稳定同位素标记氯霉素-D5的合成及表征.pdf

稳定同位素标记的氯霉素是以氘代甲苯为标记前体经硝化、溴化、氧化得到氘标记的对硝基苯甲醛对硝基苯甲醛再与手性中间体()伪二苯羟甲胺甘氨酸酰胺经醛酮缩合、还原、酰化等一系列反应制得 以甲苯物质的量计算氯霉素收率为 目标产物结构经核磁共振、质谱、高效液相色谱进行表征 氯霉素的化学纯度为 氘同位素丰度为 均优于外购标准品具有更优的纯度及更高的氘同位素丰度可作为同位素内标用于食品中氯霉素类药物的残留检测关键词:氯霉素稳定同位素标记合成同位素内标中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.().):().:收稿日期:网络首发日期:基金项目:上海市“科技创新行动计划”科学仪器领域项目()上海市专业技术服务平台项目()作者简介:汪榕()女安徽安庆人硕士初级工程师主要研究方向为有机标准品的合成通讯作者:陈武炼:.引用本文:汪榕郭会陈武炼.稳定同位素标记氯霉素的合成及表征.化学试剂():酰胺醇类抗生素也称氯霉素类抗生素包括氯霉素()、甲砜霉素()、氟苯尼考()等 氯霉素类药物是一种高效广谱抗生素在畜牧业以及水产养殖业中被广泛使用但氯霉素可导致人和动物再生障碍性贫血和免疫抑制 因此 年在我国农业部公告第 号将氯霉素及其盐、酯列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单中欧盟和美国也规定氯霉素在动物中禁止使用 甲砜霉素和氟苯尼考与氯霉素结构相似其抗菌活性和安全性均高于氯霉素因此广泛用于畜禽细菌感染性疾病但这些药物的大量使用也会对人体造成巨大伤害 食品安全国家标准 食品中 种兽药最大残留限量规定了动物性食品中甲砜霉素和氟苯尼考的最大残留限量均为 /近年来食品中氯霉素类药物的残留分析检测方法不断增多其中高效液相色谱串联质谱法(/)和超高效液相色谱串联质谱法(/)同位素内标法为氯霉素类药物的主要检测方法目前稳定同位素标记试剂氯霉素的合成鲜有文献报道 我国的氯霉素合成工艺主要是手性拆分法:以对硝基苯乙酮为原料经溴化、氨化、乙酰化、羟醛缩合、还原、拆分、二氯乙酰化制得 该方法通过对外消旋体进行拆分获得手性氯霉素原子经济性低 除此之外氯霉素还可通过手性诱导法不对称合成法:二苯甲第 卷第 期汪榕等:稳定同位素标记氯霉素的合成及表征胺与对硝基苯甲醛经缩合、不对称催化、开环、还原等合成 本文结合天然丰度氯霉素类化合物的合成方法设计出稳定同位素标记氯霉素的合成路线如图 所示图 氯霉素的合成路线.实验部分 主要仪器与试剂 型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)型真空旋转蒸发器(德国 公司)型核磁共振仪(德国 公司)型超高效液相色谱仪(美国 公司)液相 型三重四极杆质谱联用仪(美国 公司)甲苯(同位素丰度 南京昊绿生物科技有限公司)(同位素丰度 德国 公司)层析硅胶填料(/上海安谱实验科技股份有限公司)其他所用试剂均为市售分析纯除特别说明外可直接使用 实验方法 对硝基甲苯()的制备在 圆底烧瓶中加入 ()甲苯置于冰水浴中缓慢滴加 硝酸和 硫酸的预冷混合物将反应液在 搅拌 回至室温继续搅拌 反应结束后将混合物倒入 冰水中乙醚萃取()合并有机层并依次用 碳酸氢钠溶液、水洗涤两次无水硫酸钠干燥过滤浓缩得淡黄色液体柱层析提纯(洗脱剂:正己烷)得 淡黄色固体产率 对硝基苄溴()的制备在 圆底烧瓶中加入()化合物、()过氧化苯甲酰()、四 氯 化 碳 搅 拌 溶 解 ()溴代丁二酰亚胺()分 批加入 回流反应 降至室温抽滤滤液旋干得 粗产物 产率 此步得到的产品无需纯化可直接投入下一步反应 对硝基苯甲醛()的制备在 圆底烧瓶中 加入 ()化合物、()甲基吗啉氮氧 化 物()干 燥 的 四 氢 呋 喃()回流反应 监测反应完全降至室温旋干溶剂加水稀释乙醚萃取()合并有机层无水硫酸钠干燥抽滤浓缩柱层析(石油醚)()提纯得 