透明质酸修饰的海藻酸钙复合水凝胶及其载药抗菌性能 (1).pdf

济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4DOI:10.3969/j.issn.1000-9760.2023.04.001基础医学透明质酸修饰的海藻酸钙复合水凝胶及其载药抗菌性能肖圣汇1李响2舒心1范智宇1韩昊昱1李兆楼3基金项目济宁医学院大学生创新训练计划资助项目(cx2022248)通信作者李兆楼,E-mail:jnzhaolou (1济宁医学院临床医学院,济宁 272013;2山东理工职业学院能源与材料工程学院,济宁 272067;3济宁医学院基础医学院,济宁 272067)摘 要 目的 合成海藻酸钙/透明质酸/羟丙基-环糊精复合水凝胶,研究透明质酸对该凝胶的影响。方法利用溶胶-凝胶法合成该复合凝胶;使用光学显微镜(OM)、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱(IR)、X 射线衍射(XRD)、流变学等研究凝胶结构、性质性能等;采用牛津杯法测试左氧氟沙星凝胶制剂的抗菌效果。结果透明质酸以氢键结合海藻酸钙,妨碍了海藻酸钙凝胶的多糖链带状和网状微结构的聚集,增大了网状空隙而利于载药;其左氧氟沙星凝胶制剂作用于金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌,抑菌效能可分别达到对照标准的 85.2%和 91.7%。结论透明质酸优化了海藻酸钙复合凝胶的微结构和性能;新型复合凝胶合成方法简便,其左氧氟沙星凝胶制剂具有良好的抑菌效果。关键词海藻酸钙;透明质酸;羟丙基-环糊精;复合凝胶;抗菌效果中图分类号:O656.9 文献标识码:A 文章编号:1000-9760(2023)08-229-05A composite hydrogel based on calcium alginate modified by hyaluronic acid and its bacteriostatic performance as drug carrierXIAO Shenghui1,LI Xiang2,SHU Xin1,FAN Zhiyu1,HAN Haoyu1,LI Zhaolou3(1School of Clinical Medicine,Jining Medical University,Jining 272013,China;2School of Energy and Materials Engineering,Shandong Polytechnic College,Jining 272067,China;3College of Basic Medicine,Jining Medical University,Jining 272067,China)Abstract:ObjectiveA composite hydrogel based on calcium alginate(CA)with hydroxypropyl-cyclodextrin(HPCD)is synthesized in presence of hyaluronic acid(HA),and its micro-structure,physical properties and formation mechanism are investigated.The antibacterial effect of levofloxacin(LVFX)loaded within hydrogel will be verified.MethodsThe composite hydrogel was synthesized by sol-gel method,and its structure and properties were studied by optical microscopy(OM),scanning electron microscope(SEM),Fourier infrared spectroscopy(IR),X-ray diffraction(XRD)and rheology.The antibacterial effect of the gel with levofloxacin was tested by Oxford cup method.ResultsThe composite hydrogel was successfully acquired.The molecular chains of HA entangled with the molecular straps of CA relying on H-bond force,which