缺氧诱导的外泌体活化自噬促进肝癌进展.pdf

目的探讨缺氧诱导的外泌体对肝癌进展的调节作用及其机制。方法将 细胞置于 培养箱培养 作为缺氧组，另设常氧组，提取外泌体，纳米追踪技术检测外泌体的浓度和粒径大小，免疫印迹检测 、的表达。将 细胞分为对照组（）、常氧外泌体组（常氧外泌体）、缺氧外泌体组（缺氧外泌体），实时无标记细胞分析仪（，）实验检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，免疫印记检测细胞 、的表达，激光共聚焦检测自噬流的改变。细胞分为对照组（）、缺氧外泌体组（缺氧外泌体）、缺氧外泌体 组（甲基腺嘌呤 后 缺氧外泌体），检测细胞增殖、迁移和相关蛋白的表达。结果与常氧组相比，缺氧组外泌体浓度增加，但外泌体粒径的大小没有明显变化，缺氧组外泌体标记蛋白 、的表达增加（）。与常氧外泌体组相比，缺氧外泌体组 细胞增殖和迁移能力增强（均 ），、的表达上调，、和 的表达下调（均 ），自噬流增强（）。与缺氧外泌体组相比，缺氧外泌体 组 细胞增殖、迁移和上皮间质转化作用减弱（），、的表达下调（），、和 的表达上调（）。结论缺氧诱导的外泌体可以参与细胞自噬的发生进而促进肝癌进展。关键词：肝细胞癌；外泌体；缺氧；自噬；自噬流中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，；，；，；，：）：，（），（），（），（）（），（），（），（，），（），山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，（），（），：；肝癌是常见的恶性肿瘤，其发病率与病死率均高居肿瘤前列，其中 的原发性肝癌属于肝细胞癌（，）。肝癌发病机制复杂，目前尚未完全阐明，因此缺乏有效的治疗靶点，导致其预后较差，年生存率极低 。最新研究 显示，外泌体在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色，细胞来源的外泌体内包含有多种促进肿瘤生长与转移的活性物质，如 ，通过调节多种肿瘤相关基因的表达，从而促进肝癌细胞增殖与肿瘤血管新生，诱导肝癌耐药 ，。作为实体瘤，缺血缺氧是肝癌的主要特征，然而，缺氧诱导外泌体对肝癌进展的调节作用及其机制，目前尚不清楚，因此本研究观察缺氧对外泌体的影响，以及缺氧外泌体对肝细胞癌进展的影响，探讨缺氧外泌体对肝细胞癌进展的作用机制，为明确肝癌发展机制和寻找肝癌治疗新的策略提供基础支撑。材料和方法 细胞培养 细胞由湖北省十堰市太和医院生物医药研究所 抗病毒感染与免疫、慢性肝病的基因治疗和免疫调节治疗课题组赠与，由上海吉满生物科技提供 基因型鉴定。细胞维持培养在含 的 培养基中，置于 含 的培养箱。采用 胰蛋白酶（，）对细胞进行消化传代。免疫印记检测外泌体标记蛋白、增殖相关蛋白、蛋白、自噬相关蛋白的表达 细胞经 洗涤后，加入含有蛋白酶抑制剂的 （）裂解缓冲液（，去氧胆酸钠，十二烷基硫酸钠），置于冰上裂解 ，离心收集裂解液上清，用 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质提取物，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。的脱脂牛奶室温封闭 ，分别加入抗 、抗 （美国 ），抗 、抗 、抗 、抗 、抗 、抗 、抗 、抗 、抗 （美国 ）、抗 （美国 ），孵育过夜。