奇异变形杆菌Proteus mirabilis A57对Cr（VI）污染的生物修复研究.pdf

自铬污染工业废水中分离得到若干株 Cr(VI)耐受菌株,并通过对比各耐受菌株 MIC(最小抑菌浓度)以及去除效率,确定实验菌株 A57。通过形态学、生理生化鉴定结合 16S rDNA 序列比对分析,鉴定为奇异变形杆菌Proteus mirabilis A57。生物修复试验结果表明,P.mirabilis 在 100 mgL1的 Cr(VI)浓度下即有较高的 Cr(VI)去除能力,28 下培养 24 h 总去除率为 44.79%。进一步的条件优化实验表明,P.mirabilis 在最佳培养条件下(30,初始pH 7.0),42 h 可将 150 mgL1的 Cr(VI)完全去除。不同组分试验结果显示,菌株 A57 的菌体可以更有效地去除Cr(VI)(相对于上清液和细胞裂解物)。扫描电子显微镜(SEM)试验观察到细胞表面形成不规则非晶态物质,表明Cr(VI)的生物修复反应主要发生在细菌细胞表面,XPS 结果证实了生物还原反应的发生,菌体表面 Cr 元素存在形式主要为 Cr(OH)3及 CrCl3。关键词：关键词：铬污染;奇异变形杆菌;鉴定;生物修复 doi:10.14108/ki.1008-8873.2023.05.017 中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2023)05-145-09 Bioremediation of Cr(VI)pollution by Proteus mirabilis A57 CHEN Xu 1,2,HUANG Shengwei1,3,WU Lifang1,2,3,*1.Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences,Institute of Intelligent Machinery,Hefei 230031,China 2.University of Science and Technology of China,Hefei 230026,China 3.Key Laboratory of Environmental Toxicology and Pollution Control Technology of Anhui Province,Hefei 230031,China Abstract:Several Cr(VI)tolerant strains were isolated from chromium polluted industrial wastewater,and the MIC(minimum inhibitory concentration)and removal efficiency of each resistant strain were compared to determine the experimental strain A57.Proteus mirabilis A57 was identified by morphological,physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence alignment analysis.The results of bioremediation experiment showed that P.mirabilis had high Cr(VI)removal ability at the concentration of 100 mgL1,and the total Cr(VI)removal rate was 44.79%after 24 h incubation at 28.Further optimization experiments showed that Cr(VI)of 150 mgL1 could be completely removed by P.mirabilis under the optimum culture conditions(30,initial pH 7.0)in 42 hours.The results of different components showed that strain A57 could remove Cr(VI)more effectively than supernatant and cell lysate.The irregular amorphous substance on the cell surface was observed by SEM,which proved that the bioremediation reaction of Cr(VI)mainly occurred on the bacterial cell surface.XPS results confirmed the occurrence of biological reduction reaction,and the main 146 生 态 科 学 42 卷 forms of Cr on the surface of bacteria were Cr(OH)3 and CrCl3.Key words:Chromium pollution;Proteus mirabilis;identification;bioremediation 0 前言 铬盐是重要的无机化工原料之一,广泛应用于电镀,皮革,陶瓷等各种行业。