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组 织 培 养基本技术与基本知识2005.10.15目 录前言-5 第一章 基本技术-6第一节 原代细胞单层静止培养的设备与器材准备-6 一、 设备与器材二 、 器材的清洗第二节 原代细胞单层旋转瓶培养的设备与器材准备-11一 、 设备与器材二 、 器材的清洗第三节 组织培养用水的制备和各种溶液的配制-12 一、 水（双蒸水、三蒸水或去离子水）二、 汉克氏（Hanks）原液和汉克氏液三、 0.5%水解乳蛋白-汉克氏液（简称乳汉液）的配制四、 7.5%的碳酸氢钠（NaHCO3）配制五、 胰蛋白酶的配制六、 犊牛血清的制备七、 每毫升含1万单位双抗（青霉素与链霉素）的配制八、 每毫升5万单位制霉菌素的配制九、 营养液与维液的配制第四节 器物与溶液的包装、灭菌和无菌操作-16一、 包装与灭菌二、 无菌操作第五节 无菌检验-23第六节 原代单层细胞的制备-24第七节 细胞计数和染色-26一、 细胞计数二、 细胞染色第八节 培养细胞的观察-27一、 培养细胞的生长和繁殖二、 在单层细胞培养中细胞的形态观察第九节 原代单层细胞培养中应注意的问题-29一、 应注意的问题二、 可能会出现的问题第二章 在组织培养的细胞中病毒的接种与毒价的滴定（测定）-31第一节 在组织培养的细胞上病毒的接种方法-32一、用敏感细胞分离病毒二、病毒在敏感细胞中的传代三、 接种后细胞病变（CPE）的观察与判定标准第二节 在组织培养细胞中病毒毒价的测定-34一、 病毒毒价测定操作方法二、 半数细胞病变终点（TCID50）计算第三章 基本知识-41第一节 影响离体细胞生长繁殖的一些因素-41一、温度二、氢离子浓度三、 水四、 渗透压与无机盐类A、细胞所需无机盐离子的作用B、无机盐类对平衡渗透压和维持pH的作用五、 气体六、 细胞接种浓度七、 容器转动速度第二节 细胞的营养物质-49一、 碳水化合物二、 氨基酸和水解乳白蛋白三、 血清（一）、血清的作用（二）、与血清有关的几个问题四、 维生素第三节 消化液的应用-56一、 胰蛋白酶二、 乙烯二胺四乙酸（Versene，EDTA）三、 胶原酶四、 Pronase第四节 抗菌素的应用-61一、 青霉素二、 链霉素第五节 传代细胞与细胞悬浮培养-62一、 传代细胞二、 细胞悬浮培养第四章 附录-65附录 猪瘟兔化弱毒细胞冻干疫苗（旋转瓶培养）制造及检验办法-65附录 禽苗的鸡胚细胞苗试制-67附录 应用驴胎肺等二倍体细胞生产马传染性贫血病琼脂扩散反应抗原操作方法-68前言为了适应我国畜牧业的发展，防止各种畜、禽流行病的爆发和流行，需要生产大量的家畜家禽的各种疫苗，而目前不少疫苗的生产尚未探取组织培养的方法，存在着成本高，费人力，劳动强度大，有些疫苗的原料比较难于得到或需要耗费较多的家畜或家禽，例如狂犬疫苗的生产，目前还是采用绵羊的脑子来制造，一只羊只有脑子能利用。因此，国内有不少兽医生物制品厂和研究单位已探取组织培养的方法生产各种疫苗。例如：猪瘟疫苗的生产，原采用乳兔和黄牛进行生产，而现在已推广仔猪肾细胞组织培养方法生产，一对仔猪肾所生产的苗就相当于以前5001000只乳兔或3040头黄牛所生产的量，这不仅使成本成倍的下降，原料易得，节省了人力，而且使劳动强度大大减轻。除此之外，口蹄疫甲型和乙型的组培灭能苗和甲型组培弱毒苗已进行试生产，猪水泡病的组培弱毒苗与组培反映苗也正在进行试制。