RNA的提取方法.doc

(完整word版)RNA的提取方法
RNA的提取(TRIzol法）
TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点就是可同时分离一个样品的RNA/DNA/蛋白质。TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中间层可回收DNA,用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织）也适用于大量样品（≥1g组织）。可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一个小时内即可完成.分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选,体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。
规格：100mL黄色透明液体,储存条件：2-8℃避光保存12个月，注意：请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗，乙醇会加重灼伤程度。
1、预防RNase污染注意事项
（1） 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌、霉菌可能成为RNase的来源.
（2） 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染.
（3）RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，高温灭菌。即可去除RNase。
（4)配置溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01%v/v，放置过夜，高压灭菌.注意DEPC有致癌之嫌,需小心操作。）
试剂准备:氯仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水或0.5％SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制
2、注意事项
从少量样品（1-10mg组织）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mLTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase—free糖原.糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/mL是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
3、常见问题分析
(1）得率低
①样品裂解或匀浆处理不彻底;
② RNA沉淀未完全溶解。
(2）A260/A280〈1.65
①检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低PH值条件下A280值偏高；
②样品匀浆时加的试剂量太少；
③匀浆样品时未在室温放置5min;
④吸取水相时混入了有机相；
⑤RNA沉淀未完全溶解。
（3）RNA降解
①组织取出后没有马上处理或冷冻；
②待提取RNA的样品没有保存于—60至-70℃,而保存在了-5至-20℃;
③ 溶液或离心管未经RNase去除处理。
（4）DNA污染
①样品匀浆时加的试剂量太少；
②样品中含有有机溶剂(如乙醇、DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。
(5）蛋白聚糖和多糖污染
沉淀RNA（加100％异丙醇）的过程中作以下改进可去除这些污染,即每使用1mLTRIzol在水相中加0.25mL异丙醇和0.25mL高盐酸溶液（0.8M柠檬酸和1。2M NaCl）混合离心，按之前操作进行.这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含量大量多糖的植物种提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。