淋巴细胞比值、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞比值、嗜酸性粒细胞计数与红细胞新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.336 项目病例组对照组统计值P值中性粒细胞比值9.1870.004 40%2(3.77)0(0)正常42(79.25)52(98.11)75%9(16.98)1(1.89)单核细胞比值10.5590.003 3%0(0)2(3.77)正常45(84.90)51(96.23)10%8(15.10)0(0)淋巴细胞比值10.0360.004 20%13(24.53)2(3.77)正常38(71.70)50(94.34)50%2(3.77)1(1.89)嗜酸性粒细胞比值47.4210.001 0.4%36(67.92)2(3.77)正常17(32.08)51(96.23)红细胞压积8.5200.014 40%25(47.17)12(22.64)正常27(50.94)36(67.92)50%1(1.89)5(9.43)血红蛋白1.4270.688 130g/L17(32.07)12(22.64)正常35(66.04)40(75.47)175g/L1(1.89)1(1.89)白细胞计数5.3680.066 3.5109/L11(20.75)3(5.66)正常40(75.47)48(90.57)9.5109/L2(3.77)2(3.77)中性粒细胞计数0.4640.837 1.8109/L5(9.43)4(7.55)正常45(84.91)47(88.68)6.3109/L3(5.66)2(3.77)单核细胞计数0.001 1.000 正常52(98.11)52(98.11)0.6109/L1(1.89)1(1.89)淋巴细胞计数27.4290.001 1.1109/L22(41.51)1(1.89)正常30(56.60)50(94.34)3.2109/L1(1.89)2(3.77)嗜酸性粒细胞计数52.0360.001 0.02109/L38(71.70)2(3.77)正常15(28.30)51(96.23)表2 COVID-19患者与健康对照者外周血细胞比较 例（%）压积低于正常值的患者比例明显低于对照组，差异有统计学意义（P0.05）（表2）。图1 SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞活力的影响（*P0.05）2.2 重组SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞活力的作用 采用CCK-8法检测不同浓度的S蛋白对单核巨噬细胞活力的影响。结果如图1所示，与对照组相比，S蛋白浓度在100ng/ml与300ng/ml时，细胞活力明显升高，差异有统计学意义，在500ng/ml作用下有上升趋势，但差异无统计学意义。图2 SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞中炎症因子表达的影响。（*P0.05，*P0.01，*P 0.001）。2.3 重组SARS-CoV-2 S蛋白对炎症因子的影响 与对照组相比，IL-6表达在不同浓度S蛋白刺激下均明显升高，IL-1表达在300ng/ml和500ng/ml刺激下明显升高，而CCL2表达在100ng/ml和500ng/ml刺激下明显升高，差异有统计学意义（P0.05）（图2）。图3 SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞中JAK1/STAT1分子表达的影响。（*P0.05，*P0.001）。2.4 重组SARS-CoV-2 S蛋白对单核巨噬细胞JAK1/STAT1/NF-B表达的影响 与对照组相比，JAK1表达在100和500ng/ml S蛋白刺激下明显升高，而STAT1表达在100、300和500ng/ml S蛋白刺激下均明显升高，NF-B表达在300ng/ml和500ng/ml S蛋白刺激下明显升高，差异有统计学意义（P0.05）（图3）。100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白100ng/ml S蛋白对照组300ng/ml S蛋白500ng/ml S蛋白37 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.33 讨论 免疫系统在COVID-19患者发病中的作用日益受到关注，本研究观察COVID-19患者外周血常见免疫细胞水平，发现单核细胞与中性粒细胞比值高于对照组，而淋巴细胞和嗜酸性粒细胞低于对照组。许娇等8发现COVID-19患者的中性粒细胞和单核细胞数量明显升高，淋巴细胞水平降低，且重型/危重型患者淋巴细胞水平显著低于轻型/普通型患者；李永霞等9研究显示，COVID-19患者的淋巴细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞减少,与本研究一致。这些结果提示SRAS-CoV-2入侵机体后，可导致免疫平衡状态被打破，免疫细胞比例改变。单核巨噬细胞是感染早期反应的免疫细胞，过度激活释放出大量的炎症因子可加剧疾病进展10-11。单核巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。组织巨噬细胞主要来源于单核细胞，外周血单核细胞异常可能导致组织巨噬细胞的变化，因此，我们推测SARS-CoV-2可通过诱导单核巨噬细胞在疾病进展中发挥作用。为了探讨SARS-CoV-2是否对单核巨噬细胞存在直接作用，本研究以市售的单核巨噬细胞系为研究对象，使用SARS-CoV-2 S蛋白刺激小鼠巨噬细胞，发现炎症因子IL-6、IL-1与CCL2表达明显增多。在SARS-CoV-2的4种结构蛋白中，S蛋白是介导SARS-CoV-2感染人体细胞的重要结构，且突变位点最多，已受到许多研究者的重视12。研究发现S蛋白可刺激巨噬细胞分泌炎症因子13-14，证实S蛋白参与SARS-CoV-2引起的炎症反应。IL-6和IL-1是典型的促炎因子，在COVID-19炎症病理中发挥核心作用，IL-6和IL-1水平与COVID-19患者死亡率和病症程度密切相关13,15-16。作为趋化因子，CCL2可促进单核细胞聚集到病灶部位分化成巨噬细胞，进而分泌大量的促炎因子。已有研究发现，重型及危重型COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液有大量巨噬细胞，且外周血单核细胞与肺泡巨噬细胞有同样的细胞标志物17-18，进一步解释了肺炎发生时单核细胞与肺部巨噬细胞浸润密切相关。以上结果说明，SARS-CoV-2除可通过作用于靶细胞诱导巨噬细胞活化外，还可直接促进巨噬细胞分泌炎症因子，从而产生一系列级联“瀑布效应”19，促进急性肺损伤的发展。JAKs/STATs是多种细胞因子转导的重要信号通路，参与炎症反应、细胞增殖与分化过程。JAK1作为Janus激酶JAK家族成员之一，广泛存在于各种组织和细胞中，其活化后引起胞浆中的STAT1磷酸化，形成有活性的二聚化，转移入核内调节靶基因表达20。JAK1/STAT1通路能够被干扰素、白细胞介素和氧化应激等多种因子激活，许多病原体感染如流感病毒感染、SARS-CoV-2感染等，均具有调节JAK1/STAT1信号通路的作用21-22。NF-B是多条信号通路的交汇点，与JAK-STAT通路间存在交互作用23。本研究结果显示SARS-CoV-2 S蛋白刺激巨噬细胞后，JAK1、STAT1与NF-B表达水平明显增高，表明SARS-CoV-2可能通过激活JAK1/STAT1信号通路，调节NF-B的表达促进单核巨噬细胞分泌促炎因子，进而引起炎症反应。因此，早期抑制单核巨噬细胞中该信号通路的激活，可能是减轻肺部免疫病理损伤的重要手段。综上所述，本研究通过体外实验证实SARS-CoV-2病毒可直接刺激单核巨噬细胞产生炎症因子，其作用可能是通过调节JAK1/STAT1信号通路来实现的。本研究为今后免疫调节治疗提供了依据。参考文献1 WORLD HEAITH 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