淡黄色固体产率 ()(甲基亚氨基)二苯基乙酮()的制备在 圆底烧瓶中加入 ()苯偶酰、()甲胺盐酸盐、甲醇溶解后置于 油浴中搅拌下加入氢氧化钠水溶液(溶于 水中)升至 待固体完全溶解后停止反应降温析出晶体 减压过滤水洗滤饼滤液二次析出真空干燥得 白色固体产率 化学试剂 第 卷第 期此步得到的产品无需进一步纯化直接用于后续反应():()()()()()()()伪二苯羟甲胺()的制备称 取 ()氢 化 铝 锂()干燥的 于三颈烧瓶中将含 ()化合物 的 溶液置于恒压滴液漏斗中 低温下缓慢滴加监测反应完全依次加 水、(/)、水淬灭淬灭结束升至室温抽滤乙酸乙酯洗涤滤饼所得滤液浓缩乙酸乙酯溶解依次用饱和食盐水、水洗涤两次无水硫酸钠干燥抽滤 加硅胶旋干 柱层析()()得 白色固体产率(表示较小的非对映异构体峰):()()()()()()()()()()/:()伪二苯羟甲胺扁桃酸盐()的制备在三颈烧瓶中加入 ()化合物()、()扁桃酸、甲醇 搅拌直至固体溶解趁热过滤滤液在低温下静置析出 白色固体抽滤真空干燥产率 ()伪二苯羟甲胺()的制备向烧杯中加入 ()化合物、乙醚、(/)氢氧化钠水溶液室温搅拌直到所有固体溶解 随后将混合液转移到分液漏斗中用乙醚()萃取水层合并有机层无水硫酸钠干燥过滤浓缩滤液得到 灰白色固体产率(以投入化合物 物质的量计算)()伪二苯羟甲胺甘氨酸酰胺()的制备称取 ()甘氨酸于圆底烧瓶中 二氯甲烷溶解将反应液置于冰水浴中逐滴滴加 ()三乙胺随后滴加 ()新戊酰氯搅拌 二次滴加 ()三乙胺然后加入 ()()伪二苯羟甲胺()将反应液在 下搅拌 监测反应完全 缓慢加入 ()三氟乙酸加热至 反应 后监测中间体 甘氨酸酰胺完全消耗 低温旋蒸除去溶剂得到黄色油状物向残余物中加入 二氯甲烷溶解将混合物置于冰水浴中搅拌下缓慢加入 /氢氧化钠水溶液调节 将混合液转移到分液漏斗中水层用二氯甲烷萃取()合并有机层无水硫酸钠干燥过滤滤液减压浓缩得到白色粉末状残留物乙醇重结晶真空干燥得 白色固体产率(表示较小的非对映异构体峰):()()()()()()()()()()()/:()氨基羟基()羟基二苯基乙基甲基硝基苯丙酰胺()的制备 三 颈 烧 瓶 中 加 入 ()无水氯化锂 ()中间体氮气保护加入 无水 室温搅拌直至酰胺溶解将反应液降至 逐滴加入 (/)双(三甲基硅烷基)氨基锂()滴加完毕后转移至冰水浴反应 随后继续冷却至 逐滴加入 ()化合物 的 溶液 监测醛消耗完全 加入 饱和氯化铵溶液淬灭反应升至室温将反应液转移到装有饱和氯化铵和乙酸乙酯的分液漏斗中水层用乙酸乙酯萃取()合并有机层依次用饱和食盐水、水洗无水硫酸钠干燥过滤浓 缩 加 硅 胶 旋 干 柱 层 析()()得 白色固体产率():()()()()()/:第 卷第 期汪榕等:稳定同位素标记氯霉素的合成及表征 ()氨基(硝基苯基)丙二醇()的制备取 圆底烧瓶将 ()中间体 溶于 无水乙醇中加入 ()硼氢化钠()反应瓶浸入 油浴中搅拌反应 监测原料消耗完全降至室温小心加入饱和氯化铵溶液淬灭反应旋 蒸 除 去 溶 剂 柱 层 析 提 纯()()得 白色固体产率除此之外可回收 化合物()():()()()/:氯霉素()的制备取 圆底烧瓶将 ()中间体 悬浮于 甲醇逐滴加入 ()二氯乙酸甲酯滴加完毕后置于 油浴中搅拌反应 监测原料消耗完全降至室温浓缩反应液加硅胶旋干柱层析提纯()()得 白色固体产率 化学纯度:氘同位素丰度:():()()()()()()()():()()()()()()/:结果与讨论 氯霉素逆合成分析本文在 等报道的氯霉素的全合成方法基础上逆合成设计出氯霉素的合成路线如图 所示 天然丰度氯霉素可由()氨基羟基()羟基二苯基乙基甲基硝基苯丙酰胺经还原反应、酰化反应合成因此由()氨基羟基()羟基二苯基乙基甲基硝基苯丙酰胺可以合成得到氯霉素 而()氨基羟基()羟基二苯基乙基甲基硝基苯丙酰胺可由()伪二苯羟甲胺甘氨酸酰胺与对硝基苯甲醛缩合而成()伪二苯羟甲胺甘氨酸酰胺可参考文献方法合成对硝基苯甲醛可由甲苯通过硝化反应、溴化反应、氧化反应制得 因此通过逆合成分析可知以甲苯为起始原料可以合成得到氯霉素图 氯霉素的逆合成路线.