我国是世界铬盐生产大国,年产量超过 15 万吨,由于我国铬盐行业采用资源以及能源利用率较低的有钙焙烧传统工艺,该工艺流程产生的铬渣及含铬废气是最主要的重金属铬污染源之一。铬渣中的六价铬是强氧化物,未经妥善处理的铬渣中的六价铬易随着雨水冲刷进入土壤以及水体环境,进入土壤环境中的 Cr(VI)会抑制有机物硝化作用,影响氮循环,导致作物产量降低造成严重的直接经济损失。据文献报道,每年因土壤污染导致粮食减产近 1000 万吨,造成各种经济损失约200亿元1;进入水体环境中的Cr(VI)会降低废水生化处理效率。Cr(VI)作为不可降解型有毒物质,会从土壤以及水体环境沿食物链被各种生物吸收富集,最终进入人体。Cr(VI)对人体的呼吸道,消化道,皮肤等具有刺激性,并且作为公认的致癌物,易引发人体肺癌,鼻咽癌。因此,铬污染的妥善处理已经成为当前农业工业以及环境保护方面迫在眉睫的问题。目前工业上治理铬污染的方式主要有物理吸附法,化学沉淀法以及生物修复法。由于工业废水成分的复杂性,物理吸附法所需处理条件较为苛刻,而化学沉淀法易产生大量污泥,因此生物修复法因为其独特的低成本,无二次污染越发受到青睐。铬污染的生物修复是通过生物的新陈代谢来减少铬污染环境中重金属铬的含量或者通过改变重金属铬的形态或价态使其危害降低,从而使已受铬污染的环境能够部分或者完全恢复到未受污染的状态的过程。近年来,多株细菌被证实可以修复重金属铬污染,如 微 代 谢 棒 状 杆 菌(Corynebacterium paurometabolum)2、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)3、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)3,普罗维登斯菌(Providencia sp.)4。奇异变形杆菌Proteus mirabilis 为无荚膜、无芽孢、有鞭毛和有菌毛的革兰氏阴性菌,广泛存在于自然界内。据报道,奇异变形杆菌对抗生素,重金属及芳香烃具有耐受性5,但其对于重金属铬的生物修复机制研究还未有报道。在本次实验中,筛选分离到一株对重金属铬具有优良耐受性和去除效果的奇异变形杆菌Proteus mirabilis A57。最佳培养条件下,该菌株对铬的去除率可以达到 100%,具有良好的应用前景。1 材料与方法 1.1 试验材料 Cr(VI)储存液:化学试剂 K2Cr2O7(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司,超纯水配制成1000 mgL1备用。YEP 培养基(L1):酵母粉 10 g,蛋白胨 10 g,牛肉膏 5 g,16 g 琼脂粉(固)。灭菌锅温度设定为121,20 min。0.22 m 滤膜:Millipore 聚碳酸酯膜。1.2 试验方法 1.2.1 Cr(VI)耐受细菌分离纯化与鉴定 取 1 mL 铬污染的工业废水,加入 9 mL YEP 液体培养基,28,180 rpm 下震荡 8 小时,取 1 mL 菌液用无菌水梯度稀释(102108)取 106、107、108三个稀释度的菌液 100 L,涂布于含 50 mgL1Cr(VI)的 YEP 固体培养基上,28 培养 48 h,然后挑取单菌落划线,纯化 34 次,革兰氏染色镜检,确认为纯菌后,采用 YEP 液体培养基培养,放入80 超低温冰箱保存。为了更好的评估耐受菌株的 Cr(VI)耐受性,将筛选到的耐受菌株分别接种在不同 Cr(VI)浓度梯度的 YEP 培养基中。根据 Cr(VI)的最小抑制浓度(minimal inhibit concentration,MIC),选择 3 个对Cr(VI)耐受性能最好的菌株测定其 Cr(VI)去除能力。其中,菌株 A57 具有优良的 Cr(VI)耐受性和最高的Cr(VI)去除能力,挑选该菌株进行进一步的研究(表1)。确定了试验菌株之后,采用 EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(北京全式金生物技术有限公司)提取该菌株基因组 DNA,之后使用细菌 16S rDNA通用引物 27F1492R 扩增细菌 16S rDNA 片段,用 DNA 凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物,连接,转化,挑取阳性克隆子送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序,获得的序列递交 Ezbiocloud 网站 5 期 陈旭,等.奇异变形杆菌 Proteus mirabilis A57 对 Cr(VI)污染的生物修复研究 147 表 1 三个耐受菌株的 MIC 和 Cr(VI)去除率 Table 1 The MIC and Cr(VI)removal rate of three isolates 菌株 MIC/(mgL1)Cr(VI)去除率/%A49 200 0 A51 200 26.711.47 A57 300 44.791.11 (http:/ Blast 比对分析,同时利用 MEGA 7 软件,采用最大似然法(Maximum Likehood)构 建 系 统 发 育 树6,设 定Bootstrap 值为 10007,确定菌种所属分类地位。