小麦衔接蛋白TaAP2-μ基因的克隆与功能分析.pdf

山东农业大学学报(自然科学版),2023,54(3):344-351VOL.54 NO.3 2023Journal of ShandongAgricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2023.03.002小麦衔接蛋白小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析基因的克隆与功能分析李天天,王如凯,王连慧,孙 琪,周淑梅*山东农业大学 生命科学学院,山东 泰安 271018摘摘 要要:衔接蛋白（Adaptor protein,AP-2）是细胞内吞途径重要的蛋白之一，在披网格蛋白小泡形成中与受体的细胞质结构域相互作用，起衔接作用，参与从细胞质膜形成的披网格蛋白的组装。实验从小麦济麦 44 克隆到了 TaAP2-基因，基因 ORF 长度为 1 317 bp，编码 438 个氨基酸，蛋白分子量为 49 kD。亚细胞定位结果显示该基因位于细胞质和细胞核。PlantCARE 启动子元件分析表明，TaAP2-基因的启动子序列包括参与光响应模块的顺势作用元件（ATCT-motif）、光反应元件（Sp1）、光调控元件（GATA-motif）、参与茉莉素内酯反应（CGTCA-motif 和 TGACG-motif）和玉米醇蛋白代谢（O2-site）的顺式作用调控元件等。qRT-PCR 结果表明，该基因在小麦的茎中含量最高，其次是叶，根中最少。并且该基因受到多种激素如 MeJA、SA、ABA 等处理的诱导表达，并且该基因对这三种激素都有不同程度的响应，说明可能参与激素调控的多项生理过程。该结果为进一步深入研究 TaAP2-的生物学功能奠定了基础。关键词关键词:小麦;衔接蛋白;基因克隆;功能分析中图法分类号中图法分类号:Q812文献文献标识码标识码:A文章编号文章编号:1000-2324(2023)03-0344-08Cloning and Functional Analysis of TaAP2-Gene of AdaptorProtein from WheatLI Tian-tian,WANG Ru-kai,WANG Lian-hui,SUN Qi,ZHOU Shu-mei*College of Life/Shandong Agricultural University,Taian 271018,ChinaAbstract:Adaptor protein,AP-2,is one of the most important proteins in cell endocytic pathway,which plays a bridging roleinteractingwiththecytoplasmicdomainofthereceptorintheassemblyof clathrinvesicles,andparticipatingintheassemblyofclathrinformedfromthecytoplasmicmembrane.Wecloned TaAP2-genefromwheat Jimai44,whoselengthof ORFis1 317bp,coding438amino acids and the molecular weight of the protein is 49 kD.We found that TaAP2-is located in the cytoplasm and nucleus bysubcellular localization.Andwe also found thatTaAP2-geneconsists of cis-actingregulatory elementsinvolvinglight responsiveness(ATCT-motif),light responsive element(Sp1),light regulatory element(GATA-motif),MeJA-responsiveness(CGTCA-motif andTGACG-motif)and zein metabolism regulation(O2-site)by online software Plant CARE.We detected that the stems of wheat has thehighest expression level of gene and roots has the lowest level by qRT-PCR.Moreover,the expression of the gene can be induced byMeJA,SA,ABA and the gene responds to the three hormones in different degrees,indicating it may be involved in a variety ofphysiologicalfunctionsthathormonesregulates.TheresultsbuiltafoundationforfurtherbiologicalstudyofTaAP2-.Keywords:Wheat;adaptor protein;gene clone;functional analysis小麦是世界三大粮食作物之首，是全球约 40%人口的主要食粮。