香蕉果皮总黄酮提取工艺优化及抗氧化研究.pdf

2023年第36 卷第8 期香蕉果皮总黄酮提取工艺优化及抗氧化研究林宝妹，张帅，吴水金，李海明（福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建漳州36 30 0 5）摘要：以香蕉果皮为原料,以总黄酮得率为指标,在单因素试验的基础上利用响应面法优化果皮总黄酮的低共熔溶剂提取工艺，并对香蕉果皮总黄酮的抗氧化活性进行测定。结果表明：最佳提取工艺为低共熔溶剂1,2-丙二醇/氯化胆碱摩尔比3：1、温度8 8、时间40 min、料液比1：15.0（g/m L）、含水量50%，在此条件下香蕉果皮总黄酮得率为5.13%0.11%。优化提取的香蕉果皮总黄酮提取物清除DPPH和ABTS*的ICso分别为（16 46.9 0 12.0 7）g/mL和（147 4.7 2 33.8 2）g/mL,Fe3+还原能力为（0.42 0.0 1）mmol/g，对亚油酸脂质过氧化的抑制作用可达2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT)的7 8.0 3%，表明其具有良好的抗氧化活性。关键词：香蕉果皮；低共熔溶剂；总黄酮；抗氧化活性Study on extraction process optimization and antioxidantactivity of total flavonoids from banana peelLIN Bao-mei,ZHANG Shuai,WU Shui-jin,LI Hai-ming(Institute of Subtropical Agriculture,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Abstract:Using banana peel as raw material and the yield of total flavonoids as index,response surfacemethodology was used to optimize the deep eutectic solvent extraction process of total flavonoids from ba-nana peel on the basis of single factor experiment,and the antioxidant activity of total flavonoids from ba-nana peel was determined.The results showed that the optimal extraction process was as follows:molarratio of 1,2-propylene glycol/choline chloride with low eutectic solvent 3:1,temperature 88,t i me40 min,ratio of material to liquid 1:15.0(g/mL),and water content 50%.Under these conditions,the yield of total flavonoids in banana peel was 5.13%0.11%.The ICso of the optimized extraction oftotal flavonoids from banana peel for clearing DPPH and ABTS+:were(1 646.90 12.07)g/mLand(1 474.72 33.82)g/mL,respectively,and the reducing capacity of Fe3+was(0.42 0.01)mmol/g.The inhibitory effect on linoleic acid lipid peroxidation of 2,6-di-tert-butyl-4-methylphe-nol(BHT)was 78.03%,indicating that it had good antioxidant activity.Key words:banana peel;deep eutectic solvent;total flavonoids;antioxidant activity中图分类号：TS201.1香蕉是芭蕉科芭蕉属大型草本植物，广泛种植于亚洲、非洲、澳大利亚等热带、亚热带地区。香蕉果皮是家庭消费和加工过程的副产物，往往作为废弃物被丢弃。香蕉果皮中含有多糖、多酚、黄酮、类胡萝卜素和生物碱等多种活性成分,具有抗氧收稿日期：2 0 2 3-0 3-16基金项目：国家闽台特色作物种质资源圃（漳州）；福建省科技计划公益类专项（2 0 2 1R1030004）；漳州市自然科学基金项目(ZZ2021J15)作者简介：林宝妹（19 8 8 一），女，硕士，助理研究员，研究方向为天然产物化学。通信作者：李海明（19 7 5一），女，硕士，副研究员，研究方向为植物病理与生理学。