芜菁子挥发油提取物抑菌条件研究.pdf

芜菁子挥发油提取物抑菌条件研究芦 珂李静燕何靖柳*刘 凤钟远扬陈 洪辜凤玉（雅安职业技术学院药学与检验学院，四川雅安 625100）摘要本文通过水蒸气蒸馏法制得芜菁子挥发油提取物，选取鲜切果蔬中常见病原菌单核细胞增生李斯特菌作为供试菌，用芜菁子挥发油提取物在室温 25 条件下对单核细胞增生李斯特菌进行短时间挥发接触抑菌处理后，模拟鲜切果蔬的低温储藏温度、pH 值环境进行单核细胞增生李斯特菌培养。以最小抑菌浓度为考察指标，开展单因素试验，并应用培养温度、处理时间、培养基 pH 值 3 因素 3 水平正交试验优化抑菌处理条件。结果表明：在培养温度 10、处理时间 25 min、培养基 pH 值 5 的条件下，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度为 0.005 6%，且抑菌空间内感官评价为极轻微异味、不刺鼻、不刺眼，比常规试验的最小抑菌浓度降低了 65.85%，抑菌效果得到提升，抑菌空间内的异味减少。该抑菌处理条件稳定、合理、可行，可为芜菁子挥发油提取物的综合利用提供参考。关键词芜菁子；挥发油提取物；单核细胞增生李斯特菌；抑菌处理；培养温度；处理时间；培养基 pH 值；最小抑菌浓度中图分类号TS255.3文献标识码A文章编号 1007-5739（2023）18-0193-04DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.18.047开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Antibacterial Conditions of Volatile Oil Extracts from Seeds of Brassica rapa L.LU KeLI JingyanHE Jingliu*LIU FengZHONG YuanyangCHEN HongGU Fengyu(Department of Pharmacy and Medical Laboratory,Yaan Polytechnic College,Yaan Sichuan 625100)AbstractThis paper obtained the volatile oil extract of the seeds of Brassica rapa L.by steam distillation,andtook the common pathogenic bacterium Listeria monocytogenes in fresh cut fruits and vegetables as the test bacterium,used the volatile oil extracts of seeds of Brassica rapa L.to carry out short-term volatile contact bacteriostasis treatmenton Listeria monocytogenes at room temperature of 25,simulated the low temperature storage temperature and pHvalue of fresh cut fruits and vegetables to culture Listeria monocytogenes.With the minimum inhibitory concentration asthe index,this paper carried out the single factor experiment and the orthogonal test of three factors and three levels,including culture temperature,treatment time and the culture medium pH value,in order to optimize the antibacterialtreatment conditions.The results showed that under the conditions of culture temperature of 10,treatment time of25 min,and culture medium pH value of 5,the minimum inhibitory concentration of volatile oil extracts from seeds ofBrassica rapa L.against Listeria monocytogenes was 0.005 6%,and the sensory evaluation in the inhibitory space wasvery slight odor,not pungent,not dazzling,which