我国的小麦种植面积和小麦产量都高于其他国家，2022 年小麦种植面积为 2 354.51 亿 m2，小麦产量 13 772.3 万 t1。小麦的生长常常会受到病虫害的侵染，严重影响小麦的质量和产量。赤霉病是影响小麦质量和产量的世界性病害之一，造成小麦产量的损失在全球病害中占第二位2。被病菌侵染的小麦籽粒会产生以 DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇，deoxynivalenol)为主的毒素3，威胁人畜健康。当植物受到病虫害的侵染时，会产生相关的信号分子进行相应，经过信号转导，激发对应抗病基因表达，最终抵御病原菌的入侵。常见的信号分子有茉莉酸(JA)4，水杨酸(SA)5，乙烯(ET)6等。网格蛋白介导的内吞作用（Clathrin-Mediated Endocytosis,CME)是指胞外物质通过进入网格蛋白包被的囊泡进入胞内。有研究证明，网格蛋白介导的内吞作用可以影响细胞的信号转导、生长发育、响应外界刺激、营养物质获取等过程7,8。Dhonukshe P 发现CME 与生长素运输的调控有关9，Irani NG收稿日期收稿日期:2022-12-25修回日期修回日期:2023-02-14基金项目基金项目:国家自然科学基金:小麦网格轻链蛋白基因 TaCLC1 参与调控赤霉病抗性的分子机制研究(31801270);山东省自然科学基金:小麦 TaCLC1 参与调控赤霉病抗性的功能分析(ZR2019MC006)第第 1 作者简介作者简介:李天天(2003-),女,本科生在读,研究方向:细胞生物学.E-mail:LITT*通讯作者通讯作者:Author for correspondence.E-mail:第 3 期李天天等:小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析345发现 CME 与油菜素类固醇（BR）信号转导有关10。Sharfman M 和 Adam T 发现 CME 与病原体反应有关11,12，衔接蛋白（Adaptor Protein）是指在网格蛋白组装过程中衔接网格蛋白与受体胞质结构域的一类蛋白复合体，可为大分子结构复合物的合成提供支架，参与细胞中活化胞内信号的整合和传递。至此，在植物中共发现了 5 种 AP 复合体，分别为 AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-513，其中AP-2 是从细胞质膜形成网格蛋白过程的重要物质。AP-2 复合体是异源四聚体，由两个大亚基（和）、一个中间亚基（）和一个小亚基（）组成。其中中间亚基负责货物蛋白的识别和分拣，NPXY、YXX和 dileucine motifs 可以被它识别（N 代表天冬酰胺，P 代表脯氨酸，Y 代表酪氨酸；X 代表任意氨基酸；代表疏水性氨基酸）14，这些信号存在于货物蛋白的胞质端。有研究表明亚基所在AP-2 复合体在细胞生长、信号传导以及响应对外界环境的刺激等多种生物进程都发挥了重要作用7,8。植物吸收营养物质的部位主要是根和叶，主要是细胞的主动与被动吸收，由于细胞膨压的存在，长期以来人们认为植物不通过内吞作用吸收营养物质。对内吞作用的研究大多以动物为研究对象。但膨压不现已有研究表明细胞会影响植物细胞内吞作用的发生15。而且实验数据表明，CME 的调节机制在植物和哺乳动物之间是保守的16。并且与内吞作用相关物质在植物细胞中被发现，因此其在植物细胞中的功能也越来越被重视。Bashline L 等发现在拟南芥中纤维素合成酶的合成的过程中，AP-2 的亚基发挥了重要的运输作用17，Kim SY 等发现在拟南芥中 AP-2 对花粉的活力以及产量和雄蕊花丝和花粉管的伸长率有重要影响，而且施加外源生长素可以部分挽救，可推测 AP-2 与生长素的信号转导有关18。但截至目前为止，对于植物细胞内 AP-2 蛋白的研究大部分限制于拟南芥这一模式植物中，在其他物种中的研究较少。亚基的功能在其他方面也没有被完全阐述。本实验以小麦济麦 44 为材料，分离克隆得到了小麦 TaAP2-基因，对其进行了生物信息学特点分析，并研究了该基因对多种激素处理的响应分析，为后期该基因提供的功能探究思路并打下基础。1材料与方法材料与方法1.1实验材料实验材料供试材料为小麦品种济麦 44，小麦种子由本实验室保存种植。实验中作用的菌种为农杆菌GV3101、超表达载体超表达载体 pROK由实验室制备并保存。