1.2.2 生物修复实验设计 1.2.2.1 试验处理 向装有 10 mL YEP 培养基的 50 mL 锥形瓶中加入铬耐受菌株菌悬液(0.1 mL,109 CFU mL1),对照组加入 0.1 mL 无菌水,并分别向处理组和对照组加入等量 Cr(VI)储存液,至溶液中 Cr(VI)浓度为100 mgL1,置于 28 下培养,摇床转速为 180 rpm。以上每个处理和对照均设置三组重复。1.2.2.2 样品采集与分析 分别取培养 0 h、6 h、9 h、12 h、24 h 处理组和对照组菌液,10000g 离心 6 min,分别收集菌体与上清。收集到的菌体用等体积无菌 PBS 缓冲液重悬,在 UV 600 nm 处测得 OD600 值,作为菌液浓度参考值,确定细菌的生长状况。收集到的上清液用1,5二苯碳酰二甲肼(DPC)法8测定 Cr(VI)浓度,计算 Cr(VI)去除率。去除率由以下公式算出:Cr(VI)去除率=(1处理组 OD540 值/对照组OD540 值)100%。1.2.3 生物修复条件优化 1.2.3.1 温度优化 向装有 10 mL 灭菌 YEP 液体培养基的 50 mL锥形瓶中,分别加入 0.1 mL 过夜培养的新鲜菌液(109 CFUmL1)及 Cr(VI)储存液,至 Cr(VI)初始浓度均为 150 mgL1。分别置于 25、30、32、35、37 及 40 恒温震荡培养箱,180 rpm 下培养 24 h。24 h 后每组取 2 mL 菌液,10 000g 离心 6 min,上清液使用 0.22 m 滤膜过滤,收集后测定剩余 Cr(VI)浓度。1.2.3.2 初始 pH 优化 同 2.2.3.1,向装有 10 mL 灭菌 YEP 液体培养基的 50 mL 锥形瓶中,分别加入 0.1 mL 过夜培养的新鲜菌液(109 CFUmL1)及 Cr(VI)储存液,至 Cr(VI)初始浓度均为 150 mgL1。之后使用 0.01 M HNO3或0.01 M NaOH 调节培养基初始 pH,至各处理组初始pH 分别为 6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0。置于同一恒温震荡培养箱培养 24 h(30,180 rpm)。24 h 后每组取 2 mL 菌液,10 000g 离心 6 min,上清液使用0.22 m 滤膜过滤,收集后测定剩余 Cr(VI)浓度。1.2.3.3 反应条件优化 向装有 10 mL 灭菌 YEP 液体培养基的 50 mL锥形瓶中,分别加入 0.1 mL 过夜培养的新鲜菌液(109 CFUmL1)及 Cr(VI)储存液,至 Cr(VI)初始浓度均为 150 mgL1。置于恒温震荡培养箱培养(30,180 rpm),分别取培养 0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、32 h、38 h、42 h、48 h 菌液悬液,10 000g 离心 6 min,分别收集该时间点上清液,0.22 m滤膜过滤后收集,测定剩余 Cr(VI)浓度。1.2.4 Cr(VI)去除活力的表征 1.2.4.1 菌株不同组分去除 Cr(VI)的能力 根据Wu等人9的方法,研究菌株A57的无细胞上清液、菌体和细胞裂解物对 Cr(VI)的去除能力。收集过夜培养的 A57,10 000g 离心 10 min,分别收集上清液和沉淀。上清液通过 0.22 m 滤膜进一步过滤去除菌体,得到无细胞上清液。菌体沉淀部分,用无菌 PBS 缓冲液洗涤菌体两次,重悬至等体积的PBS 缓冲液中,获得细胞悬液。然后,将细胞悬液分为两部分:一部分不作任何处理,为菌体悬浊液。另一半冰浴 10 min 后,使用超声破碎仪破碎,超声条件:超声时间20 min,功率200 W,超声2 s停止3 s。破碎后,4,10000g 离心 5 min,收集上清,通过0.22 m 过滤膜进一步过滤以获得细胞内容物。分别用上述获得的无细胞上清液、菌体悬浊液和细胞裂解物处理初始浓度为 100 mgL1 的 Cr(VI)溶液,以相同 Cr(VI)浓度的 YEP 培养基和 PBS 缓冲液作为对照。在 28 下处理 24 h,10 000g 离心收集上清,用 1,5二苯碳酰二甲肼(DPC)法测定Cr(VI)浓度。1.2.4.2 扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)能谱(Energy dispersive X-ray analysis,EDX)观察分析 采用 SEM-EDX(S-4800,Hitachi,Tokyo,Japan),148 生 态 科 学 42 卷 观察在含Cr(VI)培养基中培养后,A57的表面形貌特征及细胞表面元素分布。