hindered CA chain aggregation or expansion of CA gel network.This resulted to more holes or interspace within the hydrogel network for drug loading.The antibacterial efficacy of LVFX within the hydrogel could reach about 85.2%and 91.7%to the positive antibacterial control on Staphylococcus aureus and Escherichia coli,respectively.ConclusionThe composite gel can be acquired in a direct and easy method.The microstructure and properties of CA/HPCD hydrogel were optimized by the participation of HA.The new composite hydrogel deserves to be widely applied as drug carrier.Keywords:Calcium alginate;Hyaluronic acid;Hydroxypropyl-cyclodextrin;Composite hydrogel;Antibacterial effect922济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4 海藻酸钙(calcium alginate,CA)水凝胶网络形成能力较强,具有生物相容性、生物降解性、非抗原性等,在药物传递和控制释放领域受到了广泛的关注及应用1。海藻酸钠(sodium alginate,SA)与Ca2+离子交联很容易形成 CA 水凝胶2。SA 作为线形聚阴离子多糖,其分子是由-D-甘露糖醛酸(M 单元)和-L-古洛糖醛酸(G 单元)通过 1,4-糖苷键连接而成的共聚物,一个 Ca2+离子可以与 SA链上的两个 G 单元进行配位结合形成“蛋盒”结构2。但 CA 水凝胶网络容易收缩导致脱水3,所载的活性成分也会随之排出而使活性降低。若利用透明质酸(hyaluronic acid,HA)钠盐与 CA 构筑复合凝胶,可以弥补上述 CA 水凝胶的不足。HA具有较强的吸水保水作用4,其分子是由-D-葡萄糖醛酸和-D-N-乙酰氨基葡萄糖分子之间分别通过-1,3-糖苷键和-1,4-糖苷键相连形成双糖重复单元的长链多糖。HA 水凝胶具有多孔性、水膨胀性、生物相容性、可生物降解性和抗非特异性细胞黏附性等5。在 CA/HA 凝胶体系中,加入羟丙 基-环 糊 精(hydroxypropyl-cyclodextrin,HPCD)6,利用其大环空腔对抗菌药物左氧氟沙星的包合作用,可更好地实现药物运转和控制释放。1 资料与方法1.1 试剂与仪器SA(天津市科密欧化学试剂有限公司);HPCD(上海源叶生物科技公司),其平均分子量为1541.54g/mol;无水氯化钙(天津市凯通化学试剂有限公司);透明质酸钠(上海源叶生物科技公司);Mueller-Hinton 琼脂(杭州微生物试剂有限公司),大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)由济宁医学院病原生物学实验室提供。乳酸左氧氟沙星(北京亚赛尔科技有限公司),其它试剂均为分析纯。JCM-7000 NeoScope TM 台式扫描电子显微镜;Olympus BX51 光学显微镜;PE/Frontier 铂金埃尔默(英国)傅里叶红外光谱仪;RheoStress 6000 rheometer 流变仪;German Bruker/D8ADVANCE X射线衍射仪。1.2 复合凝胶的制备称取 SA 0.1224g,透明质酸钠 0.1020g,HPCD 0.06120g 放入比色管中,加蒸馏水 5ml,超声,于75下恒温搅拌 3h,冷却到室温;再向比色管中滴加 1ml 0.1mol/L CaCl2溶液,边滴边搅拌,直至凝胶形成。按上述程序操作,不加透明质酸钠,得到CA/HPCD 凝胶样品,备用。将上述所得凝胶,置于冰箱内 5冷藏 24h,置于真空干燥箱内,保持低温-5减压干燥 7d,得干凝胶样品。1.3 复合凝胶的表征使用光学显微镜,观察凝胶样品的结构与形貌,拍照得到 OM 图片。将干凝胶进行喷金后,用电子扫描显微镜观察结构与形貌,拍照得 SEM 图。采用流变仪,在 25进行动态应变扫描,在线性黏弹性范围内对凝胶样品扫频分析,平行测定 3 次结果求平均值。