烯壳氮化铁纳米磁珠用于捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 4 期 628 636Current Biotechnology ISSN 20952341技术与方法技术与方法Techniques and Methods烯壳氮化铁纳米磁珠用于捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究马文博1，潘逸群1，王群2，马壮2，王明连1*，杨怡姝1*1.北京工业大学环境与生命学部，北京 100124；2.北京工业大学材料与制造学部，北京 100124摘 要：存在于血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）在癌症的复发与转移中发挥重要作用，因此对循环肿瘤细胞的捕获已成为当前癌症研究的关键问题。抗体依赖性免疫磁珠捕获CTC的方法具有操作简便、快捷等特点，但存在样本量需求大和制备成本昂贵等问题。拟采用一种新型磁珠等离子体修饰的烯壳氮化铁纳米磁珠（graphene-coated iron nitride magnetic beads,GFeN-MB）开展捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究。GFeN-MB由多层石墨烯包覆，内核为氮化铁，与常用的氧化铁内核相比具有更强的磁响应性。石墨烯作为磁珠包覆壳层，相比市面上磁珠常用的SiO2壳层具有更低的质量、更高的稳定性和更好的生物相容性。将氨基烯壳氮化铁磁珠与羧基烯壳氮化铁磁珠分别通过直接吸附法和碳二亚胺法制备2种链霉亲和素磁珠，并偶联CTC表面标志物上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的抗体制备氨基免疫磁珠（amino immuno magnetic bead,AIMB）与羧基免疫磁珠（carbaxylic immunomagnetic bead,CIMB）。结果显示，2种免疫磁珠均可捕获A549细胞，AIMB的捕获效率略高于CIMB；为了模拟CTC捕获环境，取健康人血与A549细胞混合制备不同浓度的细胞混液，并利用捕获效率更高的AIMB捕获人血A549细胞，计算被捕获的A549及捕获效率，结果显示，AIMB捕获效率从66.25%81.50%不等。研究结果证明了基于GFeN-MB制备免疫磁珠方法的可行性，得到的AIMB可以用于肺癌CTC分选，展现出其应用于临床研究的前景。关键词：循环肿瘤细胞；烯壳氮化铁磁珠；石墨烯；细胞分选DOI：10.19586/j.20952341.2023.0037 中图分类号：R734.2 文献标志码：APreliminary Study on the Application of Graphene-coated Iron Nitride Magnetic Beads to Capture Lung Cancer Circulating Tumor CellsMA Wenbo1，PAN Yiqun1，WANG Qun2，MA Zhuang2，WANG Minglian1*，YANG Yishu1*1.Faculty of Environmental and Life，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.Faculty of Materials and Manufacturing，Beijing University of Technology，Beijing 100124，ChinaAbstract：Circulating tumor cells（CTCs）present in the blood play important roles in cancer recurrence and metastasis，so the capture of CTCs has become a key issue in current cancer research.The method of using antibody-dependent immunomagnetic beads to capture CTCs has the characteristics of simple operation and rapidity，but there are problems such as large sample size requirement and high preparation cost.This study intended to use a new type of magnetic bead-plasma-modified graphene-coated iron nitride magnetic beads（GFeN-MB）to carry out a preliminary study on the capture of circulating tumor cells in lung cancer.GFeN-MB is covered by multi-layer