鸡马力克氏病和新城疫系和系组培苗许多单位在进行试验，并已取得可喜成果。另外如鸭瘟、羊痘等组培苗的生产也在进行试验，并已看到初步苗头。以上的简略介绍仅涉及到组织培养技术在动物疫苗生产方面的应用，而这一技术在免疫学和病毒学中还有着许多方面的应用，如病毒性疾病的诊断；马传染性贫血病的诊断抗原补体结合反应抗原和琼脂扩散反应抗原，在国内乃是行之有效而广泛采用的方法。利用组织培养：细胞作中和试验以诊断一些病毒性也是经常采用的。另外组织培养技术在病毒的分离、监定和繁殖规律：研究以及病毒毒价的测定等方面都是不可缺少的手段。尤其当用于医学时，组织培养方法能够克服在人医中不能用人进行实验的困难。组织培养技术除了在病毒学和免疫学和医学中有多方面应用外，其应用范围还极其广泛。如细胞学、肿瘤学、药理学等方面以成为不可缺少的工具，而且在遗传学、发生学、生物化学、生理学、放射生物学等方面也有广泛的应用价值。然而，事物总是一分为二的。组织培养使组织或细胞在体外生长繁殖以便于进行多方面研究和应用。但是，机体内外环境却是极为不同的。在体外，则使组织或细胞处于不正常的条件下，必然会引起许多变异。因此，当我们要把体外的实验结果应用于机体内时，尤其在人医方面，必须加以慎重考虑和修正才有其实用价值。不过对我们兽医方面用组织培养方法来制造疫苗则问题不大。组织培养既然有如此广泛和重要的应用，那么究竟什么是组织培养呢？组织培养就是将各种各样的生物（包括人、动物和植物）的器官组织或细胞从机体中取出，人工培养于各种各样的玻璃或其它器皿内，使组织或细胞在体外得以生存、生长和繁殖。人们可以利用这种体外生长的组织或细胞进行各种科学研究或从事病毒疫苗的生产。组织培养技术一般来讲，可以分为三个不同水平：即器官水平（器官培养）、组织水平（组织块培养）和细胞水平（细胞培养）,通常所说的“组织培养”是包括了组织培养与细胞培养二者的通称，因为二者有时不好绝然分开。所谓组织培养也是由组织中长出细胞来，培养的仍是细胞。我们所要讲的也是应用最广泛的细胞培养。而“器官培养”则是用某些措施使器官的原基，器官或器官的一部分在体外存活、生长、分化，并且保持其原有的结构和功能。组织培养的具体方法是很多的，但归纳起来不外为悬滴培养，器官或组织块培养、细胞的单层培养和悬浮培养 几种。在单层培养中又有静止培养和旋转瓶培养。组织培养的历史开始于上世纪中。各参考书中都有详细介绍，阅读时应注意历史唯心主义和英雄史观的影响。组织培养技术与其它科学一样，是随着生产实践的发展，龙其是医学、病毒学和免疫学实践的需要以及其它科学的发展而经历着产生和发展的各个阶段。目前，组织培养技术已有极大的发展，已成为现代科学实践中一项不可缺少的手段。这一技术近年来在我国的兽医界中已有了较普遍的使用。第一章 基本技术本章所要介绍的基本技术仅指目前国内一些兽医生产和研究单位所普遍采用的细胞单层培养。包括单层静止培养和旋转瓶培养也包括原代细胞培养和传代细胞培养。 