试剂 T4 DNAligase，以及各类限制性内切酶均从 Thermo Fisher 公司购买；2mix、DNA Marker、购买于 Vazyme 公司；胶回收试剂盒、反转录盒试剂等购买于天根生化有限公司；荧光染料混合液 SYBR、用于 qRT-PCR 的 96 孔板，购买于 Roche 公司。1.2实验方法实验方法1.2.1 小麦 TaAP2-基因的克隆1.2.1.1 RNA 的提取：使用常用的 Trizol 法提取植物总 RNA。1.2.1.2 cDNA 的合成 以上一步提取的 RNA 为模板，采用试剂盒法，反转录反应体系如下：5FastKing-RT Supermix4.0 LTotal RNA50 ng2 gRNase-Free ddH2OUp to 20 L将 cDNA 产物置于-20 存储备用。1.2.1.3 基因扩增 Ensembl plants(http:/plants.ensembl.org/index.html 中下载 TaAP2-基因序列。并设计一对引物，序列为：2F-MU：GTCAAGGGTGGTGGTCCCA2R-MU：CGCCATTTTTCTTGGTCACTAACACC以上一步获得的 cDNA 作为模板，进行 PCR 扩增，本次实验具体反应如下：cDNA 模板1.0 LdNTP1.0 L引物-F1.0 L引物-R1.0 L10PCR Buffer2.5 LTaq 酶0.2 LddH2OUp to 25 L346山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷然后用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因扩增结果。1.2.1.4 胶回收目的基因片段 采用试剂盒法进行对上一步中目的基因片段胶回收。1.2.2 目的基因与克隆载体的连接 连接基因片段与克隆载体 pROKII，加入物质如下：组分加入量目的基因片段4.5 LpROKII simple vector0.5 LSolution I5 L混匀后放置于 16 金属浴中过夜连接目的基因与克隆载体。1.2.3 转化大肠杆菌感受态细胞 使用实验室常用方法将构建好的载体转入大肠杆菌中并培养。1.2.4 菌液 PCR 鉴定 以培养基长出来的菌落为模板进行菌液 PCR，实验反应体系如下：模板1 L引物-F0.8 L引物-R0.8 L2Mix Taq 酶10 LddH2O7.4 L然后用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。之后将信号强度大对应的菌株挑点加入到 20 mL 相应抗性 LB 液体培养基，培养过夜。1.2.5 小量提取质粒 使用试剂盒法提取质粒。1.2.6 质粒 DNA 的酶切 用相对应的酶双酶切目的基因和表达载体，酶切体系如下：质粒16 L核酸内切酶 12 L核酸内切酶 22 L10酶切 buffer4 LddH2OUp to 40 L将上述溶液混匀后放置于金属浴中反应 1.52 h。1.2.7 目的基因与表达载体连接 将目的基因与表达载体连接，加入体系如下目的片段3 L表达载体5.85 LT4 连接酶0.15 LT4 连接酶 buffer1 L充分混匀后，室温条件下连接 2 h。再将连接产物进行转化农杆菌、菌液 PCR、提取质粒酶切鉴定、测序检测。1.2.8 转化农杆菌 将构建好的表达载体转化进入农杆菌感受态细胞。1.2.9 生物信息学分析 在线网站 EnsemblPlants 分析基因和启动子序列。利用在线网站 PlantCARE对 TaAP2-基因的启动子区域进行顺式作用元件分析。利用 NCBI-ORF finder 工具获取 TaAP2-基因的开放阅读框和氨基酸序列；利用 NCBI 网站中的 Conserved Domain database 数据库分析蛋白质的保守结构域；利用 NCBI 网站中的 BLAST 功能，搜索同源序列，用 MEGA 件对不同物种间 TaAP2-构建系统进化树；利用 Prabi 网站对蛋白质二级结构进行预测。利用 Swissmodel 网站对蛋白质的三级结构进行预测。利用在线网站 Expasy-Prot-Param 对该蛋白基本理化性质进行分析。1.2.10 亚细胞定位（1）活化之前保存的pROKII-GFP、pROKII-TaAP2-GFP表达载体的弄干GV3101菌种，吸取 200 L 菌液加入到 10 mL 含有相应抗性的 YEP 培养基中，28 下震荡培养过夜；（2）吸取 500 L 上一步活化的菌液于含有相应抗性的 YEP 培养基中，28 下培养至 OD600值到 1.5。（3）使用 4 离心机 5 000 rpm 离心 10 min，收集菌体。用预先配置好的 MMA 重悬沉淀菌体，使重悬液体 OD600=1.0，黑暗条件下处理 5 h；。（4）将含上一步获得的重悬液与溶液 P19 进行混合，注射烟草，然后在温室中培养 34 d。（5）使用双光子共聚焦显微镜观察。