graphene，and the core is iron nitride，which has stronger magnetic response than the commonly used iron oxide core.Graphene used as a magnetic bead coating shell has lower mass，higher stability and better biocompatibility than the SiO2 shell commonly used for magnetic beads on the market.In this study，two kinds of streptavidin magnetic beads were prepared by direct adsorption method and carbodiimide method respectively，and coupled with CTCs surface markers epithelial cell adhesion molecule（EpCAM）antibody preparation amino immunomagnetic beads（AIMB）and carboxylic immunomagnetic beads（CIMB）.The results showed that both kinds of immunomagnetic beads could capture A549 cells，and the capture efficiency of AIMB was slightly 收稿日期：20230324；接受日期：20230428联系方式：马文博 E-mail:；*通信作者 王明连 E-mail:；杨怡姝 E-mail:yishu-马文博，等：烯壳氮化铁纳米磁珠用于捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究higher than that of CIMB；in order to simulate the CTCs capture environment，healthy human blood was mixed with A549 cells to prepare cell mixtures of different concentrations，and the capture efficiency was higher by using AIMB captures A549 in human blood，and calculated the captured A549 and capture efficiency.The results showed that the capture efficiency of AIMB ranged from 66.25%to 81.50%.The feasibility of the method of preparing immunomagnetic beads based on GFeN-MB was proved，and the obtained AIMB can be used for the sorting of lung cancer CTCs，showing the prospect of its application in clinical research.Key words：circulating tumor cells；graphene-coated iron nitride magnetic bead；graphene；cell sorting肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，40%的肺癌患者有转移现象1，5年生存率较低2，转移是癌症相关死亡的主要原因3-4。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称5，具有在接种于生态位组织后建立转移性生长的能力，是肿瘤最常见的转移途径6-7。CTC的识别、捕获和分析已成为当前癌症研究中的关键问题8-9。但CTC的半衰期小于3 h10，且在数百万正常血细胞背景下，CTC的浓度非常低11-12，因此，需要开发专业化的分选技术。非抗体依赖性的微流体技术分选 CTC存在捕获率低和纯度低的问题13-14。在乳腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤细胞表面的上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）表达量远高于正常细胞15-16，因此常采用基于EpCAM抗体的 CTC捕获方法17，但由于样本量需求大、制备成本昂贵等原因无法普及18-19，且现有的免疫磁珠与细胞的生物相容性很低。王群等20报道了一种全新的纳米磁珠，即本研究使用的烯壳氮化铁纳米磁珠（graphene-coated iron nitride magnetic beads，GFeN-MB），该磁珠为多层石墨烯片包覆的氮化铁纳米磁性颗粒。