细胞工程实验总结.doc

实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备
1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？
1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。（准备试剂瓶）灭菌方法： 高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌
（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）
认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。 2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。 3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。 4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。 5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。 7）立刻不锈钢过滤器过滤除菌，贴上标签，4℃保存备用。
灭菌方法： 高压灭菌。
3）胰蛋白酶-EDTA消化液
①胰蛋白酶溶液配制：称取胰蛋白酶（1:250）粉末0.25g置烧杯中，溶于100mL PBS，搅拌混匀，置室温4 小时并不断搅拌振荡，过滤除菌。（若配制400 mL则应称取1g胰蛋白酶）
灭菌方法：过滤除菌。
②EDTA 溶液配制：0.2g EDTA用400mL PBS溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶， 4℃冰箱保存。
灭菌方法：高压蒸汽灭菌。
胰蛋白酶与EDTA 按1：1混合后分装，4℃冰箱保存。
4）抗生素液
双抗（青霉素、链霉素）各1克，溶于100mL纯水，过滤除菌，分装，4℃冰箱保存。使用前1：100稀释。
灭菌方法：过滤除菌。
3、简单介绍动物细胞培养实验室常用仪器的操作方法及注意事项。
操作方法：
2清洗1）新玻璃器皿的清洗2）使用过的玻璃器皿的清洗3）胶塞的处理
3 消毒1）物理消毒法 (2)干热灭菌 (4) 过滤除菌 （5）煮沸消毒 急2）化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
(1) 70％(或75％)酒精 (2) 0.1％新洁尔灭(3) 来苏儿水(煤酚皂溶液) (4) 0.5%过氧乙酸(5) 乳酸蒸气 (6) 37%甲醛加高锰酸钾 (7)甲醛消毒方法
注意事项
1、清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10-15次。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。枪头和试管一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
2、干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
3、高压灭菌后器皿务必晾干或烘干。
4、牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂均不能高压。需要长期保存的血清必须储存于-20℃—-80℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。血清在冻入低温冰箱前，不要装得太满，必须预留一定体积空间，（其他溶液冻存也是如此）。一般厂商提供的血清无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤。血清解冻需采用逐步解冻法，切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀，使温度与成分均一，待全部溶解后再分装。
5、滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜，包好，经高压灭菌后才能使用。过滤前可用压进空气的办法测试过滤器是否完好，去除压力后针筒会反弹即为完好无损。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6、使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
7、培养基过滤器过滤除菌注意事项：
(1) 细胞培养用水一般为三蒸水或超纯水，医药生产上一般为注射用水。 (2) 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用。
(3) 溶解干粉培养基时先加入终体积90%－95%的培养用水，添加剂加完后再定容。
(4) 如需添加的组分较多时，某一组分完全溶解后，再添加另一组分。
(5) 待培养基完全溶解后再加入碳酸氢钠。
(6) 所有成分完全溶解后，培养基应立即过滤或高压除菌。
(7)在过滤前，可将pH调至比所需值低0.1-0.2个单位。
(8) 在细胞培养过程中，建议不加或加少量的抗生素，如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。
(9) 建议用1N HCl或1N NaOH来调节培养基的pH。
8、物品放进饭盒后要贴好标签，还需要用棉布或牛皮纸包好再贴上标签。在标签处包扎好。容器，包括装PBS的玻璃瓶，瓶口要拧松，不能紧，瓶口包扎牛皮纸，灭菌后立刻拧紧瓶盖，然后再取出，冷却后放入冰箱。注意检测标签是否脱落。
9、根据每个实验的要求，准备好所需物品，一并放入超净台内。实验器材准备的数量要大于实际使用数，瓶盖要大于瓶数。要配备至少三套器械（一套使用，一套备用，一套清洗灭菌），循环使用。
10、玻璃瓶、移液管要封闭包扎使用端，标记手持端。
实验二 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养
1、如何进行鸡胚胎成纤维细胞的原代培养。
实验进行前，准备好相关器材，无菌室及超净工作台以紫外灯照射灭菌30-60 分钟（溶液同时37℃预热），然后开启通风10 分钟后，才开始实验操作。实验用品以75% 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域酒精灯火焰旁进行。
1、取9-10日龄的鸡胚，用酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头尾、四肢及内脏；
2、胚体用含双抗PBS冲洗2-3次，切成1-2mm3的小块，然后转入容积适量大小的离心管；
3、按每个鸡胚加入大约5mL的胰酶消化液，在室温（或37℃）下消化10 min，吸管（或枪头）不停吹打；
4、加入含小牛血清培养液终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；
5、收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，1200转离心5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；
6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮；
7、以5×105个/mL的密度溶液3.4ml接种到培养瓶中（大约20-30mL细胞液/鸡胚0.6ml），观察细胞形态（绘图），将瓶盖微松，于37℃、5% CO2浓度、饱和湿度条件下培养。
8、经过1天的培养。
2、原代培养时如何从组织分离细胞?
收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，1200转离心5 min；离心管用酒精擦拭后拿进超净台，拧开盖子后，管口过火焰两次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下过火焰两次；
6、细胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮；
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。
实验三：培养细胞的形态观察及活率检测
1简述培养细胞的形态观察方法及注意事项。
(一)培养细胞的形态观察
1、将细胞培养瓶从二氧化碳培养箱中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。
2、打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。
3、调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是20X物镜（绘图）。
(二) 观察细胞体外培养状况
细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：
A．首先要观察培养细胞是否污染（观察阳性对照样品）。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。
B．观察培养基颜色变化及细胞是否生长。
C．如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。
D．观察完毕，可用台盼蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
2、简述台盼兰染色和伊红染色检测细胞活率的原理及操作方法。
台盼兰染色原理：
由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。
伊红染色检测细胞活率的原理：
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。
操作方法：
（四）台盼兰染色
1） 配制0.2％(W/V)台盼兰水溶液（溶于PBS，加热使之完全溶解，用滤纸或纱布过滤除渣，装入瓶内室温保存），及4.25 %(W/V) Nacl溶液；
2） 测定前，取4份0.2％台盼兰与1份盐水混合；
3） 取台盼兰溶液，另入到等量细胞悬中(细胞浓度2-5×106细胞/ mL)混匀；
4） 将细胞悬液加入血球计数板中，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。分别计数末染色的细胞数(活细胞)及染色的(死细胞)细胞数。细胞计数200个以上，（绘图）。
5）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100 %。
（五）伊红Y染色
1） 配制0.2％(W/V，溶于PBS)伊红Y水溶液；2） 取0.1mL细胞液悬(细胞浓度2-5×106细胞/ mL)，加入等量伊红Y溶液混匀；3）2 min后将细胞悬液加入血球计数板中，镜检、计数。死细胞染成桃红色，活细胞不着色（绘图）。细胞计数200个以上。，（绘图）
4）计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100％。
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。