MMA 配方（10 mL）：第 3 期李天天等:小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析3471 M MES0.1 mL1 M MgCl20.1 mL0.2 MAS10 LddH2OUp to 10 mL1.2.11 TaAP2-基因组织表达特异性（1）分别提取小麦根、茎、叶，提取 RNA。（2）利用上述引物和方法合成 cDNA。（3）以 cDNA 为模板进行荧光定量 PCR，本次实验具体反应如下:cDNA 模板1.0 LSYBR7.5 L引物-F1.0 L引物-R1.0 LDdH2O5.0 L1.2.12 TaAP2-对激素响应分析 将小麦幼苗移至营养基质中，培养条件为 25，16 h 光照 8 h 黑暗,连续培养大约 28 d，分别喷施 1 mM SA、50 M MeJA 和 100 M ABA，再分别处理后 0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 取样，提取 RNA，利用上述方法进行荧光定量 PCR。2结果与分析结果与分析2.1TaAP2-基因的克隆基因的克隆我们根据数据库 EnsemblPlant(http:/plants.ensembl.org/index.html)查到基因序列并据此设计引物：2F-MU：GTCAAGGGTGGTGGTCCCA2R-MU：CGCCATTTTTCTTGGTCACTAACACC基因扩增结果见图 1，条带大小符合预期，测序显示该片段长度为 1 317 bp。通过 Ensemble Plant网站分析可知，小麦衔接蛋白 TaAP2-的开放阅读框长度为 1 317 bp，编码 438 个氨基酸，其中缬氨酸含量最高，组氨酸含量最低。图图 1 TaAP2-的的 PCR 电泳结果电泳结果Fig.1 PCR result of TaAP2-M：DNAMarker 5kP1、P2：cDNA 扩增产物M:DNA MarkerP1,P2:cDNAAmplification products图图 2 TaAP2-编码的蛋白中氨基酸含量分布编码的蛋白中氨基酸含量分布Fig.2 Distribution of amino acid content in proteins encoded by TaAP2-2.2TaAP2-基因的生物信息学分析基因的生物信息学分析2.2.1 蛋白保守序列分析 利用在线网站 NCBI 中的 Conserved Domain Database 功能对 TaAP2-蛋白的保守结构域进行分析，结果如图 3 所示。从图中可以看出，第 6 到 144 个氨基酸是保守序列，属348山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷于 AP2-蛋白 N 端，且属于 longin-like 超家族。第 174 到 437 个氨基酸组成的序列也是保守结构域，是 AP2-2 的 C 端，属于 AP_MHD_Cterm 超家族。图图 3 TaAP2-蛋白序列分析结果蛋白序列分析结果Fig.3 The result of Protein sequence analysis2.2.2 蛋白二级结构预测 利用在线网站 Prabi 对蛋白的二级结构进行预测，结果如图 4（A）、（B）所示，无规卷曲有 194 个氨基酸，占比最高，达 44.29%，延伸连有 115 个氨基酸，占 26.26%，螺旋有 103 个氨基酸，占 23.52%，转角有 26 个氨基酸，占 5.94%。图图 4 TaAP2-蛋白二级结构及组成分析、三级结构预测结果图蛋白二级结构及组成分析、三级结构预测结果图Fig.4PredictionofthesecondarystructureandCompositionalanalysis,three-dimensionalstructure ofTaAP2-proteinspace（A）TaAP2-蛋白二级结构分析结果；（B）TaAP2-蛋白二级结构组成分析结果；（C）TaAP2-蛋白三级结构预测图注图 4（A）：蓝色为-螺旋；红色为延伸链；绿色为-转角；(A)Prediction of the secondary structure of TaAP2-protein space；(B)Compositional analysis of secondary structure of TaAP2-proteinspace；(C)Prediction of the three-dimensional structure of TaAP2-protein space.Blue:-helix;Red:extended strand;Green:-turn.2.2.3 蛋白三级结构预测 使用 SWISS-MODEL 网站预测蛋白质的三级结构。结果显示 GMQE 值为0.76，QMEAND 值约为 0.71，表明该结果可用。从图 4（C）中看出该蛋白的结构主要由螺旋和无规卷曲构成，该结果与上述二级结构预测结果一致。