内核氮化铁相较于传统的氧化铁磁性材料，既具有与纯Fe相近的饱和磁化强度，又和氧化铁一样有很强的抗氧化性和耐腐蚀能力，在应用方面更具优势21。外层的石墨烯壳不仅对内部的氮化铁起到抗氧化、耐酸碱等保护作用，还具有结构稳定、生物相容性好和比表面积较高等优势，有利于细胞分选。此前，本课题组利用Hummers法修饰GFeN-MB，将其用于 T 细胞分选22和特异性捕获假病毒23。但 Hummers 法利用浓硫酸氧化磁珠，反应过于强烈，容易将表面石墨烯破坏使磁性核漏出，导致壳核结构破坏以及磁性能下降。低温等离子体法修饰磁珠具有温和可控的特点，不会对石墨烯壳造成较大破坏，目前在分选细胞领域有较大潜力，但尚未有报道显示等离子体修饰磁珠在CTC捕获方面的应用。本研究拟采用等离子体修饰的不同基团的磁珠分别与链霉亲和素结合，由于链霉亲和素与生物素具有极高的亲和力，因此将抗体生物素化偶联至链霉亲和素磁珠进一步制备免疫磁珠，用于捕获CTC。同时，参照已有研究向小鼠或人血液样本中添加不同数量的A549肺癌细胞24-26，以模拟CTC在体内的存在情况，进而探讨免疫磁珠对CTC的捕获能力。1材料与方法1.1磁性颗粒、细胞和全血GFeN-MB：烯壳氮化铁纳米磁珠，由北京工业大学材料与制造学部制备并提供。具有明显的壳核型结构，外壳为石墨烯碳壳，壳本身结构稳定，不易与周围环境相互作用，具有保护内核，防止内核被腐蚀等作用；内核为氮化铁材料，磁响应性优于氧化铁材料。肺癌细胞A549由本实验室保存，昆明小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，人血液样本由健康志愿者提供。1.2等离子体氨化/氧化GFeN-MB在微波等离子体装置（北京工业大学材料与制造学部）中，使用2.45 GHZ微波源激发等离子体，打开石墨烯的C-C键，使石墨烯表面形成C-N键或 C=O 键。通入 NH3、N2等气体，激发 NH3、N2等离子体，使 GFeN-MB 连接氨基等含氮基团，制备氨基烯壳氮化铁磁珠（graphene ammoniated iron nitride magnetic bead，GAFeN-MB）。通入CO2、O2等气体，激发CO2等离子体，使GFeN-MB连接羧基等含氧基团，制备羧基烯壳氮化铁磁珠（graphene oxide-coated iron nitride magnetic bead，GOFeN-MB）。GOFeN-MB表面羧基可以与物质的氨基端相连。使用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM，JEOL公司）观察629生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology等离子体改性后的磁珠壳核结构是否完整，使用红外光谱（fourier transform infrared，FTIR，BRUKER公司）分析磁珠表面官能团。1.3GAFeN-MB 与 GOFeN-MB 吸附能力比较将1 mg磁珠用去离子水清洗一次，用100 L PBS溶液溶解，加入1 mL浓度为1 mg mL-1的BSA（QIAGEN公司），常温下在混合器上反应 2 h，吸取上清，参照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测未吸附蛋白量。按照公式（1）计算磁珠吸附蛋白量。用纯水洗涤磁珠，检测蛋白在磁珠上的结合紧密程度。吸附蛋白量=总蛋白量-未吸附蛋白量（1）1.4免疫磁珠的构建1.4.1氨基免疫磁珠的构建利用直接吸附法将链霉亲和素（streptavidin，SA，北京索莱宝科技有限公司）与GAFeN-MB结合。取1 mg GAFeN-MB用去离子水清洗一次，用100 L PBS溶解，加入200 L 1 mg mL-1 SA，常温下混合反应2 h，用PBS洗涤 3次，去除未反应的 SA，然后加入 1 mL浓度为1 mg mL-1 BSA溶液，4 下混合反应过夜，封闭磁珠，防止非特异性吸附。将制备的氨基链霉亲和素磁珠（amino-streptavidin magnetic bead，A-SAMB）用纯水洗涤3次，溶解在900 L PBS中，4 储存备用。按照说明书将EpCAM抗体（ThermoFisher公司）进行生物素化，将反应后的混合溶液加入至截留量50 kD超滤管（Millipore公司）中，加入纯水补至500 L，4 下12 500 r min-1离心15 min，弃去外管溶液，再补纯水至500 L，再次离心，重复3次，洗去过量生物素，3 000 r min-1离心2 min，浓缩样本至约200 L。连接A-SAMB与生物素化的抗体。将200 L生物素化的EpCAM抗体加入至900 L的A-SAMB溶液中，置于冰上反应10 min，制备氨基免疫磁珠（amino immunomagnetic bead，AIMB）。磁吸附聚集 AIMB 后用 PBS洗涤，除去未反应的生物素化抗体，并溶解在1 mL PBS中，4 储存备用。1.4.2羧基免疫磁珠的构建通过碳二亚胺活化反应，将带有羧基的GOFeN-MB与带有氨基的链霉亲和素偶联。