小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因筛选与鉴定.pdf

4期993小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因筛选与鉴定谭一罗，张广旭，王康君，郭明明，孙中伟，李晓峰，樊继伟*（连云港市农业科学院，江苏连云港222000）摘要：【目的】筛选鉴定小麦品种连麦12响应禾谷镰刀菌侵染过程中的核心基因，为小麦赤霉病防御分子网络提供理论参考。【方法】对成功感染禾谷镰刀菌的连麦12小穗进行转录组测序，通过DESeq筛选差异表达基因（DEGs），对DEGs进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，构建DEGs的蛋白质互作网络，通过MCODE和cytoHubba筛选核心基因。【结果】对小麦品种连麦12接种禾谷镰刀菌（处理组）和接种无菌去离子水（对照，CK）72 h后的DEGs进行筛选，结果共筛选出14180个DEGs，其中有10966个DEGs上调表达，有3214个DEGs下调表达。经GO功能注释分成三大类，共51个条目，其中，细胞组分包含14个条目，主要富集在细胞、细胞部件和膜3个条目；分子功能包含11个条目，主要富集在催化活性和结合2个条目；生物学过程包含26个条目，主要富集在细胞过程、代谢过程和刺激反应3个条目。KEGG信号通路富集分析结果显示，富集到代谢、次级代谢物生物合成、苯丙烷类生物合成、植物信号激素转导、植物MAPK信号通路的DEGs数量最多；富集到光合作用天线蛋白通路，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，谷胱甘肽代谢，黄酮和黄酮醇的生物合成，亚油酸代谢等通路的程度最高。以combined score0.7构建蛋白质互作网络，共筛选出258个上调表达的DEGs。MCODE聚类构建筛选重要基因互作功能模块，获得2个重要基因功能模块分别包含13个（Score=7.67）和6个（Score=5.60）重要的DEGs。利用cytoHubba筛选蛋白质相互作用最紧密的10个核心基因，其结果与MCODE筛选结果重合。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对筛选的10个核心基因验证结果，与转录组测序结果基本一致。【结论】筛选的10个核心基因在禾谷镰刀菌侵染后均上调表达，说明这10个核心基因在连麦12对禾谷镰刀菌侵染的响应中发挥重要调控作用。关键词：小麦；禾谷镰刀菌；核心基因；转录组；赤霉病中图分类号：S512.103.53文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）04-0993-09收稿日期：2022-05-13基金项目：江苏省第五期“333高层次人才培养工程”专项（BRA2019246）；江苏省科技政策引导类计划专项（SZ-LYG202041）；连云港市财政专项（QNJJ2101）通讯作者：樊继伟（1982-），https:/orcid.org/0000-0002-7941-5860，副研究员，主要从事小麦遗传育种研究工作，E-mail：第一作者：谭一罗（1991-），https:/orcid.org/0000-0002-6958-6164，主要从事小麦遗传育种研究工作，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（4）：993-1001ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.003Screening and identification of core genes responding toFusarium graminearum in wheatTAN Yi-luo，ZHANG Guang-xu，WANG Kang-jun，GUO Ming-ming，SUN Zhong-wei，LI Xiao-feng，FAN Ji-wei*（LianyungangAcademy ofAgricultural Sciences，Lianyungang，Jiangsu 222000，China）Abstract：【Objective】The purpose was to study the core genes of wheat cultivar Lianmai 12 in response to Fusariumgraminearum infection，and provide theoretical bases for the defense molecular network in wheat fusarium head blight.【Method】The transcriptome of Lianmai 12 spikelets，which successfully infected with F.graminearum，was sequenced.Screening differentially expressed genes（DEGs）through DESeq，conducting GO functional annotation and KEGG signa-ling pathway enrichment analysis.The protein-protein interaction network based on DEGs were constructed.Core geneswere screened by MCODE and cytoHubba.