香棕根际土一株拮抗病原真菌细菌的分离鉴定及生物学性质研究.pdf

青海农林科技试 验 研 究 年第 期收稿日期:基金项目:福建农林大学科技创新专项基金项目(.)福建农林大学科技创新专项基金项目(.)福建省自然资源科技创新项目资金资助()福建省科技重大专项()福建省引导性科技计划项目()大学生创新训练项目()作者简介:吕祎凡()女本科在读研究方向为微生物与植物互作用山东济南人福建农林大学未来技术学院 海峡联合研究院从事植物微生物功能研究 :.周瑞鹏()男本科在读研究方向为生物学福建福鼎人福建农林大学生命科学学院从事植物微生物功能研究 :.通讯作者:叶文雨 :.:香棕根际土一株拮抗病原真菌细菌的分离鉴定及生物学性质研究吕祎凡周瑞鹏陈星烨赖泽成张春源邵登科刘梓烨陈诗瑜李望豪叶文雨(福建农林大学国家菌草工程技术研究中心福建 福州 植物与微生物相互作用福建省高校重点实验室福建农林大学生命科学学院福建 福州 福建农林大学未来技术学院(海峡联合研究院)福建 福州)摘 要:本研究以海南文昌香棕根际土作为材料分离得到一种土壤细菌编号为 菌株 的形态学、分子鉴定结果均为炭疽杆菌革兰氏染色结果为阳性且具有降解淀粉、分解无机磷、分解糖产生丙酮酸、产生过氧化氢酶的能力 拮抗能力试验结果表明该细菌对于稻瘟病菌和禾谷镰刀菌均有拮抗作用抑制率分别达到 本研究将为植物根际细菌功能研究提供参考并为开发抗菌剂或生物有机肥提供理论指导关键词:香棕根际土细菌理化性质拮抗病原真菌中图分类号:文献标识码:文章编号:()(.():.:香棕()又名为散尾棕、山棕棕榈科代表性植物主要集中分布于我国南部省份如福建、广东、云南、台湾等同时香棕也为典型的阴生物种生长环境潮湿阴凉这种环境对微生物的生长繁殖也十分有利因此香棕根际土微生物种类繁多土壤微生物在温暖湿润的环境中具备极强的生长繁衍能力作为土壤的重要组成部分其对于土壤物质转化、结构稳定等方面有不可取代的作用 但是对于植物而言土壤微生物的影响具有两面性 例如病原真菌稻瘟病菌()由其引起的水稻稻瘟病对我国水稻总产量造成巨大冲击禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病()的重要因素之一该病害会导致小麦的严重减产并且由其代谢所产生的真菌毒素积累常会导致严重的食品安全问题具有淀粉水解能力的芽孢杆菌()是农业生产实践中常用到的有益细菌其可以提高土壤中某些特定酶的酶活同时还能诱导植物体促生与抗病基因的表达 就研究目前来看我国防治植物病原菌引起的病害的措施主要是化学防治和选育优良的抗病品种来对其进行防控 但由于致病菌具有许多生理小种并且不同生理小种间也存在着一定的差异同时生理小种本身也存在易变性这导致目前的防治手段对病原菌引起的植物病害的防控效果收效甚微并且目前的化学农药等方法对环境也存在着一定的污染不利于环境保护和可持续发展参照前人的研究根际微生物对植物的影响体现在不同的方面 根际微生物不仅对植物具有促生作用也能提高植物的抗逆能力 另外根际微生物也会影响土壤中的蔗糖酶、过氧化氢酶等物质的活性进而影响土壤的理化性质间接对植物的生长发育产生影响 本研究通过分离鉴定得到一株具有促生潜能和拮抗病原真菌的香棕根际细菌期望能够为病原真菌的防治以及微生物菌肥等方面的研究提供一定的理论指导和实践基础 材料与方法 材料供试细菌:从海南文昌香棕根际土中所分离出来的根际细菌编号为 供试 病 原 真 菌:稻 瘟 病 菌()禾谷镰刀菌()细菌生长培养基:固体 培养基、液体 培养基 真菌生长培养基:培养基 生理生化鉴定培养基:淀粉水解培养基、明胶培养基 促生能力培养基:无机磷培养基 方法 土壤细菌的分离与纯化以五点取样法采集生长期限为十年的典型香棕林的根际土五个样品于一个无菌袋内混合然后将样品置于 冰箱暂时保存于 内进行分离试验 称取 土壤于三角瓶中后加入 灭菌超纯水/摇床持续震荡静置 沉淀此时上清液即为溶液溶度/土壤稀释液 用移液枪吸取 上清液于试管中加入 灭菌超纯水此时溶液即为浓度为/的土壤稀释液 重复以上步骤 