was 65.85%lower than the minimum inhibitory concentration in theroutine test.The antibacterial effect was improved,and the odor in the inhibitory space was reduced.The antibacterialtreatment conditions are stable,reasonable and feasible,which can provide references for the comprehensive utilizationof volatile oil extracts from seeds of Brassica rapa L.Keywordsseed of Brassica rapa L.;volatile oil extract;Listeria monocytogenes;antibacterial treatment;cultivationtemperature;treatment time;the culture medium pH value;minimum inhibitory concentration基金项目 雅安职业技术学院高层次人才科研工作室项目“川蜀农产品保鲜技术研发工作室”（Yzygcky202218）。第一作者 芦珂（1984），女，硕士，讲师。研究方向：病原微生物。E-mail：*通信作者 E-mail：收稿日期 2023-01-06现代农业科技2023 年第 18 期食品科学193现代农业科技2023 年第 18 期食品科学鲜切果蔬的防腐保鲜是近年来生物防腐剂应用的一个热门领域。鲜切果蔬在切割和包装过程中可能会被病原微生物污染1。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是广泛存在的致病菌，在 445 条件下均能生长，最适生长温度为 3537，在pH 值中性至弱碱性（pH 值 9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下生长良好，在 pH 值 3.84.4 时可以缓慢生长2。由于其在低温下仍然可以生长繁殖，即使鲜切果蔬采取低温保存方式，也容易造成鲜切果蔬污染3。芜菁（Brassica rapa L.），别名蔓菁，又称诸葛菜、大头菜、圆菜头、圆根、盘菜等，在我国各地均有栽培4。芜菁子为十字花科植物芜菁干燥、成熟的种子，别名蔓菁子，是一种维吾尔族医药中的常用中药5-7，民间以芜菁子油为药用。王建玲等8采用水蒸气蒸馏法提取的芜菁子挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌具有一定的抑菌作用，其中高含量的异硫氰酸酯类和腈类化合物为主要抑菌物质。依据雅安职业技术学院 2020 年自然科学类重点科研项目“基于生物防腐剂开发的不同提取方式下芜菁子提取物抑菌效果研究”（YZY2020ZKA03）发现，芜菁子挥发油提取物在 37 条件下对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、黑曲霉均有比较明显的抑菌效果9。本试验通过水蒸气蒸馏法制得芜菁子挥发油提取物，选取鲜切果蔬中常见病原菌单核细胞增生李斯特菌作为供试菌，用芜菁子挥发油提取物在室温25 条件下对单核细胞增生李斯特菌进行短时间挥发接触抑菌处理后，模拟鲜切果蔬的低温储藏温度、pH 值环境进行单核细胞增生李斯特菌培养。通过正交试验考察培养温度、处理时间、培养基 pH 值 3 种因素对芜菁子挥发油提取物抑制单核细胞增生李斯特菌活性的影响10，确定在不影响抑菌空间内感官评价的前提下芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌达到最佳抑菌效果的作用条件。1材料与方法1.1材料及仪器1.1.1试验材料供试材料包括：芜菁子，产自新疆伊犁；单核细胞增生李斯特菌（编号 CMCC（B）54002），由上海鲁微科技有限公司生产）；MHA 培养基，由青岛日水生物技术有限公司生产；MHB 培养基、庆大霉素药敏纸片，由杭州微生物试剂有限公司生产；维生素 C 片，由湖北华中药业有限公司生产；氯化钠，由成都市科龙化工试剂厂生产；邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠，由成都市科隆化学品有限公司生产。