【Result】After 72 h of inoculation with F.graminearum（treatment group）andsterile deionized water（control，CK）in Lianmai 12，a total of 14180 DEGs were screened，among which 10966 DEGswere up-regulated and 3214 DEGs were down-regulated.According to GO functional annotation，the could be divided into3 major categories and 51 items.The cell components contained 14 items，mainly enriched in 3 items：cell，cell part andmembrane.The molecular function included 11 items，mainly enriched in 2 items：catalytic activity and binding.Biologicalprocess include 26 items，mainly enriched in 3 items：cellular process，metabolic process，and response to stimulus.54卷南 方 农 业 学 报 9940引言【研究意义】小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）为主的多种病原真菌引起的小麦穗枯或“穗疮痂病”，是我国乃至世界小麦生产的主要病害，主要发生于湿润或半湿润地区，在北美、欧洲等小麦主产区以及我国长江中下游麦区流行频繁，危害严重（Dweba etal.，2017；Fernando et al.，2020；胡文静等，2021）。随着全球气候及耕作制度的改变，小麦赤霉病逐渐向我国黄淮麦区和陕西关中麦区等多个麦区扩展，甚至成为黄淮麦区主要病害之一。虽然目前研究鉴定到引起小麦赤霉病的镰刀菌至少有18种，但不同麦区间赤霉病优势种差异较大，我国长江中下游麦区赤霉病优势种为亚洲镰刀菌，黄淮流域及以北的麦区则是禾谷镰刀菌。禾谷镰刀菌也是世界范围内小麦赤霉病的优势致病菌（夏腾飞和熊子君，2021）。小麦赤霉病的发生不仅导致小麦减产，其病原菌还能产生脱氧雪腐镰孢菌烯（Deoxynivalenol，DON）等多种毒素，造成食品和饲料污染，严重威胁人畜健康。因此，对小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因进行筛选及鉴定，有助于了解小麦参与赤霉病响应过程中的核心基因，为进一步解析小麦响应赤霉病的分子应答机制和抗感病机理具有重要研究意义。【前人研究进展】为了开发小麦赤霉病的有效防御方法，研究者在小麦赤霉病的分子应答和抗性机制方面开展了大量研究，结果发现小麦赤霉病抗性受多个中小效应数量性状位点（Quantitative trait locus，QTL）控制，是一种复杂的数量性状，且易受环境影响（Bai et al.，2018）。通过正向遗传学对小麦赤霉病抗性位点的研究已鉴定超出556个赤霉病抗性QTL，但明确的抗性位点或基因仅7个：Fhb1（Lagu-dah and Krattinger，2019；Li et al.，2019）、Fhb2（Cuth-bert et al.，2007）、Fhb3（Qi et al.，2008）、Fhb4（Xueet al.，2010）、Fhb5（Xue et al.，2011）、Fhb6（Cainonget al.，2015）和Fhb7（Wang et al.，2020）。近年来，多组学技术的快速发展使阐明小麦赤霉病免疫应答和防御机制成为可能。赵兰飞（2016）以小麦品种苏麦3号为材料，通过转录组测序发现，水杨酸和茉莉酸信号通路参与小麦赤霉病防御，认为水杨酸途径产生的活性氧是苏麦3号抗性增强的重要原因。郑彤等（2019）基于小麦中国春基因组和转录组数据对TaLEA3基因家族成员进行全基因组鉴定，并分析其响应赤霉病的基因表达模式，结果发现TaG3LEA-25基因在赤霉病抗感材料间表达存在显著差异，推测其为抗性相关基因。徐佳竞等（2020）基于转录组测序挖掘小麦品种西农979的赤霉病抗性相关基因，筛选到钙结合蛋白、WRKY转录因子、抗病蛋白等差异表达基因，还筛选到脱毒相关基因。刘家俊等（2021）通过混池蛋白组学分析小麦感染赤霉病后的差异表达蛋白，通过加权共表达网络分析构建了赤霉病抗性显著相关模块，进一步利用蛋白质互作网络分析筛选出7个候选蛋白，推测这些蛋白参与赤霉病抗感病的响应。