一抗稀释比例均为 。次日加入相应的二抗室温孵育后，加入 显影液（，）在显影仪（美国 ）显影。细胞划痕实验检测细胞迁移取对数生长的 细胞，待细胞汇合度达 ，随机分为对照组、常氧外泌体组、缺氧外泌体组和缺氧外泌体 组。对照组加入等体积 ；常氧外泌体组加入 常氧外泌体；缺氧外泌体组加入 缺氧外泌体；缺氧外泌体 组加入 孵育 后，再加入 缺氧外泌体，洗涤 次后，划痕，分别于培养 ，后在倒置显微镜（德国 ）下拍照，软件分析计算划痕区域面积，划痕愈合率的计算（划痕面积 划痕面积）划痕面积。实验检测细胞增殖取对数生长的 细胞铺入 孔板，处理和分组同 的处理和分组，每组 个复孔，待细胞汇合度达 ，分别加入含不同外泌体的培养基进行孵育，实时无标记细胞分析仪（阿富汗 ）检测细胞的增殖和迁移。激光共聚焦荧光显微镜检测自噬流的改变将对数生长 细胞接种到共聚焦专用培养皿中，随机分为对照组、常氧外泌体组、缺氧外泌体组，当细胞汇合度达到 左右，洗 次，脂质体转染 双荧光质粒（吉满生物有限公司），后更换培养基，对照组加入等体积 ，常氧外泌体组加入 常氧外泌体，缺氧外泌体组加入 缺氧外泌体，后高分辨激光共聚焦荧光显微镜检测自噬流的改变。外泌体的提取及浓度测定将 细胞扩大培养，当细胞汇合度达 ，随机分为两组，常氧培养为常氧组，给予 浓度处理为缺氧组，后收集细胞上清，采用美国 离心机 离心 ，离心 ，离心 去除沉淀，无菌 的滤膜过滤培养上清液，离心 弃去 ，上清，的 重悬沉淀，分别标注为常氧外泌体和缺氧外泌体，冰箱备用。用于凝胶电泳的样品则加入相应上样缓冲液加热变性后进行凝胶电泳，检测两组外泌体标记蛋白 、的表达。将外泌体采用干冰运输至上海美轩生物公司纳米追踪技术（，）进行外泌体粒径分析和透射电镜（）检测外泌体形态图，得到外泌体粒径分布范围图和外泌体形态图。实验检测外泌体吸收按照说明书，将 染料（上海宇玫博）溶于 中，混匀后加入 外泌体中，冰上静置 ，超高速离心机 离心 。弃上清，用 重悬沉淀后与细胞共同孵育 ，采用 （，二脒基 苯基吲哚，武汉谷歌）染核，抗荧光猝灭剂（北京索莱宝）封片，在高分辨共聚焦荧光显微镜下观察外泌体内化情况。统计分析所有实验均重复 次，采用 软件进行数据的统计学分析。计量资料数据以均数 标准差表示，两组间差异比较，采用 检验，三组间两两比较采用单因素方差分析，表示差异具有统计学意义。结果 缺氧诱导 细胞外泌体分泌采用透射电镜检测检测外泌体形态显示，外泌体呈球形囊泡，直径在 之间（见图 ）。免疫印记检测外泌体标记蛋白显示，与常氧组外泌体相比，缺氧诱导后外泌体标记蛋白 、表达增加（均 ，见图 ）。检测外泌体粒径，结果显示，细胞经缺氧诱导后，外泌体分泌量显著增加，但外泌体大小并无明显改变（见图 ），表明缺氧能够诱导肝癌细胞外泌体分泌。缺氧诱导的外泌体促进肝癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化 实验检测外泌体吸收情况显示，被绿色荧光染料 标记的外泌体，能够被 细胞吸收，在高分辨共聚焦荧光显微镜下呈现绿色荧光（见图 ）。