2.2.4 蛋白理化性质 使用在线网站 Expasy-Prot-Param 分析该蛋白质的理化性质，结果如表 1 所示。结果显示共有 438 个氨基酸，分子质量为 49 211.43，含有 6 994 个原子，理论等电点为 9.32，为碱性蛋白，含量最高的氨基酸为缬氨酸，占总氨基酸的 10.3%，其次为亮氨酸，占总氨基酸的 8.7%，总共带正点残基（Arg+Lys）有 58 个，带负电残基（Asp+Glu）有 44 个，中性条件下带正电。脂肪系数为 90.91，平均亲水系数为-0.041，不稳定系数为 33.80，认为该蛋白是稳定的。表表 1 TaAP2-蛋白理化性质分析蛋白理化性质分析Table 1Analysis of physicochemical properties of TaAP2-protein项目TaAP2-氨基酸数目/个438分子质量/ku49211.43分子式C2220H3538N584O629S23理论等电点9.32带正点残基（Arg+Lys）/个58带负电残基（Asp+Glu）/个44不稳定系数(II)33.80脂肪系数90.91平均亲水系数-0.041第 3 期李天天等:小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析3492.2.5 TaAP2-蛋白的进化树构建 利用在线网站 NCBI 中的 BLAST 功能筛选到其他物种的 AP2-蛋白序列，并使用 MEGA11 软件获得进化树，结果如图 5 所示，表明小麦中的 TaAP2-蛋白与节节麦和二柄短穗草 AP2-蛋白的亲缘关系最近，相似度高达 99%。各个种类之间该蛋白的氨基酸序列组成相似，进化关系上相差不大，说明植物中广泛存在该类蛋白。图图 5 TaAP2-蛋白的同源进化树蛋白的同源进化树Fig.5 Homologous phylogenetic tree of TaAP2-proteins2.2.6 启动子作用元件分析 利用小麦基因组数据库 EnsemblPlant 获得 TaAP2-基因的完整序列，并利用在线网站 PlantCARE 对启动子序列进行顺势作用元件分析，结果如表 2 所示。TaAP2-基因的启动子序列主要包括参与光响应模块的顺势作用元件（ATCT-motif）、光反应元件（Sp1）、光调控元件（GATA-motif）、参与茉莉素内酯反应（CGTCA-motif 和 TGACG-motif）和玉米醇蛋白代谢（O2-site）的顺式作用调控元件。表表 2 TaAP2-启动子启动子作用元件分析结果作用元件分析结果Table 2Analysis results of TaAP2-promoter action elements名称Name结构Structure功能Function数量Number位置PositionATCT-motifAATCTAATCC参与光响应模块的顺势作用元件1289299Sp1GGGCGG光反应元件1813GATA-motifAAGATAAGATT光调控元件1288298CGTCA-motifCGTCA参与茉莉素内酯反应的顺式作用调控元件16973TGACG-motifTGACG参与茉莉素内酯反应的顺式作用调控元件16973O2-siteGATGACATGG参与玉米醇溶蛋白代谢的顺式作用调控元件14874962.3TaAP2-基因定位于细胞质和细胞核基因定位于细胞质和细胞核将前期构建的 pROKII-GFP 和 pROKII-TaAP2-GFP 表达载体转化至农杆菌 GV3101 中，侵染烟草叶片，置于温室中培养 3 d 后，观察绿色荧光的分布情况，结果如图 6 所示，对照组细胞中细胞质和细胞核处都有绿色荧光，实验组细胞质和细胞核也有绿色荧光，说明该基因定位于细胞质和细胞核中。图图 6 TaAP2-基因亚细胞定位基因亚细胞定位Fig.6 Subcellular localization analysis of TaAP2-gene350山东农业大学学报(自然科学版)第 54 卷2.4TaAP2-的表达模式分析的表达模式分析用荧光定量 PCR 以检测小麦不同组织（根、茎、叶）中 TaAP2-基因的表达情况。由图 7A 可见该基因 TaAP2-基因在小麦不同的组织中的表达情况皆不同，其中在茎中表达量最高，根部最低，由此可表明 TaAP2-基因在根、茎、叶中都可以表达，在茎中表达量最高。为了进一步研究 TaAP2-的生物学功能，分别使用 1 mM 水杨酸（SA）、50 M 茉莉酸甲酯（MeJA）和 100 M 脱落酸（ABA）处理连续生长 28 d 的小麦幼苗，对照组使用清水处理。由图 7（A）、7（B）、7（C）中可见，在用 1 mM 水杨酸（SA）处理后，第 1 h、6 h、12 h TaAP2-基因的表达量都有明显升高。在用 50 M 茉莉酸甲酯（MeJA）处理后 24 h 时出现了峰值，与对照组相比有明显的差异。在利用 100 M 脱落酸（ABA）处理后，第 3 h 出现了峰值，第 6 h 表达量明显降低。