具体步骤为：取1 mg GOFeN-MB用去离子水清洗1次，用25 mmol L-1 2-（N-吗咻基）乙磺酸溶液（MES，pH 5.4，北京百灵威科技有限公司）润洗2次。加入900 L 10 mg mL-1 N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS，上海共价化学科技有限公司）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺溶液（EDC，北京迈瑞达科技有限公司）。室温混合反应10 min后，吸去上清液，用MES溶液清洗磁珠3次，除去剩余的NHS、EDC和反应副产物尿素。加入200 L 1 mg mL-1链霉亲和素溶液（溶于MES），常温下混合反应2 h，制备羧基链霉亲和素磁珠（carboxylic-streptavidin magnetic bead，C-SAMB），用PBS洗涤3次，去除未反应的SA。然后加入1 mL浓度为 1 mg mL-1 BSA溶液，4 下混合反应过夜，封闭磁珠，防止非特异性吸附。将制备的 C-SAMB洗涤3次，溶解在900 L PBS中，4 储存备用。将 EpCAM 抗体生物素化并与 C-SAMB 偶联的操作同 1.4.1，制备的羧基免疫磁珠（carboxylic immunomagnetic bead，CIMB）4 储存备用。1.5荧光检测与磁珠偶联的EpCAM抗体本研究制备的免疫磁珠偶联顺序为“磁珠-SA-EpCAM抗体”，使用DyLight 488标记的山羊抗小鼠的第二抗体（EarthOx公司）与磁珠上的EpCAM抗体进行偶联，以验证磁珠是否与EpCAM抗体连接成功。避光条件下，按照说明书向制备好并封闭完全的200 L免疫磁珠中加入2 L DyLight 488荧光标记的二抗，常温下混合反应1 h，用PBS洗涤3次，并在荧光显微镜（Leica公司）下观察结合颗粒在吸收光谱 495 nm、发射光谱 521 nm 处的荧光，利用多功能酶标仪（PerkinElmer公司）检测荧光强度。1.6免疫磁珠捕获细胞实验1.6.1免疫磁珠捕获细胞并检测捕获效果用含1%FBS 的 PBS 缓冲液制备 A549 细胞悬液，以1.55105个 孔-1接种24孔板，每孔体积约为1 mL。向每孔细胞中加入1 mL 1 mg mL-1磁珠，室温下混合反应10 min，使细胞与抗体充分结合。将24孔板放置在磁铁块上，静置等待磁力固定磁珠并与之相连的细胞，3 min后吸出上清，上清液中的细胞保存至无菌 1.5 mL EP 管中，计未捕获细胞数。采用公式（2）计算捕获细胞数，通过公式（3）计算细胞捕获效率。捕获细胞数=总细胞数-未捕获细胞数（2）磁珠捕获效率=捕获细胞数/总细胞数100%（3）免疫荧光法观察被捕获的细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞和磁珠的聚合物沉淀，重新置24孔板630马文博，等：烯壳氮化铁纳米磁珠用于捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究于磁铁块上，洗去游离的未捕获细胞34次。加入100 L完全培养基重悬磁珠和与其相连的细胞，加至35 mm共聚焦培养皿（NEST公司）中，再加入 400 L 4%多聚甲醛（pH 7.4，Beyotime 公司），37 固定细胞 10 min。加入 500 L 含 2%BSA 的 PBS 缓冲液，室温封闭 60 min。用含 2%BSA的PBS按照1 500比例稀释EpCAM抗体，然后加入至细胞中，室温孵育3 h，弃去一抗溶液，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。在避光条件下，用含2%BSA的 PBS缓冲液按照 1 100稀释比例稀释FITC标记的荧光二抗（Proteintech Group公司），并加入至细胞中，室温孵育1 h，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。加入20 L细胞核复染剂（DAPI，Beyotime 公司），在避光室温条件下孵育 45 min，PBS缓冲液洗涤细胞3次，用共聚焦激光扫描显微镜（Nikon公司）观察。使用CCK8试剂（Beyotime公司）检测捕获细胞数量。用完全培养基重悬磁珠和与其相连的细胞，在96孔板中加入细胞与磁珠悬液，每孔100 L。同时设定单纯培养基组作为空白对照。每孔各加入10 L CCK8试剂。将96孔板放入培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光值。1.6.2免疫磁珠分选CTC细胞并检测捕获效果参照文献将不同数量的A549加入至小鼠或人的血液中模拟CTC24-26。取昆明小鼠血于抗凝管中，2 500 r min-1离心10 min，弃血清，用1 mL PBS缓冲液重悬血细胞。将含有104、103、102个A549的3种不同数量的细胞溶液加入至1 mL含106个小鼠血细胞溶液中，制备不同浓度的细胞混液。