采用 KBr 压片法,使用红外光谱仪测定,得干凝胶样品红外光谱图。将干凝胶样品置于样品池,用 X 射线衍射仪扫描,记录谱图。1.4 载药凝胶的制备配制一定浓度左氧氟沙星溶液,稀释成 16g/ml和 4g/ml 两种稀溶液,然后分别加入 0.06120g HPCD,溶解后放置暗处 24h,形成包合液。称取SA 0.1224g 和透明质酸钠 0.1020g 放入比色管中,搅拌下加入上述(16g/ml 或 4g/ml)包合液5ml,于 75下恒温搅拌 3h,冷却到室温;向比色管中滴入 1ml 0.1mol/L CaCl2溶液,边滴边搅,直至载药凝胶形成。1.5 载药凝胶的抑菌测试采用牛津杯法测试左氧氟沙星水凝胶的抑菌效果。左氧氟沙星载药量 16g/ml 凝胶用于金黄色葡萄球菌抑菌测试,而载药量 4g/ml 凝胶用于大肠埃希氏菌。将 100L 药物凝胶、100L 空白对照凝胶和同浓度左氧氟沙星溶液(阳性对照)分别注入含有 105CFU/ml 测试菌株的有盖培养皿,在37下培育 24h。测量凝胶斑点区的抑菌圈直径,3 次平行测定求平均值。2 结果与讨论2.1 凝胶的微观形貌CA/HPCD 鲜凝胶具有一些长条带状构成的网络结构(图 1a),带状宽度在 125m,长度可达560m;CA/HA/HPCD 鲜凝胶,同样是一些长条带状的网络结构(图 1b),其宽度变小,凝胶网络不那么致密,说明 HA 加入妨碍了 SA 与 Ca2+的配位结合。CA/HPCD 干凝胶的不规则长形块状结构(图1c),其宽度从 8m 到 40m 左右不等,应该是鲜032济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4凝胶带状结构在冷冻干燥中受挤压造成的;而 CA/HA/HPCD 干凝胶,有一些更小的不规则碎薄片状结构(图 1d),形成更多的缝隙和空洞,可能是 HA加入体系后吸收了更多水分,从而分隔了凝胶网络未能大量聚集。因此,在新型 CA/HA/HPCD 凝胶体系中,HA 可能未能与 Ca2+配位结合,反而是妨碍 SA 与 Ca2+的配位结合,分隔其凝胶网络。注:a 和 c,CA/HPCD 凝胶;b 和 d,CA/HA/HPCD 凝胶。图 1 复合凝胶的光学显微镜照片(a,b)与电子扫描电镜图(c,d)2.2 凝胶的流变学性质如图 2a 所示,在 1Pa 外加应力下频率扫描测试,CA/HPCD 水凝胶和 CA/HA/HPCD 水凝胶的G和 G”值并不随频率变化而变化(图 2a),且都保持 GG”不变。这说明体系加入 HA 前后都具有正常的凝胶特性7。在频率 1Hz 下以指数形式施加应力,对上述两个水凝胶体系进行振幅扫描(图 2b),发现加入 HA 后,复合凝胶结构的应力屈服值从 45Pa 下降到了 25Pa,CA/HA/HPCD 水凝胶的 G值也有所降低,说明加入 HA 使得凝胶的黏弹性网络变弱8,凝胶网络结构变得疏松。2.3 红外光谱分析一般地,红外光谱3100cm-13500cm-1吸收带归属为多糖分子 O-H 键伸缩振动吸收5,9,或 N-H键伸缩振动吸收。如图 3a 所示,CA/HA/HPCD 复合凝胶在 3415cm-1和 3160cm-1处呈现一双谷宽峰,反映多糖分子 O-H 键振动吸收,与 HA 分子N-H 键 振 动 发 生 吸 收 峰 交 叠。其 中,凝 胶 的3415cm-1处宽峰(图 3a)是原料 SA(图 3c)分子O-H 键 3435cm-1吸收红移所致;而 3160cm-1处宽峰(图 3a)是 原 料 HA(图 3d)分 子 O-H 键3393cm-1吸收和原料 HPCD 分子(图 3e)O-H 键3412cm-1吸收红移所致。这说明凝胶内部多糖分子之间发生了 O-H 之间的氢键相互作用。对照CA/HPCD 凝胶特征吸收 3314cm-1处的宽峰(图3b),它是原料 SA 分子的 O-H 键 3435cm-1吸收(图 3c)和原料 HPCD 分子 O-H 键 3412cm-1吸收(图 3e)红移所致。观察图 3d 发现,原料 HA 分子并未出现 C=O 的振动吸收(1730cm-1附近),不排除乙酰基已水解掉的可能10。注:a.频率扫描图;b.振幅扫描图。图 2 复合凝胶的动态流变图CA/HA/HPCD 凝胶(图 3a)中 1620cm-1和1403cm-1吸收峰,分别归属为羧基基团-C=O 不对称伸缩振动和 C-O 对称振动吸收,对应着原料 SA分子羧基中 1611cm-1和 1418cm-1(图 3c)吸收峰或原料 HA 分子羧基中 1619cm-1和 1411cm-1(图3d)吸收改变所致。这说明凝胶内部 SA 分子羧基与 Ca2+发生了配位结合,因 SA 分子与 Ca2+发生配位竞争能力远大于 HA 分子的能力11-12;另从流变学结果看,HA 分子羧基与 Ca2+未发生配位结合的可能性大。