粮食与油脂Zhangzhou 363005,Fujian,China)文献标志码：A95文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)0 8-0 0 9 5-0 6化、抑菌、降血糖等生物活性 2-3。黄酮是1种具有C6一C3一C6结构的植物次级代谢产物,具有抗癌、抗感染、抗氧化、抗炎等作用，在医药和化工行业有良好的应用前景 4。黄酮类化合物的提取方法主要有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提96取法、超临界CO2萃取法等；除超临界 CO2萃取法外,其他方法所用的溶剂一般为甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂与水的混合液,有一定的毒性并存在环境污染 5,且在利用其活性成分前一般要增加有机溶剂去除步骤。低共熔溶剂由于其低挥发性、低毒性、不易燃、相对溶解度高、易于合成等优点，可作为药物萃取、催化等领域所用传统挥发性有机溶剂的替代品 6 。此外,低共熔溶剂也可以作为活性成分的配方载体，不需溶剂的回收过程，直接应用于食品、化妆品及制药领域，也是其作为提取溶剂的优势 7 。本研究以香蕉果皮为原料，以总黄酮得率为指标，优化低共熔溶剂提取香蕉果皮总黄酮的工艺条件,并对果皮总黄酮提取物的抗氧化活性进行评价，以期为香蕉果皮总黄酮的提取及其产业发展提供理论参考。1材料和方法1.1材料与试剂香蕉（皇帝蕉），采自福建省农业科学院亚热带农业研究所国家闽台特色作物种质资源圃内(243258N，117 43 41 E）;2,4,6-三吡啶基三嗪（纯度9 9%），上海麦克林生化科技股份有限公司；芦丁（纯度9 8%），北京索莱宝生物科技有限公司;2,2 -联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（A BT S,纯度9 8%），美国西格玛奥德里奇公司；水溶性维生素E（T r o lo x，纯度9 8%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT,纯度9 8%）、1,1-苯基-2-苦肼基（DPPH,纯度9 8%），上海源叶生物科技有限公司;亚油酸、乙酸、氢氧化钠、盐酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、乙烯利、六水合氯化铁，分析纯;吐温2 0，化学纯；试验用水为纯化水。1.2仪器与设备L5S型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司;HH-600型水浴锅，金坛市新航仪器厂；CR22N型高速冷冻离心机，日本HIMAC日立公司；MGC-450HP人工气候箱，上海一恒科学仪器有限公司;iMARK酶标仪，美国BIO-RAD伯乐公司。1.3试验方法1.3.1工艺流程样品前处理低共熔溶剂浸提离心取上粮食与油脂清液一样品1.3.2样品前处理采摘后的香蕉，洗净表面灰尘后，浸泡于质量分数0.1%乙烯利中30 s,取出后晾干水分,置于人工气候箱中以温度2 5、相对湿度8 0%催熟。参考AURORE等 8 以果实颜色定义成熟度的标准，选择6 级果实为试验材料，即果实全黄且表皮无斑点；取果皮后以6 0 热风烘至恒定质量，粉碎过0.45 mm筛,备用。1.3.3总黄酮提取与测定分别用酸性（pH 3）、中性（pH 7）和碱性（p H 10)水溶液以及4种不同低共熔溶剂（表1）提取香蕉果皮总黄酮。取0.1g果皮粉末,分别加人5mL不同提取溶剂,40 水浴7 0 min,离心10 min（转速40 0 0 r/min）取上清液，备用。总黄酮含量测定采用NaNO2-Al（NO，）3-Na O H显色反应法 9 ,以芦丁为对照品，所得结果以原材料所含芦丁当量计算，mg/g。1.3.4得率的计算果皮总黄酮得率计算见式（1）。R=100%m2式中:R为果皮总黄酮得率,%;m为提取液中总黄酮质量，g;m为提取所用原材料质量，%。1.3.5低共熔溶剂的制备低共熔溶剂制备见表1。通过不同溶剂的比较，选择最优溶剂进行单因素试验。表1不同组分低共熔溶剂的制备编号氢键供体DES1乳酸DES2乳酸DES31,2-丙二醇DES4燕糖1.3.6单因素试验在仪器设定温度40、时间7 0 min、1,2-丙二醇/氯化胆碱体系摩尔比3:1、料液比1:50（g/mL）、溶剂含水量2 0%的基础上，进行单因素试验，考察温度、时间、摩尔比、料液比、含水量对果皮总黄酮得率的影响。1.3.7响应面试验设计根据单因素试验的结果,选取温度（A）、含水量2023年第36 卷第8 期(1)氢键受体摩尔比含水量/%乙酸钠3:1氯化胆碱3:1氯化胆碱3:1氯化胆碱3:1202020202023年第36 卷第8 期（B）、料液比（C)作为因素,以果皮总黄酮得率作为评价指标，运用DesignExpert10.0.7软件进行响应面试验设计。因素水平见表2。表2 响应面试验因素水平表因素水平A温度/-1750851951.3.88抗氧化能力测定DPPH清除能力、ABTS+清除能力和Fe3+还原能力(FRAP)参照MYO等 9 的方法测定,以Trolox为对照品。抗脂质过氧化能力参照文献 10-1 的方法,并稍作修改。