向每份细胞混液中分别加入300 g AIMB，室温下混合反应10 min，使磁珠与细胞充分反应，在磁铁块上静置3 min，待磁珠聚集，弃上清。被磁珠捕获的细胞用PBS缓冲液清洗 3 次，用完全培养基重悬培养 12 h 后，用EpCAM抗体、FITC标记的荧光二抗做免疫荧光实验，用共聚焦激光扫描显微镜观察。取正常人血于抗凝管中，在1 mL健康人血中分别掺入 10、20、50、100、200 个 A549，以制备不同浓度的细胞混液。参照说明书向细胞混液中分别加入 3 mL 红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司），1 500 r min-1离心 5 min，弃上清，加入1 mL PBS缓冲液重悬细胞沉淀。向每份细胞混液中各加入300 g AIMB，室温下震荡10 min，在磁力架上静置3 min待磁珠聚集，弃去上清液。被磁珠捕获的细胞用PBS缓冲液清洗3次，用完全培养基重悬培养12 h。用EpCAM抗体、FITC标记的荧光二抗及PE标记的CD45抗体进行免疫荧光实验，用共聚焦激光扫描显微镜观察并计数。共设4次重复。1.7统计分析计算各参数的平均值x 和标准差（SD），结果用多次测定的x SD表示，单因素方差分析用于3组及以上间均值比较，P0.05表示差异有统计学意义。2结果与分析2.1烯壳氮化铁纳米磁珠的表征TEM结果如图1所示，GAFeN-MB与GOFeN-MB的壳核结构相对完整。磁珠的磁性内核氮化铁颗粒直径约为1040 nm，石墨烯片包覆壳为多层结构，约5 nm，外层的石墨烯壳可对内部的氮化铁起到保护作用。利用红外光谱分析磁珠表面官能团，如图2A所示，GAFeN-MB在3 450 cm-1处有明显的吸收峰，提示存在N-H基团，且强度大于GOFeN-MB。GOFeN-MB在1 630 cm-1、1 100750 cm-1、585 cm-1处有明显吸收峰，提示存在羧基C=O、C-O振动特征峰，印证了GOFeN-MB含有所需的羧基及其他含氧基团；GOFeN-MB 在 2 900 cm-1、2 300 cm-1、1 5001 200 cm-1处有吸收峰，提示GOFeN-MB存在C-H与苯环特征峰，然而GAFeN-MB在这几处均发现明显吸收峰，说明GAFeN-MB比GOFeN-MB 保存了更完整的二维苯六元环结构，因此GAFeN-MB 比 GOFeN-MB 更稳定。GAFeN-MB 和 GOFeN-MB在4 0003 300 cm-1处高波数图1GAFeN-MB与GOFeN-MB的透射电镜表征Fig.1Transmission electron microscopy characterization of GAFeN-MB and GOFeN-MB631生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology端，有官能团O-H的伸缩振动吸收带，说明其亲水基团增加，水溶性增加。图2B显示，A-SAMB 与GAFeN-MB相比，吸收峰变化并不明显，可见石墨烯吸附蛋白对磁珠表面官能团影响不大，但A-SAMB在2 900 cm-1、2 300 cm-1、600 cm-1有吸收峰变化，提示A-SAMB存在C-H与苯环特征峰，可能是因为在制备A-SAMB时，石墨烯的二维结构发生变化，部分结构变成三维。图2C显示，C-SAMB与GOFeN-MB相比，在3 400 cm-1处、1 630 cm-1处吸收峰略有加深，1 100 cm-1750 cm-1处的吸收峰减少，585 cm-1处吸收峰深度有较大幅度缩小，提示GOFeN-MB 表面羧基及含氧基团被消耗，又因连接的蛋白上有羧基与氨基基团，因此基团总量变化不大，其他官能团的吸收峰变化并不明显。2.2磁珠的吸附能力比较对3种烯壳氮化铁磁珠吸附蛋白能力进行比较，由图3可知，GAFeN-MB的吸附蛋白量远远大于GFeN-MB，与GOFeN-MB的吸附量接近，但GAFeN-MB的标准差小于GOFeN-MB，这提示GAFeN-MB吸附蛋白性能更稳定；而洗脱蛋白量结果表明GAFeN-MB被洗脱下来的蛋白少于 GOFeN-MB（P0.005），说明 GAFeN-MB 吸附的蛋白比GOFeN-MB更多、更牢固。虽然石墨烯表面引入氨基与羧基等基团均可提高石墨烯与分子间相互作用的范德华力，但由于链霉亲和素带负电呈酸性，易与氨基等碱性基团形成氢键与盐桥，这2种键形成的能量通常比普通共价键050100150200250吸附蛋白量/g01020洗脱蛋白量/g30GOFeN-MBGAFeN-MBGFeN-MBGOFeN-MBGAFeN-MBGFeN-MB图33种烯壳氮化铁磁珠吸附蛋白能力比较Fig.3Comparison of the ability of three kinds of GOFeN-MB to adsorb proteinsA：GAFeN-MB与GOFeN-MB红外光谱分析对比；B：A-SAMB与GAFeN-MB红外光谱分析对比；C：C-SAMB与GOFeN-MB红外光谱分析对比图2烯壳氮化铁磁珠与其功能化后的SAMB的红外光谱分析Fig.2FTIR of the magnetic beads and their functionalized SAMBs632马文博，等：烯壳氮化铁纳米磁珠用于捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究低，而比范德华力要高得多，因此，GAFeN-MB要比GOFeN-MB吸附蛋白性能稳定。