宋婧含（2021）将不同抗性的小麦品种接种禾谷镰刀菌后进行转录组分析，结合其表型数据通过加权共表达网络分析挖掘赤霉病相关基因，最终筛选出15个关键节点基因，并发现TaPDIL-4-1-B（TraesCS1B02G126100）基因在禾谷镰刀菌侵染后应激表达，可能参与小麦抗赤霉病的响应。Su等（2021）通过代谢组学和转录组学联合分析发现，小麦的禾谷镰刀菌应答受类黄酮和生长素信号传导的影响，外源山柰苷和芹菜素能增加小麦赤霉病抗性，但外源生长素会增加小麦赤霉病易感性，进一步通过RNAi技术沉默生长素受体基因TaTIR1，结果发现该基因沉默后赤霉病抗性增强。【本研究切入点】KEGG annotated the largest number of differential genes in metabolic pathways，biosynthesis of secondary metabolites，phenylpropanoid biosynthesis，plant hormone signal transduction and plant MAPK signaling pathways.KEGG pathwaymostly enriched in photosynthesis-antenna proteins，phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis，glutathionemetabolism，flavone and flavonol biosynthesis and linoleic acid metabolism.Protein-protein interaction network wasconstructed with a combined score0.7，and a total of 258 up-regulated main DEGs were screened.Important gene interac-tion module was constructed and screened by MCODE clustering，which obtained 2 important gene function modules con-taining 13（score=7.67）and 6（score=5.60）important DEGs respectively.The 10 core genes screened by cytoHubba，based on most closely interacting proteins，were coincided with the MCODE screening.The 10 core genes expressiontrends which verified by fluorescence quantification were basically consistent with the expression trends of transcriptomesequencing.【Conclusion】The expression of 10 core genes are all up-regulated after F.graminearum infection，which spe-culates that these 10 core genes play an important role in the response of Lianmai 12 to F.graminearum infection.Key words：wheat；Fusarium graminearum；core gene；transcriptome；fusarium head blightFoundation items：Fifth Phase of“333 High-level Talents Training Funding Support Project”of Jiangsu（BRA2019246）；Science and Technology Policy Guidance Plan Project of Jiangsu（SZ-LYG202041）；Financial Grant SupportProject of Lian-yungang（QNJJ2101）4期995虽然目前在赤霉病抗性基因挖掘和应答分子机制研究上取得了一定进展，但小麦响应赤霉病侵染的分子防御网络仍有待完善。【拟解决的关键问题】以小麦品种连麦12为材料，利用转录组测序技术挖掘连麦12响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因，并基于STRING数据库构建蛋白质互作（Protein-protein in-teraction，PPI）网络，使用Cytohubba和Mcode插件筛选侵染过程中的重要基因集群，为揭示小麦赤霉病防御分子机理和完善小麦抗赤霉病分子网络研究提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料供试小麦品种连麦12是连云港市农业科学院经多年多点自主选育的适合黄淮麦区的半冬性早熟小麦品种。