1.1.2仪器与设备供试仪器有气浴振荡器（ZWYR-2102C 型，上海智城分析仪器制造有限公司）、立式高压蒸汽灭菌锅（YQS-LS-100SII 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、电热恒温干燥箱（202-2AB 型，北京科伟永兴仪器有限公司）、电热恒温培养箱（GHP-9160（A）型，上海丙林科技有限公司）、超净工作台（SW-CJ-2FD型，苏州安泰空气技术有限公司）、电子调温电热套（DZTW 型，上海科恒实业发展有限公司）、医用冷藏箱（HYC-391 型，青岛海尔生物医疗股份有限公司）、电子天平（ME204E 型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、移液枪（YE19AAM0050321 型和 YE189AL0142686 型，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）、小型粉碎机（F160 型，北京中兴伟业仪器有限公司）、数显水浴锅（HH-S6A 型，北京科伟永兴仪器有限公司）、挥发油测定器（1788-DSJ00005 型，北京北玻博美玻璃有限公司）、细菌浊度仪（WGZ-XT 型，杭州齐威仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1芜菁子挥发油提取选取洁净、无杂质的芜菁子，粉碎，过 40 目筛，得芜菁子粉末。称取芜菁子粉末 200 g，加到 2 000 mL圆底烧瓶中，加蒸馏水 100 mL、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液（pH 值=7.0）400 mL、维生素 C 片 0.4 g，加防爆玻璃珠 20 粒，充分混匀，加玻璃塞，40 水浴水解 2 h。参照文献9和11提取芜菁子挥发油。向挥发油测定器中加入蒸馏水检验密闭性，一端连接圆底烧瓶加电热套，一端连接回流冷凝管。回流冷凝管通水，将电热套电压调至 120 V，开始加热，沸腾之后，将电压调至 100 V 持续蒸馏约 5 h，直到油层不再增加时停止加热，静置后读取芜菁子挥发油提取量，将芜菁子挥发油提取物放出，称重，置于 4 条件下密闭避光保存，待用。芜菁子挥发油提取率12-13的计算方法具体如下：芜菁子挥发油提取率（%）=芜菁子挥发油提取物质量/芜菁子原料质量100。1941.2.2供试细菌悬液制备使用无菌棉签挑取已经通过分区划线培养复壮的单核细胞增生李斯特菌，加入 3 mL 无菌蒸馏水，经过对比稀释配制成麦氏比浊度为 0.5 的供试细菌悬液。1.2.3菌层平板制备用无菌棉签蘸单核细胞增生李斯特菌悬液在MHA 平板表面均匀涂布，静置 3 min，待用。1.2.4芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果1）单因素试验。参照 Liu 等14-15和 He 等16的试验方法，并略作修改，以没有单核细胞增生李斯特菌生长的芜菁子挥发油提取物最小体积分数确定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）17。取一片直径 6 mm 的无菌干燥滤纸片置于单核细胞增生李斯特菌层 MHA 平皿盖子中央，将 MHA 平板培养基的 pH 值控制在 59（pH 值梯度为 1），分别吸取420 L（加样梯度为 2 L）芜菁子挥发油滴至滤纸片上，使芜菁子挥发油占培养皿内剩余空间体积分数为0.005 6%0.027 2%（浓度梯度为 0.002 7%），用保鲜膜严密包裹培养皿16，在室温 25 条件下倒置 525 min（处理时间梯度为 5 min）后，在无菌条件下将培养皿盖迅速换为事前贴有无菌生理盐水滤纸片的培养皿盖，用保鲜膜严密包裹培养皿，然后分别在 525（温度梯度为 5）条件下倒置培养。上述单因素试验均分别设置了空白对照组（CK），以空白对照组（CK）长出菌落的时间作为各处理组观察时间，观察各处理组单核细胞增生李斯特菌的生长情况。3 次重复。2）正交试验。在单因素试验基础上，选择培养温度（A）、处理时间（B）、培养基 pH 值（C）3 因素 3 水平进行正交试验，具体见表 1。3）抑菌处理条件优化后的验证试验。为验证正交试验的结果和重现性，在最佳抑菌处理条件（培养温度 10、处理时间 25 min、培养基 pH 值 5）下，进行芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌试验，3 次平行试验，并以常规试验处理（培养温度 15、处理时间 15 min、培养基 pH 值 7）作对照（CK）。2结果与分析2.1芜菁子挥发油提取率芜菁子挥发油提取物为黄色油状，微溶于水，味刺鼻，辣眼睛，接触皮肤有灼烧感。本文方法所得芜菁子挥发油的提取率为 0.3%。2.2单因素试验2.2.1培养温度对抑菌效果的影响由图 1 可知，在处理时间 15 min、培养基 pH 值 7的条件下，当培养温度分别为 5、10、15、20、25 时，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度分别为 0.011 0%、0.013 7%、0.016 4%、0.024 5%、0.027 2%。随着培养温度的升高，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度逐渐增大，即抑菌效果逐渐减弱。