核磁谱图氯霉素与氯霉素的核磁氢谱对比谱图如图 所示从中可以看出:()()()()()()()处的吸收峰一致而:()()()处的吸收峰均消失证明结构中苯环上以及苄位的 个氢全部被氘取代得到的化合物结构为氯霉素图 氯霉素与氯霉素的 谱图.纯度按照表 测试条件对氯霉素进行 纯度测试 测试结果见图 可得出氯霉素的 纯度为 化学试剂 第 卷第 期表 氯霉素的 测试条件.项测试条件色谱柱 ()柱温 流动相:乙腈:磷酸水梯度 流速 /检测器 样品 /于甲醇图 氯霉素的 谱图.及同位素丰度氯霉素经 检测其负离子模式的质谱图如图 所示 实测分子离子峰与理论计算结果()相符图 氯霉素的 谱图.同时采用“简易质量簇”法测定氯霉素的同位素丰度 通过质谱测得定量离子对、各自的峰面积并将其分别近似等于氯霉素、氯霉素、氯霉素、氯霉素、氯霉素、氯霉素的峰面积基于“质谱峰强度与分子数成正比例关系”这一检测基础归一化得到 各自的同位素丰度百分比最后通过公式()计算得到氯霉素的同位素丰度值为 没有出现同位素丰度明显稀释现象 ()/()其中为同位素丰度 为 标记的个数 为 个 标记的峰面积所占百分比以 个 标记为例计算公式为:()/()()()()()()为 标记的总数采用相同 纯度及同位素丰度检测方法与国外购买氯霉素标准品(德国 公司产品编号)对比所测纯度及同位素丰度数据如表 所示表 本文合成氯霉素与国外标品纯度及同位素丰度.测试项本文氯霉素外购标准品纯度 同位素丰度 :从上述表格可以看出本文合成氯霉素纯度及同位素丰度均优于 公司所购标品且 所占比例高达 远高于外购标品的 结论本文以甲苯为起始原料经过硝化、溴化、氧化、醛酮缩合、还原、酰化等一系列反应生成氯霉素以消耗的氘代试剂甲苯计算氯霉素收率可达到 该方法反应条件温和原料价廉易得且制备的手性诱导中间体可循环使用所得产品纯度高整个合成过程中未出现同位素丰度明显稀释现象与市售氯霉素标准品对比具有更优的纯度及更高的氘同位素丰度可作为同位素内标用于食品安全领域氯霉素的残留检测参考文献:李龙./法快速测定水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量.食品安全导刊():.中华人民共和国农业农村部公告第 号/.:/./.孙璐.食品中氟苯尼考测定研究进展.食品安全导刊():.第 卷第 期汪榕等:稳定同位素标记氯霉素的合成及表征郑陆红张慧琼陈茹等.超高效液相色谱串联质谱法同时测定动物组织中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和其代谢产物氟苯尼考胺残留量.现代食品():.农业农村部国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中 种兽药最大残留限量:.北京:中国标准出版社.毛娜孙志洪张丽./法测定养殖场土壤中 种常见抗生素微量残留.化学试剂():.马燕红李志刚陈超.食品中氯霉素类药物残留量检测方法研究进展.肉类研究():.罗瑞涟.超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法测定鱼肉中多种兽药残留.中国食品():.梁雪琪刘红曹磊磊等.前处理法/超高效液相色谱法串联质谱测定罗非鱼中 种酰胺醇类抗生素.广东化工():.仲伶俐雷欣宇李曦等.超高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中 种酰胺醇类抗生素残留.食品安全质量检测学报():.谢新开黄晓飞张金鑫等.一种氯霉素类化合物的制备方法:.谢新开黄晓飞张金鑫等.一种氯霉素的制备方法:.()().():.():.():.():.():.