同样对比图 3b,CA/HPCD 凝胶显出的 1612cm-1和 1024cm-1吸收峰,是原料 SA 分子132济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4羧基中 1611cm-1和 1418cm-1(图 3c)吸收峰的变化而来,说明凝胶内部 SA 分子羧基与 Ca2+发生了强的配位结合。注:a.CA/HA/HPCD 干凝胶;b.CA/HPCD 干凝胶;c.SA 原料;d.HA 原料;e.HPCD 原料。图 3 复合凝胶及其原料的红外光谱2.4 X 射线粉末衍射(XRD)谱图分析如图 4 所示,CA/HA/HPCD 凝胶在 2 值为19.0处呈现一个较宽泛的峰(图 4a),CA/HPCD凝胶(图 4b)在 20.95处呈现一个较宽泛的峰,说明二者都具有无定形结构。而原料 XRD 图谱中,SA 在 13.8和 21.9附近出现稍尖的衍射峰(图4c),HA 在12.3和19.7附近出现尖锐衍射峰(图4d),HPCD 在 10.6和 18.4处出现强的衍射峰(图 4e),表明这些原料均具有一定的晶体或半晶体性质13。形成凝胶后,原料失去了晶体性质,多糖分子相互纠缠在一起,生成无定形结构的凝胶。2.5 载药凝胶的抗菌测试效果采用抑菌圈法判定凝胶载药左氧氟沙星的抑菌效果。对于金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌,其载药凝胶周围均出现清晰的抑菌圈,而空白凝胶周围均具有密集的细菌菌落。将抑菌圈相对大小(%)进行定量计算(图 5),对于金黄色葡萄球菌,CA/HA/HPCD 载药凝胶斑点周围呈现的抑菌圈直径,相对于阳性对照达到了 85.2%(图 5a);对于大肠埃希氏菌,CA/HA/HPCD 载药凝胶斑点周围的抑菌圈直径,相对达到了 91.7%(图 5b);这表明凝胶本身无抑菌作用,而装载左氧氟沙星的凝胶对细菌显示出显著的生长抑制作用。因此,CA/HA/HPCD 复合水凝胶,可应用于抗菌药物制剂的工业生产。注:a.CA/HA/HPCD 干凝胶;b.CA/HPCD 干凝胶;c.SA 原料;d.HA 原料;e.HPCD 原料。图 4 复合凝胶及其原料的 XRD 图谱对比注:a.金黄色葡萄球菌;b.大肠埃希氏菌;将与载药凝胶中相同浓度左氧氟沙星作阳性对照,37下培育 24h。图 5 CA/HA/HPCD 载药凝胶和空白凝胶抑制菌株的抑菌圈定量分析3 结论HA 的生物兼容性和强亲水性,改善了新型CA/HA/HPCD 水凝胶的微结构和性能。研究表明,原料 SA 与 Ca2+离子配位结合形成 CA 的多糖链状和网状凝胶结构,而强吸水性的原料 HA 被困于其中而形成更多的空隙,使得复合水凝胶富含水分、硬度降低、黏弹性良好;同时利用了 HPCD 包合作用对药物分子进一步控制,有利于药物和活性成分的装载与运转;新型 CA/HA/HPCD 水凝胶应用于左氧氟沙星药物制剂,抑菌效果十分显著。利益冲突:所有作者均申明不存在利益冲突。参考文献:1Shilova SV,Mirgaleev GM,Barabanov VP.Chitosan-232济宁医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 J Jining Med Univ,August 2023,Vol.46,No.4Modified calcium alginate microspheres for cefotaxime immobilizationJ.Russ J Appl Chem,2022,95(3):401-407.DOI:10.1134/S1070427222030090.2Zhang X,Wang X,Fan W,et al.Fabrication,property and application of calcium alginate fiber:A reviewJ.Polymers,2022,14:3227.DOI:10.3390/polym14153227.3Oerther S,Gall HL,Payan E,et al.Hyaluronate-alginate gel as a novel biomaterial:mechanical properties and formation mechanismJ.Biotechnol Bioeng,1999,63(2):206-215.DOI:10.1002/(SICI)1097-0290(19990420)63:23.0.CO;2-8.4袁枝花,刘有停,曲召辉,等.基于透明质酸超分子特性对中药小分子化合物功能改进的研究进展J.