第一节 原代细胞单层静止培养的设备与器材准备一、 设备与器材（一） 无菌间（或无菌罩或超净工作台） 1间（或1台）（二） 较大型设备：电热恒温培养箱 1个冰箱（包括普通冰箱和低温冰箱） 各1台高压蒸汽消毒器 1台电热鼓风干燥箱 1台恒温水浴（双孔或四孔） 1台离心机（台式或座地式均可30005000转/分） 1台真空泵 1台普通天平（感量0.1克） 1架离子交换纯水器或蒸馏器 1套显微镜（普通生物显微镜） 1台（三） 解剖器械：镊子手术镊 尖头 1把钝头 1把眼科镊 直头 1把 弯头 1把剪刀手术剪 2把 眼科剪 直头 1把 弯头 2把解剖刀手术刀 2把（四） 玻璃器皿：培养瓶（中性、无色透明硬质玻璃、耐高压）视培养需要而取不同容量的各种瓶，如：克氏瓶 500或1000毫升或其它容量方瓶 20、25、50或100毫升盐水瓶 500毫升链霉素瓶 10毫升培养皿 2套漏斗 1个（大小视过滤物的量而定）烧杯 （50或100毫升）1个细颈三角瓶（50、100毫升或更大，视取材大小而定）1个玻璃杯 若干吸管 （1毫升、10毫升）各1支注射器（20毫升） 1个500毫升或更大的盐水瓶（或三角瓶盛各种培养液用） 若干（五） 橡皮制品橡皮塞（号数视各种培养瓶而定，但应选白色的）各若干橡皮球（大、小）各三个乳胶管（内径约34毫米）1米（六） 其它血球记数器 1个血球记数板 1块脱脂纱布（1313厘米2左右，2层厚）1块棉花、纱布、纸（旧报纸、牛皮纸或硫酸纸）小线绳或纸绳 各若干铝饭盒、菜盒或其它容器（装较小的培养瓶、橡皮塞等用） 若干个架或盘（木制或金属制均可。放培养瓶用） 若干G6号耐酸玻璃滤器或赛氏滤器（容量为200500毫升） 2个滤板（K级和EK级或EKS级） 若干注射针头（长约7厘米的粗针头） 2支二、 器材的清洗在组织培养工作中器材的清洗是一项十分重要和起关键作用的工作，它影响到细胞是否能够培养成功。由于清洗的程序比较麻烦，所用器材又多，因此，本项工作在组织培养中是最费时间和精力的，所以需要耐心和细致。（一） 玻璃器皿的清洗培养细胞用的玻璃瓶应采用中性硬质玻璃。如为碱性或酸性玻璃在经常处理过程中，如高压时可能会出现局部脱碱或脱酸作用，致使瓶壁有些离子渗入培养液中，可能影响培养液的酸碱度或产生一些对细胞有毒性的物质。而某些软玻璃中含有铅和砷，这些物质对细胞具有很大的毒性，特别是当培养物呈微碱性的条件下它们也会渗入到溶液中去而引起细胞中毒。培养细胞用的玻璃瓶除采用中性硬质玻璃外，清洗的好坏对细胞培养成功与否是非常关键。因为细胞在体外培养是十分娇嫩的，在瓶中进行培养的时侯，许多物质对它都有毒害作用。如自来水中的铅离子，1/100万痕量的肥皂残余，洗液中的铬离子等等。如瓶中带有油质，也使细胞不能贴壁（细胞一般需要附着一个固体物上才能生长，这个过程就叫贴壁）。因此，在清洗玻璃器皿时，尤其是细胞直接接触的培养瓶必须十分注意这一问题。清洗玻璃器皿的方法很多，这里仅介绍硫酸重铬酸钾溶液（简称洗液）,因为它的氧化能力和腐蚀作用极强，但对玻璃的腐蚀作用小，故为一般实验室所常采用。洗液对衣服皮肉的腐蚀能力亦极强，故在配制与使用时必须严防溅到身上，最好预先带上耐强酸碱手套和雨靴，穿上橡皮或塑料围裙作为防护。如不小心溅到身上则应立即用自来水冲洗。洗液的配方也是多种多样的，以下介绍四种：1、 强液：在工业用浓硫酸中加入5%（重量/体积）的重铬酸钾，边加重铬酸钾边搅拌。2、 中强液：重铬酸钾40克加少量水溶解，然后缓慢加入浓硫酸至1000毫升，颜色为黄棕褐色。3、 弱液：重铬酸钾100克，蒸馏水1000毫升，加温溶化冷后缓慢加入浓硫酸100毫升。颜色为棕红色。应注意不要把水往硫酸中加，而是将浓硫酸加入水中。以上三种配方的洗液具氧化腐蚀能力以第一种最强，依次减弱，使用时应有不同，第一种和第二种洗液使用时，只需将培养物溶液倒干，不一定非把培养物洗净即可放入，而第三种洗液在使用时，玻璃器皿必须预先用热肥皂水洗净，经自来水冲洗干净、沥干，然后才能浸入，否则该洗液很快失效。