2.3验证磁珠与抗体的偶联图4AB显示，2种免疫磁珠在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光，说明抗体与磁珠偶联成功；采用酶标仪测量免疫磁珠与对照组磁珠的荧光强度，由图4C可知，2种免疫磁珠的荧光强度远远大于对照组磁珠，且AIMB与CIMB的荧光强度无明显差异，提示2种磁珠均能成功偶联EpCAM抗体制备成为免疫磁珠。其中制备AIMB的直接吸附法较制备CIMB的碳二亚胺法操作更为简单。2.4免疫磁珠捕获A549肺癌细胞将捕获后的A549肺癌细胞进行免疫荧光染色，共聚焦激光扫描显微镜显示EpCAM阳性表达（绿色），DAPI阳性表达（蓝色）的细胞为A549（图5），且2种免疫磁珠都能捕获A549。使用CCK-8试剂检测磁珠捕获A549的能力，结果如图6所示，AIMB捕获的细胞数量大于CIMB，且免疫磁珠与其他磁珠的捕获结果有显著性统计学差异（P0.001），提示免疫磁珠捕获A549的能力强于未偶联抗体的磁珠。如图 7 所示，CIMB 的捕获效率为 85.08%2.02%，C-SAMB的捕获细胞率为 27.82%8.47%，GOFeN-MB 的捕获细胞率为 10.08%10.08%，CIMB的捕获效率远高于C-SAMB和GOFeN-MB；AIMB 的捕获效率为 93.34%1.21%，A-SAMB 的捕获细胞率为 29.84%10.49%，GAFeN-MB 的捕获细胞率为 18.95%0.40%，AIMB的捕获效率0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.600吸光度*培养基CIMBC-SAMBGOFeN-MBAIMBA-SAMBGAFeN-MB注：*表示在P0.001水平上有统计学意义；*表示在P0.05 水平上无统计学意义；*表示在P0.05水平上无统计学意义；*表示在P0.05水平上有统计学意义；*表示在P0.01水平上有统计学意义。图7磁珠捕获细胞效率Fig.7Efficiency of cells capture by magnetic beads633生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology远高于 A-SAMB和 GAFeN-MB。同时，AIMB与CIMB的捕获效率无明显差别。2.5AIMB从小鼠血中分选A549肺癌细胞使用AIMB对小鼠血中A549进行分选，并对分离的细胞进行免疫染色鉴定，DAPI 阳性表达（蓝色），EpCAM阳性表达（绿色）为A549。图8显示AIMB能从小鼠血中捕获A549。2.6AIMB从人血中分选A549肺癌细胞图 9 显示，DAPI 阳性表达（蓝色），EpCAM阳性表达（绿色），CD45 阴性表达（无红色）为A549；DAPI 阳性表达（蓝色），EpCAM 阴性表达（无绿色），CD45阳性表达（红色）为白细胞。区分A549与白细胞后，分别计数A549和白细胞的数量，计算捕获效率与纯度。表1显示，AIMB捕获 A549 的效率在 66.25%81.50%之间，纯度约为 50%。如图 10 所示，AIMB 捕获的 CTC 数量与掺入的 A549 数量呈线性关系（R2=0.990 7，P0.001）。3讨论肺癌患者长期存活率低与肿瘤细胞扩散有关，肿瘤细胞扩散会导致肿瘤转移或复发。因此，血液中循环肿瘤细胞的检测对于预测肿瘤复发、提高生存率具有重要意义。检测血液中肺癌循环肿瘤细胞的常用技术包括抗体依赖性磁珠捕获技术和非抗体依赖性流体捕获技术，其中非抗体依赖性流体捕获技术存在纯度低的问题。抗体依赖性免疫磁珠捕获CTC的方法具有操作简便、快捷等特点，但存在样本需求量大和制备成本昂贵等问题。因此，本研究通过改进磁珠和简化分选过程，提供了一种基于抗 EpCAM 的磁性颗粒分离CTC的方法。石墨烯是一种单层厚度的二维材料，其比表面积非常高，是同等质量三维材料的数百倍，这使MergeA549EpCAMWBCDAPICD4510 m10 m10 m10 m10 m10 m10 m10 m图9磁珠从人血细胞混液捕获CTC后免疫荧光观察结果Fig.9Immunofluorescence observation of CTCs captured from human blood cells mixture by AIMBsAIMB10410细胞数量/个3102图8免疫磁珠从小鼠细胞混液捕获A549后免疫荧光观察结果Fig.8Immunofluorescence observation of A549 captured from mouse cells mixture by AIMBs表1AIMBs从人血中捕获CTC数量及效率Table 1The quantity and efficiency of CTCs captured from human