药学学报,2022,57(5):1245-1251.DOI:10.16438/j.0513-4870.2021-1222.5Vasi AM,Popa MI,Butnaru M,et al.Chemical function-alization of hyaluronic acid for drug delivery applica-tionsJ.Mat Sci Eng C,2014,38:177-185.DOI:10.1016/j.msec.2014.01.052.6Tan J,Meng N,Fan Y,et al.Hydroxypropyl-cyclodex-trin-graphene oxide conjugates:Carriers for anti-cancer drugsJ.Mat Sci Eng C,2016,61:681-687.DOI:10.1016/j.msec.2015.12.098.7Shuai F,Zhang Y,Yin Y,et al.Fabrication of an inject-able iron(III)crosslinked alginate-hyaluronic acid hydrogel with shear-thinning and antimicrobial activitiesJ.Carbohyd Polym,2021,260:117777.DOI:10.1016/j.carbpol.2021.117777.8Farrs IF,Norton IT.Formation kinetics and rheology of alginate fluid gels produced by in-situ calcium releaseJ.Food Hydrocolloid,2014,40:76-84.DOI:10.1016/j.foodhyd.2014.02.005.9Mohan R,Mohan N,Vaikkath D.Hyaluronic acid dic-tates chondrocyte morphology and migration in composite gelsJ.Tissue Eng Part A,2018,24(19-20):1481-1491.DOI:10.1089/ten.TEA.2017.0411.10 Zhou Z,Yang Z,Huang T,et al.Effect of chemical cross-linking on properties of gelatin/hyaluronic acid composite hydrogelsJ.Polym-Plast Technol,2013,52:45-50.DOI:10.1080/03602559.2012.718400.11 Winter WT,Arnott S.Hyaluronic acid:the role of diva-lent cations in conformation and packing J.J Mol Biol,1977,117(3):761-784.DOI:10.1016/0022-2836(77)90068-7.12 Yang Y,Campanella OH,Hamaker BR,et al.Rheologi-cal investigation of alginate chain interactions induced by concentrating calcium cationsJ.Food Hydrocol-loid,2013,30:26-32.DOI:10.1016/j.foodhyd.2012.04.006.13 Jeong SH,Koh YH,Kim SW,et al.Strong and biostable hyaluronic acid-calcium phosphate nanocomposite hy-drogel via in situ precipitation processJ.Biomacro-molecules,2016,17(3):841-851.DOI:10.1021/acs.biomac.5b01557.(收稿日期 2022-12-30)(本文编辑:石俊强)本刊对来稿中表、图的要求来稿中的表、图均须置于正文中,切勿单独放于文后。每幅图、表应有言简意赅的题目。统计表格一律采用“三线表”格式,不用纵线、斜线。要合理安排纵表的横标目,并将数据的含义表达清楚;若有合计或统计学处理行(如 F 值、P 值等),则在该行上面加一条分界横线;表内数据要求同一指标保留的小数位数相同。图片应清晰,不宜过大。图的宽高为 7cm5cm,最大宽度半栏图不超过 7.5cm,通栏图不超过17.0cm,高与宽的比例应掌握在 5 7 左右。(本刊编辑部)332