近来有人用优选法测试不同配方洗液的洗净效果，得出效果最好的配方为：浓硫酸50%+水50%+重铬酸钾5%先将50%的浓硫酸缓缓加入50%量的水中，然后将5%量的重铬酸钾加入，搅拌使之溶解，溶解时可加温。为了延长洗液的使用时间，玻璃器皿最好在放入洗液前刷洗干净，稍沥干然后再放入洗液中。强洗液一旦变绿，则表示重铬酸钾已经还原，丧失了氧化能力，不宜再用，此时可将丧失氧化能力的洗液加热，然后再加入适量的重铬酸钾，重铬酸钾溶解后，洗液又恢复为原来的颜色，即可重新使用。洗液缸平时必须加盖盖好，以免危险！清洗玻璃器皿的方法也是很多的，有的还十分繁琐，一般组织培养可采取如下流程：新玻璃器皿应先用自来水或热肥皂水刷洗干净，将水沥干，放入上述洗液中，放过夜，至少浸泡四小时以上，取出用自来水冲洗8-10次，蒸馏水刷洗3次，最后用去离子水（或双蒸馏水）刷洗2-3次，将水倒去，放在80烤箱中烤干，然后包装灭菌。在用自来水冲洗过程中不宜让水干燥，否则会留下水痕，不宜洗净。新的玻璃器皿因为是在高温条件下吹制，表面易析出碱性物质，因此在使用前除了按上述过程处理，新的较小的培养瓶在用去离子水处理后，可装满去离子水置高压锅内进行热压处理，15磅30分钟，然后再用去离子水涮洗2次，这样可进一步除去重金属离子。然而新的培养瓶第一次使用时效果总是不太好，一瓶在培养一、二次细胞后就会好用了。对已培养过细胞的培养瓶可倾去培养液，如为强洗液则可直接浸泡，如为弱洗液则应用刷子刷洗，沥干后浸泡入洗液。非培养细胞用的其它玻璃器皿在用过后可用自来水冲洗2-3遍，蒸馏水冲洗3遍，去离子水刷洗2-3次，80烤干，包装灭菌即可。对接触过病毒或发生过微生物污染的玻璃器皿，清洗前应拔下塞子，将瓶塞、瓶内液体连带瓶子用蒸馏水煮沸消毒灭菌或先高压（15磅30分钟）灭菌，然后按上述方法洗涤。也可将瓶塞和瓶内液体倾倒于一锅内进行煮沸消毒灭菌而将瓶直接浸入强洗液或中强洗液中，也可浸泡在5%的氢氧化钠液中。以后的清洗亦如上法。吸管由于管口太细，不宜冲洗，可用真空泵负压吸水冲洗或用虹吸式吸管冲洗器冲洗，如图。自来水冲洗毕，可用真空泵负压吸蒸馏水然后去离子水冲洗，之后放80烤干、包装、灭菌。如所用玻璃器皿上有蜡、松香、胶等物质，尤其是在利用废旧疫苗瓶时，清洗前先别打开盖子，先泡在3-5%磷酸钠（或对磷三钠）中，磷酸钠可使腊等物质与瓶壁脱开，或采用将旧的疫苗瓶或其它包有腊等物质的瓶子，同样不开盖放水中煮开，漂洗去腊等物质，一次不行可煮沸二次，用水漂洗干净，然后打开盖按一般新瓶的处理方法进行处理。G6耐酸细菌滤器按所附说明书清洗，一般用温盐酸或温硫酸也可用上述洗液抽滤和浸泡过夜，然后用自来水、蒸馏水和去离子水充分抽滤洗涤。置80烤干，应注意不要一下就放到80或更高温度中，这样易损坏滤器。培养用的玻璃片，因为体积小而脆，应分别处理。将切割好的盖片逐片地浸泡于硝酸或上述洗液中，过夜后取出，用自来水充分冲洗，经蒸馏水，双蒸水涮洗后浸泡于分析纯的纯酒中，用前取出逐片用干净的绸布擦干，放于培养皿中烤干然后装瓶中包装灭菌。（二）橡皮制品的清洗 主要是橡皮塞，橡皮塞含有对细胞有毒性的物质，尤其是红色与黑色的橡皮塞毒性更大，不宜采用，一般组培最好采用白色的橡皮塞，培养时尽量不要使培养液与橡皮塞接触。