1.2.4.3 傅里叶变换红外光谱仪(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)分析(1)样品准备 取收集过夜培养的 A57 置于含 100 mL 灭菌YEP 液体培养基的 250 mL 锥形瓶中,分为两组,一组为实验组,加入 Cr(VI)储存液至 Cr(VI)初始浓度为 200 mgL1;另一组不做任何处理,为空白对照。将两组置于同一恒温摇床(30,180 rpm)培养 24 h后取出。每组取 5 mL 混合液,10000g 离心 5 min弃上清。将得到的沉淀部分置于真空干燥箱干燥过夜备用。(2)FTIR 压片 取适量化学纯晶体溴化钾于预干燥的玛瑙研钵中,研磨至晶体粉碎为白色粉末,肉眼无可见晶体颗粒,远红外干燥仪干燥并制备空白压片对照。之后,取适量制备样品及上述粉末状溴化钾混合,置于研钵中研磨至混合完全,远红外干燥仪中干燥。压片结束后置于远红外干燥仪中静置,待所有压片制备完成,一并取出。(3)FTIR 扫描 以空白压片为基准,使用Nicolet IS10红外光谱仪在 4000400 cm1段测得谱线。1.2.4.4 X 射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)分析 样品制备同 FTIR,待测样品送交中国科学技术大学理化实验中心,使用 ESCALAB 250Xi 电子能谱仪进行全波段测试,得到全谱。使用Origin 9软件,对 Cr2p 进行分峰拟合。1.3 数据处理 运用 Origin 9 软件对测定数据进行分析处理,所用数据均为3次重复的平均值标准差(MeanSD),并采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同处理组间以及处理组与对照组间的差异。2 结果与分析 2.1 重金属铬 Cr(VI)耐受菌株的分离、鉴定 从含50 mgL1Cr(VI)的YEP固体琼脂培养基上,经分离纯化,得到 3 株对铬 Cr(VI)具有优良耐受性能的菌株,将其中表现出最高的 Cr(VI)耐受性和去除能力的分离菌株命名为 A57。A57 的菌落呈浅白色,形状不规则,革兰氏染色反应呈阴性,细胞为杆状,固体平板上有游动性。参照常见细菌系统鉴定手册10,对分离菌株 A57 进行生理生化鉴定,测定结果如表 2 所示。测序结果如下:扩增得到的 16S rDNA 片段为1183 bp(GenBank 登录号为 MW686730),经序列比对分析,该菌株 16S rDNA 序列与 Proteus mirabilis的相似性均达 99%。同时,基于最大似然法的系统发育树显示 A57 与 P.mirabilis 亲缘关系最近。结合该菌株的菌落、显微形态以及生理生化特性,确定A57 为奇异变形杆菌,命名为 P.mirabilis A57。2.2 菌株 A57 对 Cr(VI)的去除效果测定 耐受细菌 P.mirabilis A57 在 Cr(VI)100 mgL1,28 条件下培养的生长状况以及溶液中 Cr(VI)浓度变化如图 2 所示:100 mgL1的 Cr(VI)浓度下,28 下培养 24 h,A57 具有较高的 Cr(VI)去除能力,总去除率为44.79%,而对照组 Cr(VI)浓度无变化,说明非生物因素对 Cr(VI)去除的影响是可以忽略的。结果表明,该菌在 100 mgL1的 Cr(VI)浓度下的培养基中具有良好的生长状态,A57 去除溶液中的 Cr(VI),培养基对溶液中 Cr(VI)的去除没有影响。2.3 菌株 A57 去除 Cr(VI)的条件优化 2.3.1 温度优化 反应温度对 Cr(VI)的去除反应影响如下图 3:表 2 菌株 A57 生理生化特性试验结果 Table 2 Physiological and biochemical characteristic of the bacterial isolate A57 结果 结果 革兰氏染色 酶活:亚硝酸盐还原+-葡萄糖苷酶+运动性+蛋白酶 氧化酶 碳源利用:过氧化氢酶+麦芽糖 吲哚反应+棉子糖 硝酸盐还原+乳糖 脲酶+甲基-D-葡萄糖苷 水解:顺乌头酸+淀粉 阿拉伯糖+明胶+组氨酸+硫化氢反应+海藻糖+5 期 陈旭,等.奇异变形杆菌 Proteus mirabilis A57 对 Cr(VI)污染的生物修复研究 149 图 1 基于菌株 A57 16s rDNA 序列最大似然法构建的系统进化树 Figure 1 A maximum likelihood tree based on the 16s rDNA sequence of the isolate A57 图 2 P.mirabilis A57 在 Cr(VI)100 mgL1下生长曲线,Cr(VI)的去除曲线 Figure 2 Bacterial growth curve and Cr(VI)removal curve of P.mirabilis A57 如图所示,菌株 P.mirabilis A57 在培养温度为30 时对 Cr(VI)去除率平均值最高,24 h 去除率可达 74.37%(Cr(VI)初始浓度 150 mgL1)。故后续的初始 pH,反应时间优化均在 30 下进行。