结果显示，与对照组相比，常氧外泌体组 细胞的增殖能力增强，缺氧外泌体组 评估外泌体的粒径大小和浓度（重复 次，红色表示 区间）图 缺氧对 细胞外泌体分泌的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 的外泌体孵育 细胞 后，荧光显微镜下观察外泌体的吸收，绿色荧光表示被吸收的外泌体，蓝色荧光表示细胞核图 缺氧外泌体被 细胞吸收情况 细胞的增殖能力进一步增强（见图 ）；进一步对增殖与凋亡相关基因检测发现，缺氧外泌体组 和 的表达上调，的表达下调（均 ，见图 ）。细胞划痕实验显示，缺氧外泌体组 细胞迁移能力增强（，见图 ）。免疫印记显示，缺氧外泌体组 的表达下调，和 的表达上调（均 ，见图 ），免疫荧光技术再次对该结果进行了确认（见图 ），提示缺氧诱导外泌体能够促进肝癌细胞增殖、迁移与上皮间质转化。与对照组比较，；与常氧外泌体组比较，检测 、和 的表达图 缺氧外泌体对 细胞增殖的影响 ，图 缺氧外泌体对 细胞迁移的影响 、蛋白在高分辨共聚焦荧光显微镜下呈现绿色荧光，染过的细胞核呈现蓝色荧光（）免疫荧光检测 标志蛋白的表达图 缺氧外泌体对 细胞 表型的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 缺氧诱导的外泌体活化肝癌细胞自噬缺氧诱导的外泌体重孵育 细胞后，免疫印迹检测显示，与常氧外泌体组相比，缺氧外泌体组 和 的表达上调，的表达下调（均 ，见图 ）。激光共聚焦显微镜对自噬流的检测也发现，缺氧诱导后的外泌体促进了自噬流的发生（见图 ），表明缺氧诱导外泌体能够诱导肝癌细胞自噬。与对照组比较，；与常氧外泌体组比较，激光共聚焦显微镜检测自噬通量（）检测自噬标志蛋白的表达图 缺氧外泌体对 细胞自噬的影响 缺氧诱导的外泌体通过自噬促进肝癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化免疫印迹检测结果显示，与缺氧外泌体组相比，缺氧外泌体 组自噬相关蛋白 、表达下调，的表达上调（均 ，见图）。与对照组相比，缺氧外泌体组 细胞的增殖和迁移能力显著增强（均 ）；与缺氧外泌体组相比，缺氧外泌体 组 细胞的增殖和迁移能力显著减弱（均 ，见图 和图 ）。免疫印迹结果显示，与对照组相比，缺氧外泌体组 、表达上调（均 ），、表达下调（均 ）；与缺氧外泌体组相比，缺氧外泌体 组 、表达下调（均 ），、表达上调（均 ，见图和图 ），免疫荧光检测 特征蛋白进一步确认（见图 ）。表明 能逆转缺氧外泌体对 细胞增殖、迁移和上皮间质转化的促进作用，提示缺氧诱导外泌体可能通过自噬促进肝癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化。与对照组比较，；与缺氧外泌体组比较，图 检测 抑制自噬后缺氧外泌体对 细胞自噬的影响 ，与对照组比较，；与缺氧外泌体组比较，检测 、的表达图 抑制自噬后缺氧外泌体对 细胞增殖的影响 图 划痕实验检测 抑制自噬后缺氧外泌体对 细胞迁移的影响 山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 、蛋白在高分辨共聚焦荧光显微镜下呈现绿色荧光，染过的细胞核呈现蓝色荧光 免疫荧光检测 相关蛋白的表达（）图 抑制自噬后缺氧外泌体对 细胞 表型的影响 ，讨论缺氧是肿瘤生长过程中的常态，并被认为是肿瘤进展的关键调控因子。进展中的肿瘤迅速超出其供氧能力，表现出组织氧张力的降低。在大多数恶性肿瘤中，氧含量的中位数约为 ，而正常组织的氧压相当高（在 之间）。这种现象是由于肿瘤血管不规则或与支持血管的距离过远，导致癌细胞增殖所需的氧和供氧不足所致 ，。