1、新的橡皮塞，先经自来水洗刷干净，然后在2%的氢氧化钠（NaOH）溶液中煮沸20分钟，用自来水冲洗5-6次；再用1.3%的盐酸（HCL）溶液煮沸30分钟，仍用自来水冲洗5-6次，用蒸馏水洗3次。最后用去离子水洗2-3遍，在50-80的烤箱中烤干、包装、灭菌。或用5%的碳酸钠（Na2CO3）溶液代替NaOH和HCL，煮沸30分钟，其佘过程相同。2、使用过的橡皮塞，先在蒸馏水中煮沸30分钟，自来水冲洗干净，然后用蒸馏水、无离子水各冲洗2-3遍，50-80烤干、包装、灭菌。其它橡皮用具，凡与细胞可能有接触者，可采用相同的办法处理。（三） 解剖器械及其它金属用品的清洗 1、新的解剖器械如有油质则应先擦掉，然后用肥皂水加以煮沸去掉油质，用自来水冲洗干净，如系使用过之器械，则可用自来水冲洗干净，之后立即擦干，以免生锈，或用酒精擦拭干净，然后放温箱中使之干燥。解剖器械在使用时应避免在火焰上消毒，以免损坏器械。2、注射针头用自来水冲洗后用蒸馏水，无离子水冲洗2-3遍，放80烤干，包装，灭菌。（四）过滤用纱布块，新的医用脱脂纱布可直接剪成1313cm2大小的块（视消化细胞量大小而定），包装、灭菌。第二节 原代细胞单层旋转瓶培养的设备与器材准备应用于旋转瓶培养的设备与器材的准备基本与静止培养一致，现将旋转瓶不同于静止培养所需设备与器材介绍如下：一、 设备与器材（一）、较大型设备：电热恒温培养室 1间电动转瓶机 1台转瓶显微镜观察台 1台（二）、解剖器械： 理发剪（代替剪刀） 1把（三）、玻璃器皿： 培养瓶容量为500、1000、3000、5000、10000、15000、20000毫升园形瓶（如500、1000毫升容量盐水瓶，3000毫升容量的盐酸瓶均可。） 玻璃管：管壁较厚，直径6-7毫米（用于管道化）若干。（四）、橡皮制品： 橡皮塞，适于培养瓶瓶口大小，若干医用优质橡皮管（白色），直径约5毫米左右（管道化用）若干。 双联球 1-2个 （五）、其它： 酒精或汽油喷灯 1个二、 器材的清洗：与单层静止培养基本相同，仅转瓶与偏瓶或方瓶略有不同。旋转培养若要清洗容量较小的瓶（如500与1000毫升盐水瓶）可与方瓶等一样于洗液缸中浸泡，容量较大瓶可按瓶容量的1.5%量装洗液，然后盖上包有塑料质膜的橡皮塞置转瓶机上旋转浸泡1天，然后取下可按一般培养瓶清洗程序清洗、烤干、包扎瓶口和灭菌。 第三节 组织培养用水的制备和各种溶液的配制配制及保存溶液应注意以下事项：1、配制溶液之原材料药品等都必须经过试用。药品一般采用化学纯的，标签要清楚以防混淆。2、配制溶液时所用器具，如烧杯、容量瓶、量筒、漏斗等都应洗涮干净，最后用蒸馏水或去离子水涮净、烤干备用。3、称量药品力求精确：其误差应在0.1%之下，称量过程防止混淆。4、配制平衡盐溶液（如汉克氏原液）的过程要严格按照配制方法顺序配制，主要是防止磷酸钙和碳酸钙的沉淀，当时就应处理完毕，如发生疑问的则不要使用，重新进行配制。5、配制溶液用的水（双蒸水、三蒸水或去离子水）最好使用新鲜的制备时间长的水多会有变化，不宜使用。6、配制溶液的过程，尤其是大量配制的溶液应做好记录，如批次、材料、份量、消毒、保存、使用情况、配制人等。7、必须注意配制溶液的药品标签所注明的含结晶水的数量是否与配方相同，如不同则应经过计算，得到应加入的量。8、每批溶液配成后均需经过试用方可大量使用。9、配好的溶液应立即除菌处理，如高压灭菌、过滤或加抑菌物质，以防杂菌生长。10、溶液保存过程预防杂菌和溶液变质失去效用，故一般保存在较低的温度中，如4冰箱（及低温冰箱），瓶栓应紧闭。