于试管中加入4.0 mL1.0mg/mL样品或对照品、4.1mL体积分数2.51%亚油酸乳化液亚油酸、吐温-2 0 和pH7.0PBS缓冲液（浓度均为0.2 mol/L的KH,PO4、K,H PO 4按照体积比39:61配制）按照体积比2.51:5.2 2：9 2.2 7 配制、8.0mLPBS、3.9 m L去离子水,混匀,45水浴且避光6 d,取样,采用硫代巴比妥酸法 测定抗脂质氧化能力，以BHT为对照品1.4数据分析试验数据采用Excel2007进行计算分析；采用DesignExpert10.0.7软件进行响应面试验设计及相关性分析。2结果与分析2.1不同溶剂对果皮总黄酮得率的影响由图1可知：3种水溶液提取果皮总黄酮的得率为1.51%1.6 0%，低共熔溶剂提取果皮总黄酮的得率为0.7 5%2.6 4%，其中DES3和DES4提取效果明显高于3种水溶液,这与低共熔溶剂独有的3.002.502.001.50F1.00F王0.500DES1DES2DES3DES4酸性水性、碱性水溶液水溶液水溶液图1溶溶剂对果皮总黄酮得率的影响粮食与油脂理化性质密不可分，低共熔溶剂由氢键供体与氢键受体相互作用形成，溶液中带有正负离子，具有很强的分子间作用力，带电粒子一方面可与黄酮类成分结合以提高得率,另一方面也可能增加黄酮类化合物的稳定性 7 ,因此提取效果优于3种水溶液。B含水量/%C 料液比/(g/mL)351:5.0551:12.5751:20.0土97不同低共熔溶剂的提取效果也有较大区别，低共熔溶剂配位剂组成不同对其理化性质，如极性、物理化学相互作用、溶解度和黏度有较大影响，从而影响植物活性成分的提取 12 。因此,选择1,2-丙二醇/氯化胆碱低共熔体系作为后续的研究对象。2.2单因素试验2.2.1温度对果皮总黄酮得率的影响由图2 可知：随着温度的升高,果皮总黄酮得率呈先上升后下降的趋势，在6 57 5得率变化较小，在8 5时，得率达到最高，为3.6 2%，继续升高温度至9 5，得率迅速下降至3.14%。温度在5585的范围内，随着温度的升高，低共熔溶剂的黏度下降，传质效应提高，得率上升。继续升高温度,得率反而下降，这可能是因为温度过高对所提取的活性成分有一定破坏,其次温度升高使非目标成分溶出增加，溶液黏度升高，所提取活性成分溶出减少，最后过高的温度可能改变了低共熔溶剂分子间作用力与稳定性,最终导致得率下降 13-14。O因此，选择温度7 5 9 5进行后续响应面试验。5.004.003.002.001.00.55图2 温度对果皮总黄酮得率的影响2.2.2时间对果皮总黄酮得率的影响由图3可知：随着浸提时间的延长,果皮总黄酮得率呈先上升后下降的趋势，在2 0 10 0 min的范围内，果皮总黄酮得率为2.6 1%2.7 2%，波动较小。因此,将果皮黄酮提取时间固定为40 min进行后续响应面试验。J6575温度/8595982.2.3料液比对果皮总黄酮得率的影响由图4可知：果皮总黄酮得率随溶剂用量的增加,呈先上升后下降的趋势。在溶剂用量较少时，植物粉末未被充分浸润,溶剂与植物细胞的接触面积较小，总黄酮得率较低；随着溶剂用量的增加，溶剂与植物细胞的接触面积增大，总黄酮溶出增多，得率上升，在料液比为1：10.0（g/mL）时，达到最高，为3.48%；继续增加溶剂用量，得率持续下降，这可能是因为溶剂体积增加导致附着在单位提取体积上的能量变少,影响目标成分溶出 13.15。因此,选择料液比1:5.0 1:2 0.0（g/mL)进行后续响应面试验。5.004.00F3.00粮食与油脂5.00低共熔溶剂之间的相互作用 16 。在2:1 6:1的摩尔比范围内，果皮总黄酮得率为2.57%2.6 2%，4.00波动较小。因此,将低共熔溶剂的摩尔比固定为3：1进行后续响应面试验。3.00F4.003.502.003.001.0020图3日时间对果皮总黄酮得率的影响2023年第36 卷第8 期4060时间/min801002.50工2.001.501.002:1图5摩尔比对果皮总黄酮得率的影响2.2.5含水量对果皮总黄酮得率的影响由图6 可知：随着含水量的增加,果皮总黄酮得率呈明显的先上升后下降的趋势。含水量为55%的低共熔溶剂的总黄酮得率高于其他含水量的低共熔溶剂，这是因为加入水可以降低溶液的黏度，调节溶液的极性，有利于提高化合物的溶出速率；随着含水量的进一步增加，总黄酮得率反而降低，可能是因为高含水量会破坏低共熔溶剂与目标组分之间的相互作用 16 。因此,选择含水量35%75%进行后续响应面试验。5.004.003:11,2-丙二醇/氯化胆碱摩尔比4:15:16:12.001.001:5.0图4料液比对果皮总黄酮得率的影响2.2.4摩尔比对果皮总黄酮得率的影响由图5可知：当1,2-丙二醇/氯化胆碱的摩尔比在2：1 6:1时,果皮总黄酮得率呈先上升后下降的趋势，在摩尔比为3：1时，得率达到最高，为2.6 2%。氢键受体和氢键供体的摩尔比是低共熔溶剂形成的关键因素，摩尔比会改变低共熔溶剂的理化性质,如pH、极性、黏度和密度,从而影响目标产物与3.001J1:10.01:20.0料液比/(g/mL)2.001:30.01:40.01:50.01.0015图6 含水量对果皮总黄酮得率的影响2.3响应面提取工艺优化2.3.1响应面设计及结果试验方案及试验结果见表3。