该品种于20182020年经江苏省农业科学院植物保护研究所、江苏徐淮地区徐州农业科学研究所和江苏里下河地区农业科学研究所鉴定为中抗赤霉病（接种鉴定为中抗赤霉病，严重度1.40和2.35；自然发病鉴定为中抗赤霉病，病情指数0和6.43），是黄淮麦区稳定的中抗赤霉病小麦材料，种植于连云港市农业科学院东辛农场试验基地。供试的禾谷镰刀菌菌株由江苏省农业科学院提供。Fast-King RT Kit（with gDNase）购自天根生化科技（北京）有限公司，其余试剂均购自连云港杰创科学仪器有限公司。主要设备仪器：NanoDrop 2000超微量核酸蛋白分析仪（Thermo，美国）、The Qubit Fluorome-ter荧光定量仪（Thermo，美国）和StepOneTM实时荧光定量PCR系统（Thermo，美国）。1.2样品采集采用单花滴注法接种处于开花期的小麦穗轴中部的1个小穗，每15穗为一组，共分为6组。处理组：每小穗接种10 L孢子液（孢子液浓度5105个/mL），设3组重复，分别命名为FHB-1、FHB-2和FHB-3。对照组：每小穗接种等量无菌去离子水10 L，设3组重复，分别命名为CK-1、CK-2和CK-3。接种后套袋保湿，72 h后取接种成功的小穗样品于液氮冷冻后保存于-80 冰箱。1.3文库构建及测序按照RNAprep Pure Plant Kit试剂盒说明书进行RNA提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品RNA纯度后，按照NEBNextUltraTMRNA Library PrepKit（Illumina）试剂盒说明构建cDNA文库。通过Qu-bit Fluorometer初步定量后将文库稀释至1.5 ng/L。检测文库insert size，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测文库有效浓度2 nmol/L，并通过Illumina HiSeq平台进行转录组测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。1.4数据质控及基因表达定量使用Fastp v0.19.3进行数据过滤，去除带接头的Reads和Paired reads，仅保留Clean reads用于后续分析。将Clean reads比对到小麦品种中国春的参考基因组，使用FeatureCounts计算基因比对情况，计算FPKM（Fragments per kilobase of exon model permillion mapped fragments）用于衡量基因表达水平。1.5差异表达分析和功能注释使用DESeq进行差异表达分析，并用Benjamini Hochberg方法校正P值，以P0.7构建显著差异蛋白质的互作网络图，通过Cytoscape v3.9.1可视化作图。利用MCODE插件以Degree Cutoff=2，Node ScoreCutoff=0.2，K-Core=2和Max.Depth=100筛选PPI网络中重要互作模块。利用cytoHubba插件以马修斯相关系数MCC为算法筛选蛋白质相互作用最紧密的10个基因，与MCODE重要模块取交集筛选相应禾谷镰刀菌的核心基因。1.7qRT-PCR验证根据核心基因cDNA序列设计引物，以小麦TaActin基因为内参，引物详见表1。使用FastKing RT Kit（with gDNase）试剂盒进行RNA反转录。qRT-PCR反应体系20.0 L：500 ng/mL cDNA模板2.0 L，10mol/L上、下游引物各0.4 L，2SYBR Green qPCRMaster Mix 10.0 L，ddH2O补足至20.0 L。扩增程序：95 预变性3 min；95 变性5 s，60 退火/延伸30 s，进行45个循环。采用2-Ct法计算基因的相对表达量，设3次技术重复。2结果与分析2.1转录组测序数据的质量控制结果转录组测序共获得8457151291108028条Rawreads，质量控制后获得8124532886954386条Cleanreads，Q30为93.18%93.77%，GC含量为52.80%53.55%，Clean reads序列比对到中国春参考基因组的比对率为89.02%92.90%，说明与参考基因组的比对率高，转录组测序质量较好（表2）。谭一罗等：小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因筛选与鉴定54卷南 方 农 业 学 报 9962.2响应禾谷镰刀菌侵染的DEGs筛选对小麦品种连麦12接种禾谷镰刀菌（处理组）和接种无菌去离子水（CK）72 h后的DEGs进行筛选，结果共筛选出14180个DEGs，其中有10966个DEGs上调表达，有3214个DEGs下调表达（图1-A）。由图1-B可知，上调表达的DEGs数量较下调表达的DEGs数量多，且大多数上调表达基因的Padj更小，即显著性更高。2.3响应禾谷镰刀菌侵染的DEGs GO功能注释结果将响应禾谷镰刀菌侵染的DEGs比对至GO数据库，共有11158个DEGs被注释，分为细胞组分、分子功能和生物学过程3个大类，共51个条目（图2）。