11、保存其间的溶液如发现细菌污染，或有问题时，则不应使用。一、 水（双蒸水、三蒸水或去离子水）水是组织培养配制各种液体的溶液，也是所用各种玻璃器皿的清洗，尤其是供细胞生长的培养瓶的清洗干净与否的最后一关。因为水的质量好坏将直接影响到组织培养的成败，对组织培养来说，水的质量事关重大，必须充分加以重视，否则会使“前功尽弃”。一般组培用水至少是双蒸水或三蒸水，更方便的是使用去离子水（即无离子水）。双蒸水或三蒸水可使用普通金属蒸馏器之蒸馏水，再经玻璃蒸馏器蒸镏一次。去离子水也最好适用普通蒸馏水经离子交换纯水器来制备，取其比电阻值为50万欧姆以上，pH5.5-7之间才符合使用要求。二、 汉克氏（Hanks）原液（即10倍浓缩）和汉克氏（Hanks）液。1、汉克氏原液配制：一般书中所说汉克氏原液的配制均分甲液和乙液，用时再等量混合。我们现采用一次配成的方法，使用时只需加以稀释即可。氯化钠（NaCL） 80.0克磷酸氢二钠(Na2HPO42H2O)0.6克(如果12个结晶水的,则需1.2克)氯化钾(KCL) 4克磷酸二氢钠 0.6克硫酸镁(MgSO47H2O) 2克葡萄糖 10克（如含1个结晶水，则需11克）无水氯化钙（CaCL2） 1.4克(如含2个结晶水,则需1.9克)H2O(双蒸水或去离子水)加到1000毫升。氯仿（三氯甲烷）2毫升（或加双抗10万单位）在配制汉克氏原液时，应将CaCL2先用一小烧杯盛放后，加入约50毫升水（双蒸水或去离子水），置4冰箱中溶解，然后用另一较大的容器（2000毫升烧杯或1000毫升容量瓶）按配方顺序逐一用双蒸水或去离子水溶解，必须严格注意的是只有前一药品完全溶解之后，才能加入下一种药品，否则会产生沉淀（如磷酸氢钙，磷酸氢镁），致使汉克氏这一平衡盐溶液变为不平衡，则细胞失去合适的生长环境，细胞就会被破坏。由上至下到葡萄糖逐一溶解完毕之后，才可将已溶解的CaCL2倒入混匀，最后加双蒸水或去离子水至1000毫升，用滤纸或两层纱布包两层脱脂棉过滤（以后者为好）之后，加入氯仿2毫升或双抗10万单位，充分振荡混匀，盖上瓶栓，包扎瓶口，写明标签，放4冰箱保存。如此配得的是10倍浓缩的汉克氏液。2、汉克氏（Hanks）液的配制将汉克氏原液进行10倍稀释即成。取汉克氏原液 100毫升双蒸水或去离子水 896毫升0.5%酚红液(见后面) 4毫升或采取如下配制方法:汉克氏原液 100毫升去离子水 900毫升酚红 0.02克(即20毫克)先用7.5%碳酸氢钠(NaHCO3)4滴左右溶解20毫克酚红结晶粉末,溶解后加入1000毫升汉克氏液中.此法较采用0.5%酚红指示剂方便。高压8磅(112)30分钟,或10磅(114-115)10-20分钟灭菌，置室温或37培养箱中保存三昼夜以检查有无杂菌生长。3、0.5%酚红指示剂配制：称取酚红结晶粉末0.5克0.4%（0.1N）氢氧化钠（NaOH）15毫升双蒸水或去离子水85毫升将0.5克酚红放入乳钵中加少量0.4%的NaOH研磨，待溶解后，将所余的0.4%NaOH倒入，使之彻底溶解，然后加入85毫升双蒸水，用过滤纸过滤。三、0.5%水解乳蛋白汉克氏液（简称乳汉液）的配制：称取 水解乳蛋白 5克 汉克氏液 1000毫升水解乳蛋白溶解后，分装500毫升瓶（瓶的大小看每次的常用量），高压8磅30分钟或10磅10-20分钟灭菌。大批生产时亦可采用0.1-0.3%的乳汉液。