且 TaAP2-基因在用该三种激素处理之后立刻出现了表达量的差异。这些表明 TaAP2-基因对 MeJA、SA、ABA处理产生响应，可能参与 MeJA、SA、ABA 三种激素的作用过程，尤其是 MeJA 的作用进程。图图 7 TaAP2-表达模式分析表达模式分析Fig.7 Expression module analysis of TaAP2-（A）TaAP2-组织特异性分析；（B）TaAP2-在激素 MeJA 处理下表达模式分析；（C）TaAP2-在激素 SA 处理下表达模式分析；（D）TaAP2-在激素 ABA 处理下表达模式分析(A)Tanatospecific analysis of TaAP2-;(B)Analysis of expression patterns of TaAP2-under hormonal MeJAtreatment;(C)Analysis ofexpression patterns of TaAP2-under hormonal SA treatment;(D)Analysis of expression patterns of TaAP2-under hormonal ABA treatment.3讨讨 论论植物细胞膨压的存在使人们长时间以来不认为植物细胞同样存在内吞途径，自从在植物细胞内发现了内吞作用的相关成分，内吞作用才获得关注。且已被证明网格蛋白介导的内吞作用（Clathrin-Mediated Endocytosis,CME)是拟南芥体内主要的内吞途径19，而且 AP2-2 在内吞途径中起着与质膜对接，同时招募货物蛋白、网格蛋白三联体和辅助蛋白到内吞位点等作用20-22，是 CME的核心。Bashline L 等发现在拟南芥中，AP2-2 定位于细胞质膜上，与网格蛋白介导的内吞作用存在的位置一致。AP2-2 突变体细胞内内吞作用发生的次数少于野生型，加入 AP2-2 启动子后，突变体的内吞作用发生次数增加，且2-YFP 在黑暗中生长的下胚轴中表现出随着时间变化的点状分布，与参与网格蛋白介导的内吞途径的动力蛋白和网格蛋白轻链相似，可以得出 AP2-2 参与了网格蛋白介导的内吞作用，而且与纤维素合成酶在功能性上相关。Kim SY 等研究表明 AP-2 可以通过调节 PIN数量和细胞生长素水平来调节拟南芥雄性器官的发育。本实验通过对 TaAP2-基因的克隆、生物信息学分析，说明了 TaAP2-基因和蛋白的主要特性，亚细胞定位的结果显示在细胞膜内侧部分区域第 3 期李天天等:小麦衔接蛋白 TaAP2-基因的克隆与功能分析351分布较多，猜测可能是由于正在进行内吞作用。基因组织表达模式结果显示 TaAP2-基因在茎中的表达量最高，可能是参与了纤维素酶的合成反应。本研究通过对 TaAP2-基因进行了基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、基因组织表达模式分析、不同激素下的响应分析，为进一步研究 TaAP2-的生物学功能奠定了基础，为小麦的生长发育研究提供了候选基因。参考文献参考文献1国家统计局.关于 2022 年粮食产量数据的公告R/OL.(2022-12-12)2022-12-25.http:/ M，Hammondkosack KE，Solomon PS.A review of wheat disease-a field perspective J.Molecular PlantPathology,2018,19(6):1523-15363王裕中,米勒 JD.中国小麦赤霉病菌优势种禾谷镰刀菌产生毒素能力的研究J.真菌学报,1994,13(3):229-2344Desmond OJ,Edgar CI,Manners JM,et al.Methyl jasmonate induced gene expression in wheat delays symptomdevelopment by the crown rot pathogen Fusarium pseudograminearum J.Physiological and Molecular PlantPathology,2005,67:171-1795Janda T,Szalai G,Magda Pl.Salicylic acid signalling in plants J.Journal of Molecular Science,2020,21(7):26556AnC,MouZ.SalicylicacidanditsfunctioninplantimmunityJ.JournalofIntegrativePlantBiology,2011,53(6):412-4287Flynn DC.Adaptor proteins J.Oncogene,2001,20:627062728Lacruz RS,Brookes SJ,Wen X,et al.Adaptor protein complex 2-mediated,clathrin-dependent