分别制得浓度为/、/、/的土壤稀释液 分别用移液枪吸取上述土壤稀释液 于固体 培养基上涂布均匀每个浓度设置三次重复试验 培养 后选择符合要求的生长状况良好的单菌落进行纯化连续纯化三次后选取生长良好的单菌落至液体 培养基培养 后按菌液与甘油比为 的比例保存于 冻存管中 菌株分子鉴定将土壤细菌 在液体 培养基上活化 后吸取菌液作为模板以 和 作为 引物 反应体系与程序参照周瑞鹏等的方法 产物委托北京擎科生物有限 公 司 测 序 测 序 结 果 在 (:/)数据库与记载序列进行 比对采用软件 以邻近相接法构建菌株 的系统进化树 菌株形态学特征将土壤细菌 在液体 培养基上活化 后用枪头蘸取菌液于固体 培养基上进行平板划线培养 后进行菌落形态拍照 并且挑选生长良好的单菌落按照周瑞鹏等的方法进行革兰氏染色 菌株生理生化性质分析将土壤细菌 在液体 培养基上活化 后进行生理生化特性鉴定 具体试验包括:接触酶试验、淀粉水解试验、溶磷试验、甲基红试验、明胶液化试验、细菌运动性试验 菌株溶磷分析将土壤细菌 在液体 培养基上活化 分别吸取 菌液在无机磷培养基上接种细菌培养 后观察菌落周围是否产生透明圈从而初步判断细菌是否具有溶解无机磷能力并用直尺测量菌落直径()和溶磷圈直径()同时计算细菌的溶磷效率(/)菌株拮抗病原菌筛选采用平板对峙法研究菌株 对稻瘟病菌 与禾谷镰刀菌 的拮抗作用用无菌打孔器在生长有病原真菌的 培养基上打取直径为 的菌饼用接种针将长有菌丝的一面接种到 培养基中央距离病原真菌 处接种提前活化好的菌株 以不接土壤细菌的平板作为对照组 每种病原真菌设置三次重复试验 待对照组的病原真菌在培养基基本长满时以十字交叉法测量对照组与试验组病原真菌直径并计算抑菌率 抑菌率计算公式为:抑菌率()(对照菌落直径 处理菌落直径)/对照菌落直径 结果与分析 菌株 形态学特征由图 可以看出该菌株菌落呈圆形白色边缘比较规则表面光滑直径约为 依据图 革兰氏染色结果可以得出 为革兰氏阳性菌且菌体呈杆状图 菌株 菌落特征注:菌落形态图:革兰氏染色结果 菌株 的分子鉴定以细菌通用引物 为引物进行 扩增扩增后产物进行电泳试验初步确定细菌 的 大小 结果如图 所示与 对比可知 的 基因片段大约为 将测序结果在(:/)上进行同源比对选取同源性高的序列下载以 中的邻近相接法构建 系统发育树确定其所属的分类地位 以邻近相接法分别构建 的系统发育树结果如图 所示 根据图 能够看出 与炭疽杆菌()汇聚在同一分支且置信度达到 因而可判别 属于炭疽杆菌()图 菌株 的分子鉴定注:琼脂糖凝胶电泳结果(:):系统发育树 菌株 生理生化性质菌株 加入过氧化氢之后细菌菌落周围产生大量气泡说明该细菌能够产生过氧化氢酶从而分解过氧化氢产生氧气(图)在淀粉培养基菌落旁滴加碘液菌落四周呈现显著的透明圈表明该区域附近的淀粉已经被水解说明该细菌可以产生淀粉酶从而水解淀粉(图)细菌在甲基红培养基上培养 后观察到甲基红指示剂变红表明该细菌具有代谢糖并产生丙酮酸的能力(图)细菌在明胶培养基恒温培养 后将试管置于 冰箱 后取出可以明显看出上层明胶液化该结果表明该细菌可以产生明胶酶促进明胶降解失去凝固能力而液化(图)在半固体培养基中该菌未呈现辐射状扩散生长说明该菌株不具有运动性(图)图 菌株 的生理生化性质鉴定注:接触酶试验:淀粉水解试验:甲基红试验:明胶液化试验:运动能力试验 菌株 的溶磷性能在无机磷培养基上细菌菌落四周呈现显著清晰的透明圈这说明土壤细菌 具有分解无机磷的能力结果如图 和图 所示 培养 后量取菌落直径()和溶磷圈直径()并计算溶解效率(/)的结果如表 所示 溶解效率为 图 菌株 溶磷试验表 溶磷圈法测定细菌解无机磷能力细菌编号溶磷圈直径(/)菌落直径(/)溶解效率(/)图 细菌 的溶磷效率 菌株 的拮抗病原菌筛选土壤细菌 的拮抗病原菌结果表明该细菌对水稻稻瘟病菌和禾谷镰刀菌均具有一定的抑制作用试验结果如图、图 和图 所示 通过测量对照组与试验组病原真菌菌落直径该菌对水稻稻瘟病菌和禾谷镰刀菌的抑菌率分别为 和 (表)图 土壤细菌 