四、7.5%的碳酸氢钠（NaHCO3）配制：称取NaHCO3 7.5克双蒸水加至100毫升G6耐酸玻璃滤器过滤，也可用8磅30分钟高压灭菌，需盖橡皮塞,为防高压的塞子蹦掉，橡皮塞子最好用翻口塞并用线绳扎紧。否则NaHCO3会分解成NaoH与CO2，CO2跑掉，使弱碱变成强碱。除菌后，无菌分装小瓶,分装最后应做无菌检验保存于4冰箱。五、 胰蛋白酶溶液的配制胰蛋白酶或胰酶均可用于消化组织使分散成细胞。国内目前有新疆、上海和北京进行生产，通常也使用国外进口的，如Difco（1：250）的和日本的。经使用，新疆生物化学研究所生产的胰蛋白酶效果较好。配制胰蛋白酶时应注意各种牌号不同活性的胰蛋白酶需根据其活性配成最适浓度。所谓“活性”是指每克胰蛋白酶能消化若干克酪蛋白，此酪蛋白数就是该胰蛋白酶所含的单位，即称为“活性”。如一克胰蛋白酶可消化250克酪蛋白，则该胰蛋白酶的活性为1：250。配制方法如下：1、活性为1：500的胰酶配制0.125%溶液：称取1：500的胰酶 0.25克汉克氏液 200毫升“”胰蛋白酶（Trypsin）与胰酶（Pancreafin）不同，胰酶是由胰脏中提取的初制品，除含有胰蛋白酶外，尚含有胰淀粉胰（Amylopsin）和胰脂酶（Sfeapsin）等，但在日常工作中为方便起见常将胰蛋白酶简称为“胰酶”。应避免引起误解。先用少量Hanks液调化胰酶。然后将剩余的汉克氏液加入，置37恒温水浴溶解1小时（时间视溶化程度而定需透彻清亮）。溶解后用塞氏滤器过滤除菌，最后用7.5%Hanks将pH调至7.6-7.8。分装小瓶（或细口三角瓶）分装最后需作菌检，置4冰箱或低温冰箱保存。配制的胰酶如欲保存数月，则可配成10倍浓缩液，保存于低温下，临使用再用汉克氏液稀释和调pH至7.67.8。2. 活性为1：250的胰酶配制成0.25%的溶液：称取 1：250的胰酶0.25克 汉克氏液 100毫升配制方法完全同上。此种胰酶配成0.150.2%浓度亦可使用。六. 犊牛血清的制备选择健康犊牛或乳牛场淘汰的刚出生的犊公牛（一般为初生至六月龄），采血前12小时不予饲喂，仅予喝水。采血时采用颈动脉放血，所用的动脉插管（或采血针头）、乳胶管、玻璃管以及盛血器皿均应洗净灭菌，采血过程尽量做到无菌操作。采血时，采血瓶中再无菌条件下放入适量（如50100毫升）生理盐水或小牛血清以湿润瓶壁，这样有利于凝血，也有利于血凝块与瓶壁的分离。每个采血瓶内盛血不宜超过瓶的总容量的1/3，装多了则出血清量少。盛血后采血瓶应置室温（天热时），如天冷应置温箱或温室中，静置4小时左右（时间长些亦可），待血液凝固后放入4冰箱（或冷库）过夜（达24小时亦可）。然后在无菌间，小心（不要摇晃）倒出（或用虹吸法吸出）上层血清，如混有血球，则可将这部分血清以20005000转/分离心1015分钟，收集上层血清（如略有溶血的血清照样可用）但需注意无菌操作。然后置56水浴中灭活30分钟，以破坏补体和某些污染的病毒（当然也可不灭活）。灭活后可进行分装，分装最后需作菌检。如菌检有菌污染，则用塞氏滤器过滤。各瓶血清除近期要用的可置4保存外，其余放低温冰箱保存。最好采用3-5头犊牛血清，先分别灭活，菌检后再混合分装保存。采血时还需注意动脉插管口不宜太细，放血速度也不宜过快，以防溶血。一般一头犊牛可放血1500-2500毫升左右，可分离出约一半的血清。七、每毫升含一万单位双抗（青霉素与链霉素）的配制：硫酸链霉素和青霉素G钾盐溶解于100毫升0.9%生理盐水（或汉克氏液）中。