对数据进行多元线性回归分析，得到拟合方程：Y=5.01+0.082A-0.28 B+0.45 C+0.064 AB+0.10 AC+3555含水量/%75952023年第36 卷第8 期0.14 BC-0.15 A-0.45 B-0.79 C表3响应面优化设计与结果试验号A10213040506-1718-19-110011-11211311401501601702.3.2回归模型拟合及方差分析结果由表4可知：响应面模型P0.0001,表明二次表4拟合方程的方差分析结果变异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型6.31A0.054B0.65C1.6AB0.017AC0.041BC0.084A20.098B20.86C22.63残差0.049失拟项0.036纯误差0.013总变异6.36注：*表示差异极显著（P0.01）；*表示差异显著（P 0.0 5），不显著，说明模型成立。模型的决定系数R=0.9923,说明该模型试验值与预测值高度拟合；校BC-1-110000000-100-110011-10-1-1001-1100001190.710.05410.6511.610.01710.04110.08410.09810.8612.6370.006 96430.01240.003 21916DPPH ICso/(g/mL)1 646.90 12.0775.58 0.53一99总黄酮得率/%3.694.284.964.995.004.653.583.894.352.893.724.794.624.355.114.994.14100.74 0.000 17.690.027 692.68 0.000 1229.67 0.000 12.370.167 65.90.045 5120.010514.090.007 1123.94 0.000 1378.28 0.000 13.720.118 6表5果果皮总黄酮的抗氧化活性ABTS+ICso/(g/mL)1 474.72 33.82120.01 4.09一最佳提取工艺为低共熔体系1,2-丙二醇/氯化胆碱摩尔比3：1、温度8 8、含水量50%、料液比1：15.0（g/m L）、时间40 min,在此条件下总黄酮得率正决定系数Ra=0.98215,表明有9 8.2 5%的响应值变化可以用模型来解释，且R和 RAs,均接近1,说明模型准确性和通用性较高，用该模型预测果皮总黄酮的提取工艺条件较为可行。一次项B、C 和二次项中A、B、C有极显著影响（P0.01），一次项A和交互因素中AC、BC有显著影响（P0.05)。各因素对果皮总黄酮得率的影响大小依次为料液比 含水量 温度。2.3.3优化工艺验证利用Design-Expert10.0.7软件对模型进行预测,获得果皮总黄酮提取工艺的最佳条件为温度88.108、含水量50.0 54%、料液比1:14.59 9（g/mL）、时间40 min、1,2-丙二醇/氯化胆碱摩尔比3：1，此时果皮总黄酮得率的理论预测值为5.12%。为了试验的可操作性，将提取工艺参数修正为温度88、含水量50%、料液比1：15.0（g/mL）、时间40min、1,2-丙二醇/氯化胆碱摩尔比3：1,并进行3组平行验证实验，得到总黄酮得率为5.13%*0.11%，与理论值相比,相对误差为0.2%,说明该*模型可以较好地模拟和预测香蕉果皮总黄酮得率，*从而证明提取参数的可行性。*2.4香蕉果皮总黄酮的抗氧化能力*由表5可知：采用优化后工艺提取的果皮总黄*酮提取物具有一定的抗氧化能力,其清除DPPH*和ABTS+的ICso虽然都高于对照品，但是均低于*2 mg/mL。果皮总黄酮提取物的FRAP仅为Trolox的5.15%,但是在质量浓度均为1.0 mg/mL时,果皮提取物对亚油酸脂质过氧化抑制能力可达BHT的7 8.0 3%，说明香蕉果皮提取物具有较强的抗脂质过氧化能力。FRAP/(mmol/g)0.42 0.018.15 0.12一脂质过氧化抑制率/%69.27 0.33一88.77 0.66100为5.13%0.11%。果皮总黄酮提取物具有一定的自由基清除能力、铁离子还原能力以及较高的抗脂质过氧化能力，对提取物进行纯化、浓缩有望进一步提高抗氧化能力，具有作为油脂天然抗氧化剂开发的潜力。参考文献 1 FU N,JI M Y,ROUARD M,et al.Comparative plastomeanalysis of Musaceae and new insights into phylogenetic re-lationshipsJ.BMC Genomics,2022,23(1):223.【2 刘宁香蕉果皮的加工与利用 M北京：中国财富出版社，2 0 15.3】H I K A L W M,A H L H A H S A,BRA T O V C I C A,e t a l.Banana peels:A waste treasure for human being J.Ev-idence-Based Complementary and Alternative Medicine,2022,2022:7616452.4 SHAMSUDIN N F,AHMED Q U,MAHMOOD S,et al.Flavonoids as 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