受到缺氧的影响，肿瘤生长的微环境被改变。肝癌作为常见的实体瘤，肿瘤中心部位缺血缺氧尤为明显。大量研究表明，缺氧可以通过多种机制促进肝癌进展，如促进血管生成和能量代谢、逃避免疫破坏、激活侵袭和转移、促进炎症、维持增殖信号、抵抗细胞死亡和改变基因组稳性定等 。然而，由于具体机制复杂，目前尚未完全阐明。外泌体是直径在 之间的细胞外囊泡，几乎所有的体细胞均可分泌，内含蛋白质、各类 、脂质等 。多年来，外泌体被认为是细胞外的碎片，现在被认为是细胞间通讯的重要介质。外泌体介导的细胞间通讯不仅参与正常生理过程的调控，还参与癌症在内的许多疾病的病理调控 ，。研究表明，来源于癌细胞的外泌体主要通过传递 、等参与肿瘤生长、肿瘤发生、血管生成、肿瘤免疫逃逸、耐药和转移。并且可以介导癌细胞与癌细胞之间，癌细胞与细胞基质，细胞基质与细胞基质之间的信息传递，而且可能在参与血液循环时发挥全身作用 。有研究发现，外泌体在缺氧诱导的肿瘤进展中也发挥着重要作用 。缺氧可能通过活化缺氧诱导因子 及 通路促进肿瘤细胞外泌体的生物合成 ，也可以促进前列腺癌细胞外泌体释放，这些外泌体通过将乳酸等代谢产物分泌出去，进而促进前列腺癌细胞的存活 ，还可以调节多种免疫细胞的活性 ，如 细胞、细胞。本研究发现，缺氧可以诱导肝癌 细胞外泌体分泌增加，且缺氧诱导外泌体能够促进肝癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化。自噬是真核细胞中进化上高度保守、用于降解细胞内生物大分子和受损细胞器，并回收利用降解产物的过程，因此被看做是细胞对自身异常或应对外来刺激时的一种自我保护机制。细胞内外的多种应激可以诱导自噬的发生 ，如饥饿、生长因子缺乏、缺氧、损伤、蛋白聚集、细胞器受损、微生物感染等。通过清除损害细胞正常生命活动的危险因子，自噬在维持细胞存活中具有重要作用。自噬异常则会诱导多种疾病的发生。研究显示，肝癌组织大多存在自噬的异常 ，且自噬在肝癌中发挥着双刃剑的作用 。一方面，自噬可以通过抑制炎症、的沉积以及应激反应，从而抑制基因组不稳定性，因此在肿瘤发生的早期起着肿瘤抑制作用；另一方面，自噬又能通过抑制凋亡和 产生等多种机制促进肿瘤细胞的生长。采用 抑制自噬则可以进一步阻止肾纤维化 的发展 。在肿瘤细胞中，外泌体的分泌和自噬都会加快，外泌体生物发生途径以不同方式与自噬联系，包括自噬囊泡与溶酶体融合以降解货物，其中自噬相关蛋白也可能有助于外泌体的生成和分泌 。即缺氧诱导的外泌体与外泌体通过自噬促进肝癌细胞增殖、迁移与上皮间质转化是可能存在协同作用的。本研究发现，缺氧外泌体可以诱导肝癌 细胞自噬，而抑制自噬则逆转了缺氧外泌体对 细胞增殖、迁移和上皮间质转化的促进作用，表明自噬介导了缺氧外泌体对肝癌进展的促进作用。本研究显示，缺氧可以诱导肝癌细胞外泌体分泌增加，且缺氧外泌体可能通过诱导肝癌细胞自噬，进而促进肝癌进展。然而，由于外泌体成分复杂，因此有必要进一步深入探讨缺氧对外泌体成分的调节，以及外泌体中不同成分对肝癌进展的作用及其机制，为进一步明确肝癌发生发展机制提供新的理论依据。参考文献：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）（），（）：，（）：山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，