然后用除菌滤器过滤,分装小瓶，保存在低温（-20）冰箱中。双抗不宜在融化后再进行冻结，最好一次用完，因双抗在溶液状态不稳定尤其是青霉素。八、每毫升5万单位制霉菌素的配制：制霉菌素 1克（约500万单位）盐酸 2毫升纯酒精 98毫升加入制霉菌素之后，应置普通冰箱（4）24-48小时，并摇动3-6次，以3000转/分，离心30分钟，取其上清，以每瓶2毫升进行分装，保存于低温冰箱供用。使用剂量，按每毫升营养液加25单位制霉菌素（即营养液1000毫升加上述制霉菌素液0.5毫升）。九、营养液与维持液的配制：1、营养液：0.5%乳汉液（或0.10.3%）90毫升犊牛血清（所占营养液的比例随各种培养细胞的要求不同而变）10毫升双抗（1万单位/毫升）1毫升（最终为100单位/毫升营养液）用 7.5%NaHCO3 调pH至 7.0左右（一般 6.87.0合适）2、维持液：0.5%（或0.10.3%）乳汉液 95毫升犊牛血清（比例亦随不同细胞而异） 5毫升双抗（1万单位/毫升） 1毫升用 7.5%NaHCO3 调pH至 7.37.6（视培养的细胞类型和病毒而异）。 第四节 器物与溶液的包装、灭菌和无菌操作组织培养所用的营养液体不仅对动物细胞生长繁殖是营养物，而且对细菌和霉菌以及其它微生物也是很好的营养物。微生物比细胞生长繁殖得更迅速，他们的代谢产物对细胞往往有毒害作用，致使细胞死亡，使培养遭失败。因此组织培养技术的很重要一点就在于防止污染，尤其是对传代细胞，往往使几个月甚至更长时间的工作全部报废。防止污染主要有二大方面，一是灭菌，二是无菌操作。以下从这二方面分别加以介绍。一、 包装与灭菌器物在灭菌前必须进行适当的包装，以便灭菌后便于存放。（一）、器物的包装凡瓶子（包括培养瓶与三角瓶等）原则上应用棉纱塞（单层纱布包裹棉花）塞住，不应过松或过紧，然后用一层牛皮纸（或废报纸）将瓶口包扎，如小的培养瓶也可放在饭盒（或其它容器）内，可不用纸包扎，棉纱塞可反复使用。玻瓶有棉纱塞保护在灭菌后当冷空气进入时就不会发生再被空气污染的问题。如果不用棉纱塞塞瓶口，也可采用一层硫酸纸（或废报纸）和一层牛皮纸包扎，这样也是安全的。各种吸管或滴管在包装前用棉花将上口堵上，以防止不慎将液体吸入橡皮头内而造成污染。然后按种类分装于大的玻管（或其它金属筒中），玻管口用棉纱塞和牛皮纸（或废报纸）包扎。各种试管直接放入饭盒内，盖纱布或牛皮纸然后将盖盖上。离心管盖以棉纱塞，放入饭盒内或不放饭盒内管口包扎二层纸。培养器用二层纸包装。橡皮塞， 按型号置于菜盒、平皿或其它容器中，容器外再用纸包扎。解剖器械可分别用纸包扎，也可置消毒盒内。过滤细胞用纱布块分别双层纸包扎。注射器与针头可直接放饭盒中，上盖牛皮纸，或分别用纸包扎。G6耐酸细菌滤器通常与抽滤瓶联接在一起用牛皮纸包裹，滤器口与抽滤瓶口也应用单层纸包扎。汉克氏液与乳汉液以及其它液体类可用棉纱塞加纸包扎。总之，一切物品都需进行适当的包扎，以备灭菌后能保证不再受外界的污染。灭菌后长期不用的物品分别存放，以免混淆。（二）、器物的灭菌灭菌的方法也有多种，如干热、高压（热压）、流通蒸气煮沸和滤器抽滤等等。此处仅介绍最常用的方法。1、干热灭菌：用电热鼓风干燥箱加温到160保温1小时，140保温 2小时或130保温 4小时。此法比较简便，而且灭菌后的物品干燥易保存。缺点是干热的传导较慢，需时较长。灭菌维持时间到后，要待干燥箱逐渐冷却后再开箱门取物