blood by AIMBsCTC掺入数量/（个 mL-1）102050100200捕获数量/个第1次6153885154第2次9174372138第3次8124674187第4次493268173捕获率/%平均值67.5066.2579.5074.7581.50标准差1.923.035.316.3018.59纯度/%平均值49.0949.0652.5950.2251.34标准差3.713.580.580.691.83图10AIMB捕获CTC数量线性关系Fig.10Linear relationship of AIMBs captured CTCs number634马文博，等：烯壳氮化铁纳米磁珠用于捕获肺癌循环肿瘤细胞的初步研究得石墨烯能够有效地吸附分子。红外光谱分析结果显示，GAFeN-MB的二维结构比GOFeN-MB完整，因此GAFeN-MB的吸附能力更好。先前研究显示，石墨烯由碳原子组成的六元环构成，具有特殊的电子结构和化学活性，使其能够与各种分子相互作用，并吸附在表面。而氨基等官能团可以提供孤对电子，使石墨烯表面具有一定的亲电性，从而与部分带正电荷的分子发生范德华力相互作用；此外，氨基等官能团还可以与一些具有酸性的分子形成酸碱配对，进一步增强吸附能力。链霉亲和素是一种糖蛋白，由多个糖基组成，糖基通常带负电，即呈酸性，因此GAFeN-MB的吸附能力优于GOFeN-MB。与其他检测CTC的方法相比，本研究建立的方法简单、快速且成本低。首先，本研究的磁珠可现用现制，便于贮存。通常已连接抗体的磁珠存在不易保存、抗体易失活等问题，本研究的磁珠现用现制，在使用时将抗体生物素化后连接在链霉亲和素磁珠上，保证了抗体的活性，不需要特殊的保存管。其次，制备方法方便快捷。本研究所使用的试剂与材料，如链霉亲和素、PBS缓冲液等都是实验室常见试剂。第三，整个操作过程简单，没有繁琐的步骤。AIMB制备更简单快捷，且捕获效率不低于 CIMB，因此，选用 AIMB 进行小鼠或人血液 CTC的捕获实验。若在后续实验中需要去除磁珠分析 CTC，直接吸附法制备的 AIMB 比碳二亚胺法制备的CIMB更容易去除。血液中主要的细胞成分是红细胞和白细胞，通过红细胞裂解液可剔除大多数红细胞。CD45是所有白细胞的共同抗原，EpCAM是肿瘤细胞最常见的抗原，结合DAPI对细胞核进行染色，可以区分 CTC 与白细胞。通常，捕获 CTC 的纯度为40%50%27-28，本研究结果表明，烯壳氮化铁纳米磁珠经过功能化修饰后，能有效地捕获A549肿瘤细胞，纯度为50%左右。通常情况下，检测外周血中的 CTC 需要7.5 mL以上的血样18，29-30，而本研究建立的方法只需要1 mL血液样本，对样本的需求量减少，这意味着更容易被志愿者和患者接受。虽然使用EpCAM抗体的免疫磁珠对乳腺癌CTC的回收率为70%82%31，但对非小细胞肺癌CTC的回收率无准确数值。需要注意的是，基于免疫磁珠的CTC捕获效率可能因癌症类型、疾病阶段和所用样品制备方法等多种因素而异。将A549细胞加入 1 mL血液样本中，用本研究建立的方法进行检测，其回收率在66.25%81.50%之间，表明该方法有较高的灵敏度。综上所述，本研究建立了一种简便的检测肺癌循环肿瘤细胞的方法。CTC的检测对肺癌的诊断、预后和治疗具有重要意义，烯壳氮化铁纳米磁珠这种新的材料可能在今后的肺癌临床研究中有相当大的潜在价值。参 考 文 献 1 XIE S,WU Z,QI Y,et al.The metastasizing mechanisms of lung cancer:recent advances and therapeutic challengesJ/OL.Biomed.Pharmacother.,2021,138:1114502021-03-06.https:/doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111450.2 WU F,WANG L,ZHOU C.Lung cancer in China:current and prospectJ.Curr.Opin.Oncol.,2021,33(1):40-46.3 AZEVEDO A S,FOLLAIN G,PATTHABHIRAMAN S,et al.Metastasis of circulating tumor cells:favorable soil or suitable biomechanics,or both?J.Cell Adhes.Migr.,2015,9(5):345-356.4 李芳芳,穆登彩,杨春艳,等.KIF26B在非小细胞肺癌发生发展过程中的表达与功能研究J.生物技术进展,2020,10(3):273-283.5 王姣姣,耿圆圆,张家耀,等.肝细胞癌循环肿瘤细胞标志物及检测方法研究进展J.生物技术进展,2015,5(2):113-119.6 PIEIRO R,MARTNEZ-PENA I,LPEZ-LPEZ R.Relevance of CTC clusters in breast 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