对病原真菌的拮抗作用注:对禾谷镰刀菌的拮抗结果:禾谷镰刀菌:对稻瘟病菌的拮抗结果:稻瘟病菌下同表 菌株 对水稻稻瘟病菌和禾谷镰刀菌的拮抗作用菌株菌落直径()对照组菌落直径()抑菌率()图 细菌 对病原真菌的拮抗抑菌率 结论与讨论近年来土壤微生物因其在土壤中所发挥的重要作用越来越被人所重视 例如:因部分土壤微生物具有良好的固氮、溶磷、产生腐殖质酸等改善土壤肥力的功能从而具备促进植物生长的能力由此越来越被农业生产所重视部分土壤微生物具有良好的拮抗病原菌的作用又被用于生物防治病害方面的研究 根际土壤细菌对磷的活化作用可以实现土壤供磷与植物需磷达到和谐同步的设想 土壤中的细菌与香棕的根系相互作用形成了一个相对稳定的动态平衡系统 香棕的根系活动会对土壤的理化性质及其物质变化产生影响在香棕生长的过程中其根系向土壤环境中分泌无机离子、质子以及有机物质 这些物质在土壤中聚集对香棕具有毒害作用 香棕土壤根际微生物可以调节根际土壤环境中的酶活性可以调节植物在不同的发育时期对于蛋白质、糖类等物质的需求差异 由此可见微生物的生命活动也促进植物的生长本研究证明了香棕根际土土壤细菌 对于淀粉有机磷都有显著的降解作用并且通过明胶液化试验证明了根际土细菌 可以使明胶降解生成氨基酸失去凝固能力 通过细菌真菌的拮抗实试验可知 对水稻稻瘟病菌和小麦叶锈病菌都具有显著的拮抗作用为水稻小麦的疾病防控以及植物营养等方面的研究提供新的潜在的思路另外参照刘炬等的研究结果炭疽杆菌也作为威胁人类健康导致传染病的一类严重的病原菌 具有极强的生存能力和感染能力也因此被许多国家作为生化武器 该菌可以引起炭疽使人和动物患病因此对于炭疽杆菌的防治等问题还有待深入研究参考文献:贾春媛.中国原生香棕()种群的遗传多样性研究.厦门:厦门大学.龙翊岚.独具一格的植物香棕.中国热带农业():.温小红谢明杰姜健等.水稻稻瘟病防治方法研究进展.中国农学通报():.李杨王耀雯王育荣等.水稻稻瘟病菌研究进展.广西农业科学():.张海晖.小麦叶锈病的防治.农村科学实验():.程齐宁鑫乔旻航等.不同生长期核桃根际微生物群落特征/.生态学杂志:.:/./.刘芳汪航飞蒲春燕蔡紫阳吴三林.不同施肥对葡萄苗根际微生物量、土壤酶活性和生理的影响.四川农业大学学报():.赵金明赵云黄庆等.单壁碳纳米管在 培养基及生理盐水中的抗菌性研究.核技术():.王杰陈颖钰彭清洁等.沙门菌检测方法研究进展.动物医学进展():.周瑞鹏赖泽成张春源等.“绿洲一号”土壤细菌的分离鉴定及生物学性质研究.青海农林科技():.王斌.高粘附性能乳杆菌的筛选及其对肠上皮细胞粘附机制的初步研究.重庆:第三军医大学.郑乾魏.发酵肠优质乳酸菌的分离、筛选与鉴定.保定:河北农业大学.谭晶晶.奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定及免疫预防的初步研究.武汉:华中农业大学.胡琼任国平.多粘类芽孢杆菌在植物生产中的应用及作用机制.北方园艺():.徐睿刘君昂周国英等.降香黄檀檀香根际土壤高效解磷细菌的分离筛选与鉴定.热带作物学报():.刘婷婷.健康妇女阴道乳杆菌的分离及鉴定.兰州:兰州大学.段辰君王彦譞刘慧芹等.红掌内生拮抗菌的分离及抑制作用初步研究.天津农学院学报():.李雪萍张怡忻李建军等.兰州百合防病促生细菌筛选及其效果评价.中国生物防治学报():.张宝贵李贵桐.土壤生物在土壤磷有效化中的作用.土壤学报():.朱丽霞章家恩刘文高.根系分泌物与根际微生物相互作用研究综述.生态环境():.陈龙池廖利平汪思龙等.根系分泌物生态学研究.生态学杂志():.陈慧郝慧荣熊君等.地黄连作对根际微生物区系及土壤酶活性的影响.应用生态学报():.史刚荣.植物根系分泌物的生态效应.生态学杂志():.吴建峰林先贵.土壤微生物在促进植物生长方面的作用.土壤():.刘炬徐俊杰陈薇.炭疽杆菌检测方法的研究现状与展望.微生物学报():.褚佩英.炭疽杆菌的特性和主要毒力因子.微生物学免疫学进展():.肖履中赵青.检测炭疽杆菌的研究.中国动物检疫():.