温度越高，越有利于单核细胞增生李斯特菌的生长繁殖，从而使芜菁子挥发油提取物的抑菌效果减弱。当培养温度为5 时，抑菌效果最好。2.2.2处理时间对抑菌效果的影响由图 2 可知，在培养温度 15、培养基 pH 值 7的条件下，当处理时间分别为 5、10、15、20、25 min 时，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度分别为 0.021 8%、0.019 1%、0.016 4%、0.011 0%、0.008 3%。随着芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌处理时间的增加，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度逐渐减小，即抑菌效果逐渐增强。处理时间越久，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑制作用越强。当处理时间为 25 min 时，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果最好。表 1正交因素水平水平123因素处理温度（A）/51015处理时间（B）/min152025培养基 pH 值（C）567图 1培养温度对抑菌效果的影响最小抑菌浓度/%0.0300.0250.0200.0150.0100.0050510152025培养温度/芦 珂等：芜菁子挥发油提取物抑菌条件研究195现代农业科技2023 年第 18 期食品科学2.2.3培养基 pH 值对抑菌效果的影响从图 3 可以看出，在培养温度 15、处理时间15 min 的条件下，当培养基 pH 值分别为 5、6、7、8、9时，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度分别为 0.008 3%、0.013 7%、0.016 4%、0.021 8%、0.024 5%。随着培养基 pH 值的增加，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度逐渐增大，即抑菌效果逐渐减弱。培养基 pH值越大，越有利于单核细胞增生李斯特菌的生长繁殖，从而使芜菁子挥发油提取物的抑菌效果减弱。当培养基 pH 值为 5 时，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果最好。2.3正交试验由表 2 可知，各试验因素对抑菌效果均有影响，影响程度由大到小表现为 BCA，即处理时间对抑菌效果影响最大，培养基 pH 值次之，培养温度影响最小。最小抑菌浓度越小，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果越好。因此，本试验中K 值越小表示芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果越好。比较各列 K 值，得到最佳组合水平是 A2B3C1，即优化后的抑菌处理条件为培养温度 10、处理时间 25 min、培养基 pH 值 5。2.4抑菌处理条件优化后的验证试验验证试验的最小抑菌浓度为 0.005 6%，抑菌空间内感官评价为极轻微异味、不刺鼻、不刺眼。常规试验的最小抑菌浓度为 0.016 4%，抑菌空间内感官评价为轻微异味、不刺鼻、不刺眼。验证试验的最小抑菌浓度比常规试验的最小抑菌浓度降低了 65.85%，抑菌效果得到了明显的提升，且抑菌空间内的异味评价减少。3结论试验表明，在培养温度 10、处理时间 25 min、培养基 pH 值 5 的条件下，芜菁子挥发油提取物对单核细胞增生李斯特菌的最小抑菌浓度为 0.005 6%，且抑菌空间内感官评价为极轻微异味、不刺鼻、不刺眼，比常规试验（培养温度 15、处理时间 15 min、培养基 pH 值 7）最小抑菌浓度降低了 65.85%，抑菌效果得到明显的提升，抑菌空间内的异味减少。该抑菌处理条件稳定、合理、可行，可为芜菁子挥发油提取物的综合利用提供参考。参考文献1 马金晶，李凤琴，黄敏毅，等.鲜切果蔬中食源性致病菌污染研究进展J.食品安全质量检测学报，2021，12（7）：2591-2599.2 TE GIFFEL M C，ZWIETERING M H.Validation of predic-tivemodels describingthegrowthofListeriamonocytogenesJ.International Journal of Food Microbiology，1999，46（2）：135-149.3 白伟娟，李长城，贾真，等.鲜切雪莲果中单增李斯特菌生长动力学研究J.食品工业，2018，39（2）：202-206.