放大的计数室
按下式进行细胞浓度的计数：

注① 4大格中的每一大格体积为0.1mm3。1mL=l，0000大格，因此，1大格细胞数×104=细胞数／mL。注② 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。
进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。
实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养
1、简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。
在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部（绘图），如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1、完全培养基配制:DMEM液   90％；小牛血清    10％；双抗(1万单位／mL)  加至约100单位／mL；
2、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内；
3、从培养箱内取出细胞，取出细胞时要旋紧瓶盖，再在镜下观察细胞。用酒精棉球擦拭后放入超净台内；
4、在酒精灯旁打开瓶塞，在酒精灯上烧口消毒，吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞2次，尽量除去残余的血清；
5、25 mL培养瓶中加入0.2 mL的消化液进行消化，以盖满细胞为宜，置于室温或放置于培养箱内，停留1-2min后，不停摇晃培养瓶。消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形，细胞之间不再连接成片为度；
6、吸出消化液，加入适量的含小牛血清的培养液，反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；
7、收集细胞悬液，1200-1500转离心5 min，去上清；
8、用培养液重新悬浮细胞并计算细胞活率和密度，以5×105个/mL密度（1：3）接种到培养瓶中，在瓶侧壁做好标记；
8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度；适当旋松瓶盖，于37℃、5% CO2浓度、饱和湿度条件下培养；
9、4小时后及第二天观察细胞生长情况。

图4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程
五、注意事项
1、严格无菌操作，作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开，不同液体不要共用吸管。2、所有溶液最好37℃预热。3、掌握好消化程度。4、正确摆放使用的用具，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
2、细胞传代培养获得成功的关键要素是什么?
①在做传代细胞培养之前，将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，才能进行传代培养。
②传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。
3、绘图展示自己的实验结果、谈谈你的实验感想。