endocytosis,andrelated gene activities,are a prominent feature during maturation stage amelogenesis J.Journal of Bone and MineralResearch,2013,28(3):6726879Dhonukshe P,Aniento F,Hwang I,et al.Clathrin-mediated constitutive endocytosis of PIN auxin efflflux carriers inArabidopsis J.Curr.Biol,2007,17:52052710 Irani NG,Rubbo SD,Mylle E,et al.Fluorescent castasterone reveals BRI1 signaling from the plasma membrane J.Nature Chemical Biology,2012,8(6):58358911 Sharfman M,Bar M,Ehrlich M,et al.Endosomal signaling of the tomato leucine-rich repeat receptor-like proteinLeEix2 J.Plant J,2011,68:413-42312 Adam T,Bouhidel K,Der C,et al.Constitutive expression of clathrin hub hinders elicitor-induced clathrin-mediatedendocytosis and defense gene expression in plant cells J.FEBS Lett,2012,586:3293-329813 Hirst JD，Barlow L,Francisco GC,et a1.The fifth adaptor protein complex J.PLoS Biology,2011,9(10):e100117014 Sorkin A.Cargo recognition during clathrin-mediated endocytosis:a team effort J.Current Opinion in Cell Biology,2004(16):392-39915 GradmannD,RobinsonDG.Doesturgorpreventendocytosisinplantcells?J.Plant,Cell&Environment,1989,12(2):15115416 Bar M,Avni A.EHD2 inhibits ligand-induced endocytosisand signaling of the leucine-rich repeat receptor-likeprotein LeEix2 J.Plant J,2009,59:60061117 Bashline L,Li S,Anderson CT,et al.The endocytosis of cellulose synthase in Arabidopsis is dependent on 2,aclathrin-mediated endocytosis adaptin J.Plant Phisiology,2013,163(1):15016018 Kim SY,Xu ZY,Song K,et al.Adaptor protein complex 2-mediated endocytosis is crucial for male reproductive organdevelopment in Arabidopsis J.Plant Cell,2013,25(8):2970-298519 Holstein SE.Clathrin and plant endocytosis J.Traffific,2002,3:61462020 CocucciE,AguetF,BoulantS,etal.Thefifirstfifivesecondsinthelifeofaclathrin-coatedpitJ.Cell,2012,150:49550721 McMahon HT,Boucrot E.Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis J.NatRev Mol Cell Biol,2011,12:51753322 Jackson LP,Kelly BT,McCoy AJ,et al.A large-scale conformational change couples membrane recruitment to cargobinding in the AP2 clathrin adaptor complex J.Cell,2010,141:1220-1229