其中，细胞组分包含14个条目，主要富集在细胞、细胞部件和膜3个条目，分别为7251、7220和4784个DEGs，其次还富集在细胞器、膜部件、细胞器部件、细胞外区域等，分别为4563、3914、1851和819个DEGs；分子功能包含11个条目，主要富集在催化活性和结合2个条目，分别为6318和6239个DEGs，其次还富集在转录调控活性、转运活性、分子转导活性等，分别为752、732和238个DEGs；生物学过程包含26个条目，主要富集在细胞过程、代谢过程和刺激反应3个条目，分别为5897、5668和3629个DEGs，其次还富集在生物调控、生物调控进程、信号、发育过程和多细胞生物过程等，分别为2626、2298、1070、1062和1060个DEGs。基因 GeneTaActinTraesCS5B02G160700TraesCS5A02G163400TraesCS7A02G149000TraesCS3A02G136100TraesCS3A02G342900TraesCS2A02G145800TraesCS6A02G151700TraesCS6B02G179900TraesCS7A02G127600TraesCS6D02G203000正向引物 Forward primer5-AGAGTCGGGGAAGGTTGTTTA-35-GACCTTATGGAGCCCGAAAC-35-TGTCGGCTAGTTAATTCTATGGG-35-GCCGGCGATGAAAGAGATCA-35-CGACCCGCTCTTCAACCA-35-GATCACGGAGCCCGACAC-35-ACAAAGAGAGTGTGAGCAAGGAT-35-CAAGGAGCCGTTCAAGGTC-35-CCGCTTCTCAGGCACTCA-35-GTACATCCTGGAGACGAGCG-35-GTGCCCTTCTACCCGATGG-3反向引物 Reverse primer5-TCATTATTTCATACAGCAGGCAA-35-CTTCTCAGGGTCGTCGGTG-35-TGGTTATTGTAGTCCGTGGATTTA-35-TAGCCACACCTTTCCGAACT-35-CTCGCCCGTCTTCTCCAA-35-CCAGGCGTTGACGAGGAT-35-AAAGTGCGAATACATTATCTGGAG-35-TGGTGGACTCTGGGTCGTTA-35-CAACGCATCTACATATATCATTTCA-35-GAGGGAGTAGCCGGTGTAGA-35-GATAAGGCGCTTGAGGTCCA-3样品SampleCK-1CK-2CK-3FHB-1FHB-2FHB-3Raw reads（条）869081629021190884571512903939149110802890340496Clean reads（条）831027128695438681245328862079668566237885287656Q30（%）93.6993.7093.6093.1893.6593.77GC含量（%）GC content53.0353.5552.8053.3653.4153.23比对到参考基因组的Reads Mapped reads to reference genome数量 Number762115358075058975474839767448237718021676871378比对率（%）Alignment efficiency91.7192.8792.9089.0290.1090.13表 1供试的qRT-PCR引物序列Table1Primers sequences for qRT-PCR表 2转录组测序结果及比对效率Table 2Transcriptome sequencing results and alignment efficiency图 1DEGs筛选（A）及其火山图（B）Fig.1Screening of DEGs（A）and volcano map（B）20000150001000050000DEGs数量 Number of DEGs-lg Padj-10-50510log2Fold Change3002001000DownFalseUpAB321410966下调Down-regulated上调Up-regulated4期9972.4响应禾谷镰刀菌侵染的DEGs KEGG信号通路富集分析结果将响应禾谷镰刀菌侵染的DEGs比对到KEGG数据库，结果发现有5026个DEGs富集到135条信号通路，其中有106个参与代谢信号通路，4个参与环境信息过程通路，19个参与遗传信息过程通路，4个参与细胞过程通路，2个参与有机系统通路。从富集的基因数量来看，富集在代谢通路和次级代谢物生物合成通路的基因较多，分别为2469和1626个；其次为富集在苯丙烷类生物合成通路的基因，为351个；富集在植物信号激素转导和MAPK信号通路的基因分别为342和326个（图3）。从富集程度上看，光合作用天线蛋白通路富集程度最高，其次为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，谷胱甘肽代谢，黄酮和黄酮醇的生物合成，亚油酸代谢（图3）。此外，KEGG信号通路的富集还涉及到多种氨基酸、脂类和萜类物质的生物合成或代谢。2.5PPI网络构建及核心基因筛选以combined score0.7构建响应禾谷镰刀菌侵染的PPI网络，获得包含258个节点、1039条边的网络互作图，所有节点对应的基因全部为上调表达。