实验二 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养
（大约20-30mL细胞液/鸡胚），观察细胞形态（绘图），
实验三：培养细胞的形态观察及活率检测
在观察时，最经常使用的是20X物镜（绘图）。
（观察阳性对照样品，（绘图））。细胞计数200个以上，（绘图）。
活细胞不着色，（绘图）。细胞计数200个以上。
实验四：鸡胚胎成纤维细胞的传代培养
观察原代培养的细胞是否铺满培养瓶底部（绘图），
8、在倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞形态和细胞浓度（绘图）； 9、4小时后及第二天观察细胞生长情况（绘图）。
图4-2 贴壁培养细胞的消化与传代培养操作流程
啤酒发酵实验
实验目的：
1. 学习酵母菌种的扩大培养方法，为实验室啤酒发酵准备菌种。
实验原理：1在进行啤酒发酵之前，必须准备好足够量的发酵菌种。在啤酒发酵中，接种量一般应为麦芽汁量的10%，因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行酵母菌种的扩大培养。扩大培养的目的一方面是获得足量的酵母，另一方面是使酵母由最适生长温度（28℃）逐步适应为发酵温度（10℃）。
.2啤酒酿造包括麦芽粉碎、麦汁糖化、麦醪过滤、麦汁煮沸、麦汁冷却及啤酒发酵等几个过程。啤酒发酵是纯种发酵，必须先对空的发酵罐进行灭菌处理。
3.麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个过程。由于麦芽的价格相对较高，再加上发酵过程中需要较多的糖，

实验器材：恒温培养箱，生化培养箱，显微镜、粉碎机、糖化煮沸锅、过滤沉淀槽、发酵罐、制冷机、板式换热器、糊化锅、糖化锅、麦汁过滤槽和麦汁煮沸锅、带冷却装置的发酵罐（50L，100L）、。
实验步骤：
一.啤酒酵母的扩大培养
28℃，2天
菌种扩大: 麦汁斜面菌种→麦汁平板——→镜检，挑单菌落3个，接种
50mL麦汁试管（或三角瓶）—20℃，2天→550mL麦汁三角瓶—15℃，2天→计数备用。
每天摇动3次 每天摇动3次
1 培养基的制备
取协定法制备的麦芽汁滤液（约400 mL），加水定容至约600 mL，取50 mL装入250 mL三角瓶中，另550 mL至1000 mL三角瓶中，包上瓶口布后，0.05 Mpa灭菌30分钟。
2 菌种扩大培养
按上面流程进行菌种的扩大培养（斜面活化菌种由教师提供）。注意无菌操作。
五、注意事项：灭菌后的培养基会有不少沉淀，这不影响酵母菌的繁殖。若要减少沉淀，可在灭菌前将培养基充分煮沸并过滤。
二、小型啤酒酿造设备介绍及发酵罐的空消
1. 熟悉各项设备；
清洗各项设备；
在回旋沉淀槽、板式换热器、发酵罐中通入蒸汽，消毒30分钟。
待各项设备使用结束后，应及时进行清洗灭菌。
三、麦芽汁的制备
1.麦芽粉碎
用谷物粉碎机粉碎，使粗细比例控制在1：2.5，同时使表皮破而不碎。必要时可稍稍回潮后在粉碎。
2.糖化
采用浸出糖化法
实验台称600g麦芽加入3000ml水，分入四个烧杯中于水浴锅上加热，使水浴锅中的液面高于烧杯中的液面。
糖化流程：35~37℃，保温30min→50~52 ℃ 60min→65 ℃30min（碘液反应完全） →76~78 ℃送入漏斗中进行过滤。
3.麦汁过滤：
用4~6层纱布进行过滤，前1L滤液收集返回漏斗中重新过滤，其余正常过滤。
把糟用2L的70度的水 冲洗出来，充分利用原料。
（过滤目的：尽快把麦汁和麦槽分开，以得到清凉和较高收率的麦汁，避免影响半成品麦芽汁的色香味。）
4.麦汁煮沸：
收集全部滤液，加热煮沸后加入5g酒花，继续煮沸1~1.5h。其间要经常搅拌。
停火后，沿着锅壁顺着一个方向搅拌，锅底中间会出现沉淀物。静置，把热麦汁趁热缓缓倒入灭过菌的封口容器（大的带盖子的），尽量减少沉淀物进入。
目的：通常采用传统的间歇常压煮沸法。煮沸时间一般为70-90分钟。）
5.麦汁冷却。
在麦汁冷却到室温后加入啤酒酵母，这个过程容易染菌，须在酒精灯火焰保护下加入
6.设备清洗
由于麦芽汁营养丰富，各项设备及管阀件（包括糖化煮沸锅、过滤槽、回旋沉淀槽及板式换热器）使用完毕后，应及时用洗涤液和清水清洗，并蒸汽杀菌。
7.主发酵
10 ℃发酵5~6d。发酵结束制成嫩啤酒。观察主发酵过程中的变化，并且做好实验记录。
8.后发酵
装瓶后置于冰箱中发酵7d。

实验结果

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