（下转第 220 页）图 2处理时间对抑菌效果的影响最小抑菌浓度/%0.0250.0200.0150.0100.0050510152025处理时间/min图 3培养基 pH 值对抑菌效果的影响最小抑菌浓度/%0.0250.0200.0150.0100.005056789培养基 pH 值表 2正交试验结果处理123456789K1K2K3R培养温度（A）1231231230.010 10.009 20.010 10.000 9处理时间（B）1232313120.012 80.009 20.007 40.005 4培养基pH 值（C）1233122310.008 30.010 10.011 00.002 7最小抑菌浓度/%0.011 00.008 30.008 30.011 00.005 60.013 70.008 30.013 70.008 3196现代农业科技2023 年第 18 期农村经济学参考文献1 赵明，吴立珍.连云港市水产养殖业自身污染现状及防治对策J.河北渔业，2011（3）：20-24.2 罗日霞，郑绮婷，陈玮，等.渔村振兴的发展问题研究：以湛江市生蚝养殖村为例J.农村经济与科技，2022，33（5）：149-152.3 陈万怀.文旅融合背景下宁波海洋渔村发展问题及对策J.宁波经济（三江论坛），2022（2）：44-48.4 章晓红.六安市休闲渔业发展现状及对策J.现代农业科技，2013（17）：336-337.5 王聪聪.浅析影响渔民收入的因素：以江苏省连云港市为例J.山西农经，2015（5）：60-61.6 赵乙丞，焦晓燕.海岛休闲渔村振兴高质量发展路径研究：以庄河市黑岛镇黑岛村为例J.河北渔业，2022（8）：34.（上接第 211 页）3结语第三次全国国土调查数据是国土空间各类规划的重要基础数据，作为详细规划、相关专项规划的现状底图底数需按照用地用海分类进行转换处理。本文通过对工作分类及用地用海分类进行衔接分析，提出了用于国土空间详细规划的底图底数转换方案，以期为国土空间规划及相关专项规划的编制提供科学参考。参考文献1 中华人民共和国自然资源部.第三次全国国土调查技术规程：TD/T 10552019S.北京：地质出版社，2019.2 自然资源部办公厅.国土空间调查、规划、用途管制用地用海分类指南（试行）Z.2020.3 吴多，熊伟.基于“三调”数据的国土空间规划底图建设：以武汉市为实例J.中国国土资源经济，2022，35（3）：53-60.4 陈亚凯，白鑫，项广鑫.基于第三次国土调查成果的国土空间规划底图制作研究J.国土资源导刊，2021，18（1）：42-46.（上接第 196 页）4 董海艳.超临界二氧化碳萃取芜菁子油及其成分分析D.南京：南京农业大学，2010.5 新疆维吾尔自治区卫生厅.新疆维吾尔自治区药材标准：上册S.乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1993.6 李敏，代文洁，孙莲.芜菁子中异硫氰酸丙烯酯的薄层色谱鉴别和含量测定J.西北药学杂志，2017，32（3）：284-286.7 孙莲，哈普拉 托留汗.芜菁子中 2-苯乙基异硫氰酸酯的分析J.化学研究与应用，2019，31（8）：1533-1537.8 王建玲，刘素辉，段矗，等.芜菁子挥发油、多糖的组成及挥发油抗菌活性的研究J.食品安全质量检测学报，2020，11（4）：1207-1214.9 芦珂，徐赛，何靖柳，等.芜菁子挥发油提取物对鲜切果蔬中常见微生物的抑菌效果研究J.食品与发酵科技，2022，58（5）：25-32.10 刘宽博，熊利霞，刘慧，等.抗单增李斯特菌枯草芽孢杆菌 C3 增菌培养条件优化J.中国酿造，2016，35（2）：48-52.11 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020 年版：四部M.北京：中国医药科技出版社，2020.12 程嘉莉，马江，肖爱华，等.不同干燥方式对红花玉兰花蕾挥发油成分及抗氧化、抗菌活性的影响J.食品科学，2020，41（19）：132-139.13 丁月，叶仁凤，欧昌荣，等.加拿大一枝黄花精油的提取及对灰霉菌抑制作用的研究J.食品工业科技，2015，36（6）：153-156.14 LIU J，TIAN S P，MENG X H，et al.Effects of chitosan oncontrol of postharvest diseases and physiological responsesof tomato fruitJ.Postharvest Biology and Technology，2007，44（3）：300-306.15 LIU J，ZONG Y Y，QIN G Z，et al.Plasma membrane da-mage contributes to antifungal activity of silicon againstPenicillium digitatumJ.Current Microbiology，2010，61（4）：274-279.16 HE J L，WU D T，ZHANG Q，et 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