通过蛋白质的MCODE聚类构建主要基因互作功能模块（图4-A），该模块由41个节点、220条边组成（Score=11.00），聚为三大簇。进一步筛选其中的重要蛋白质互作功能模块，获得2个重要基因功能模块（图4-B和图4-C），其中，重要功能模块（图4-B）包含13个节点、46条边，Score=7.67；重要功能模块（图4-C）包含6个节点、14条边，Score=5.60。通过cytoHubba计算蛋白质相互作用最紧密的10个基因互作网络图（图4-D），该计算结果与主要功能模块结果重合，其中4个基因与重要功能模块结果重合，6个基因与重要功能模块结果重合，推测TraesCS5B02G16-0700、TraesCS5A02G163400、TraesCS7A02G149000、TraesCS3A02G136100、TraesCS3A02G342900、Traes-图 2DEGs的GO功能注释分析结果Fig.2GO function annotation of DEGs10100100010000DEGs数量 Number of DEGs生物学过程 Biological process细胞组分 Cellular component分子功能 Molecular function膜 Membrane细胞外区域 Extracellular region细胞 Cell核仁 Nucleoid细胞连接 Cell junction膜封闭内腔 Membrane-enelosed lumen含蛋白质复合物 Protein-containing complex细胞器 Organelle细胞外区部分 Extracellilar region part细胞器部件 Organelle part膜部件 Membrane part细胞部件 Cell part同质化 Symplast超分于配合物 Snpramolecular complex转录调控活性 Transcription regulator activity催化活性 Catalytic activity养分库活性 Nutrient reservoir activity结构分子活性 Strnctural molecule activity转运活性 Transporter activity结合 Binding毒素活性 Toxin activity抗氧化活性Antioxidant activity分子功能调控 Molecular funotion regulator分子转导活性 Molecnlar transducer activity分子转运活性 Moleeular carrier activity复制 Reproduction代谢过程 Metabolic process细胞杀伤 Cell killing免疫系统进程 Immune system process成长 Growth细胞增殖 Cell proliferation细胞过程 Cellular process碳利用 Carbon utilization氮利用 Nitrogen utilization生殖过程 Reproductive process生物黏附 Biological adhesion信号 Signaling多细胞有机体过程 Multicellular organismal process发育过程 Developmental process运动 Locomotion色素沉着 Pigmentation节律过程 Rhythmic process正调控生物过程 Positive regulation of biological process负调生物过程 Negative gulation of biological process生物过压调控 Regulation of biological overpressure刺激反应 Response to stimulus定位 Localization多有机体过程 Multi-organism process生物调控 Biologcal regulation细胞组分组织或生物合成 Cell component organization or biogenesis解毒 DetoxificationGO功能条目 GO term谭一罗等：小麦响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因筛选与鉴定54卷南 方 农 业 学 报 998CS2A02G145800、TraesCS6A02G151700、TraesCS6B-02G179900、TraesCS7A02G127600和TraesCS6D02G-203000均为连麦12响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因。其中，TraesCS5B02G160700、TraesCS5A02G16-3400和TraesCS7A02G149000是小麦肉桂酰辅酶A还原酶（Cinnamoyl-CoA reductase，CCR）基因；Traes-CS2A02G145800、TraesCS6A02G151700和TraesCS-6B02G179900是小麦4-香豆酰：辅酶A连接酶（4-cou-marate：CoA ligase，4CL）基因；TraesCS3A02G136-100和TraesCS3A02G342900同属于小麦细胞色素P450家族的肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamate 4-hydroxy-lase，C4H）基因；TraesCS7A02G127600是小麦咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoA O-methyl-transferase，CCoAOMT）基因；TraesCS6D02G203000是小麦羟基肉桂酰基-辅酶A：莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰基转移酶（Hydroxycinnamoyl-CoA：shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，HCT）基因。2.6核心基因的qRT-PCR验证利用qRT-PCR对PPI筛选的10个核心基因进行验证，结果如图5-A所示。连麦12经单花滴注接种禾谷镰刀菌72 h后，筛选的10个核心基因TraesCS5B02-G160700、TraesCS5A02G163400、TraesCS7A02G149-000、TraesCS3A02G136100、TraesCS3A02G342900、TraesCS2A02G145800、TraesCS6A02G151700、Traes-CS6B02G179900、TraesCS7A02G127600 和 TraesCS-6D02G203000均上调表达，与转录组测序结果（图5-B）基本一致，说明转录组测序结果较准确，也证明通过转录组数据和PPI筛选推测的连麦12响应禾谷镰刀菌侵染的核心基因具有可靠性。3讨论本研究以接种无菌水的连麦12小穗为对照，对接种禾谷镰刀菌72 h后的连麦12小穗进行了转录组测序分析，KEGG信号通路富集分析结果显示，连麦12的赤霉病抗性与苯丙烷类化合物、谷胱甘肽和黄酮类化合物等的合成代谢及植物信号激素转导和MAPK信号通路相关。Wu等（2022）研究表明，小麦通过激活苯丙烷类代谢来提高赤霉病Type抗扩展能力，推测其在感染早期的Type抗侵染中发挥作用。本研究发现，有100个DEGs富集到苯丙烷类代谢途径上，与Wu等（2022）研究结果相符，说明丙烷类代谢通路在连麦12对赤霉病病原菌的响应中发挥了重要作用。Wang等（2020）克隆谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase，GST）基因（Fhb7），其编码蛋白通过脱环氧化作用去除禾谷镰刀菌侵染产生的毒素，使得长穗偃麦草对赤霉病具有抗性，表明谷胱甘肽代谢途径与长穗偃麦草的赤霉病抗性密切相关。本研究结果也发现，DEGs显著富集到谷胱甘肽代谢途径，说明该途径也参与了连麦12对禾谷镰刀菌的侵染应答。PPI网络是基于蛋白质参加生命活动各个环节的相互作用构成，对了解生物中蛋白质的工作原理、疾病等特殊生理状态下生物信号和能量物质代谢的反应机制和蛋白质之间的功能联系具有重要意义。本研究筛选鉴定的10个核心响应基因中，Traes-CS5B02G160700、TraesCS5A02G163400和TraesCS7A-02G149000同属于小麦CCR基因。Ma（2007）、Fang等（2018）研究发现，上述3个基因参与调控木质素生物合成，对小麦茎秆的成熟和茎秆强度有重要影响。图 3DEGs的KEGG信号通路富集分析结果Fig.3KEGG signal enrichment pathway of DEGs1.000.750.500.250.00数量NumberQ500100015002000富集因子 Rich factor0.20.30.4玉米素生物合成 Zeatin biosynthesis二苯乙烯、二苯基庚烷，姜酚生物合成 Stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis植物学激素信号转导 Plant hormone signal transduction光合作用-天线蛋白 Photosynthesis-antenna proteins苯丙烷生物合成 Phenylpropanoid biosynthesis苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 Phenylalanine tyrosine and tryptophan biosynthesis苯丙氨酸代谢 Pheaylalsnine metabolism单萜生物合成 Nonoterpenoid biosynthesis代谢通路 Metabolic pathways植物Mapk信号通路 Mapk signaling pathway-plant亚油酸代 Linoleic acid metabolism乙醛酸和二羧酸代谢 Glyoxylate and dicarboxy late metabolism甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 Glycine，erine and threonne metabolism谷胱甘肽代谢 Glutathi