2.3.2 初始 pH 优化 培养基初始 pH 对 Cr(VI)的去除反应影响如下图 4:如图所示,菌株 P.mirabilis A57 在培养基初始 pH 为 7.0 时对 Cr(VI)去除率最高,24 h 去除率可达 图 3 反应温度对 P.mirabilis A57 Cr(VI)去除反应的影响 Figure 3 Effect of incubation temperature on Cr(VI)removal by P.mirabilis a57 83.7%,Cr(VI)初始浓度 150 mgL1。培养基初始 pH由 6.0 增长至 7.0 时,Cr(VI)的去除率显著提高,随后,pH 由 7.0 增长至 8.0,9.0 时,Cr(VI)的去除率逐步降低。培养基初始 pH 为 10.0 时,Cr(VI)去除率显著降低。2.3.3 培养时间对 Cr(VI)去除率的影响 Cr(VI)去除率随时间的变化图如下图 5 所示:如图 5 所示,菌株 P.mirabilis A57 对 Cr(VI)生物修复反应是个持续的过程,其中 612 h 铬去除速度最快,这与细菌的生长状态有关,培养时间超 150 生 态 科 学 42 卷 图 4 初始 pH 对 P.mirabilis A57 Cr(VI)去除反应的影响 Figure 4 Effect of pH of incubation on Cr(VI)removal by P.mirabilis a57 图 5 培养时间对 P.mirabilis A57 Cr(VI)去除反应的影响 Figure 5 Effect of incubation time on Cr(VI)removal by P.mirabilis A57 过30 h后,铬去除率达到95%(30 h),反应趋于平缓,培养时间到达 42 h 时,培养液上清中已经检测不到Cr(VI)粒子的存在,证实 42 h 时,P.mirabilis A57 可将初始浓度 150 mgL1的含 Cr(VI)溶液完全修复。2.4 菌株 A57 不同组分去除 Cr(VI)的能力 如图 6 所示,相较于上清液和细胞裂解物,菌株 A57 的菌体可以更有效地去除 Cr(VI)。在 28 下处理 24 h 后,A57 活细胞的 Cr(VI)去除率达到三者中的最大值(30.66%),与此同时,A57上清液和细胞裂解物的 Cr(VI)去除率分别为 13.37%,7.94%。菌体去除 Cr(VI)的效率最高,这一现象也从侧面说明了菌株 A57 可能是通过细胞壁的吸附作用来去除游离 Cr(VI)离子的。另外,上清液和细胞裂解物对 Cr(VI)的去除作用也不容忽视,因为相较于细菌悬浊液,菌株 A57 的菌体的 Cr(VI)去除率明显降低,证明上清液和细胞裂解物在 Cr(VI)的去除过程中同样起到了重要作用,间接参与了 Cr(VI)的细胞壁吸附作用。2.5 SEM-EDX 观察分析 为了更直观的分析菌株 A57 对 Cr(VI)的修复机制,采用 SEM 进一步观察了 150 mgL1Cr(VI)胁迫下处理 24 h 的细菌细胞。在 SEM 图像中可以直观地观察到细胞的形态:细胞呈杆状,表面有鞭毛,相对于对照组可见大量的非晶态物质附着在细胞表面。随后对非晶态物质的 EDX 分析结果显示,除了C 和 O 等物质外,还产生特定的 Cr 吸收峰,说明该非晶态物质为含 Cr的物质,为 A57对 Cr(VI)生物修复后的产物。2.6 FTIR 及 XPS 分析 为了更好地阐明菌株 A57 的 Cr(VI)去除作用以及去除反应的化学机理,用FTIR及XPS分析了A57于 Cr(VI)胁迫下培养前后官能团的差异,结果如下图 8、9 所示:与Cr(VI)共培养后,菌株A57的FTIR光谱图中观察到几个显著的变化,表明 A57 的几个官能团参 图 6 菌株 A57 不同组分在 28 下处理 24 h 后的 Cr(VI)去除率 Figure 6 Cr(VI)removal rate by the supernatant,cell lysate,and cells of the isolate A57 at 28 after 24 h incubation 5 期 陈旭,等.奇异变形杆菌 Proteus mirabilis A57 对 Cr(VI)污染的生物修复研究 151 图 7 A57 SEM 图像(A:Cr(VI)胁迫下处理 24 h 的细菌细胞;B:对照;C:菌体表面非晶态物质的 EDX 能谱分析结果)Figure 7 A57 SEM figure(A:Bacterial cells treated with Cr(VI)for 24 hours;B:Control;C:EDX elemental analysis of the amorphous,filamentous substances(red arrow)attached to the cell surface.)图 8 A57 FTIR 分析 Figure 8 The FTIR spectra of A57 图 9 A57 XPS 分析 Figure 9 The XPS spectra of A57 与了 Cr(VI)的去除反应过程。与 Cr(VI)共培养后,O-H 伸缩区域(3293 cm1)的振动带移至 3408 cm1。此外,与 1648 cm1(蛋白酰胺 I 带)、1403 cm1(C=O或 C-H 的存在)、1065 cm1(平面内 C-H 弯曲或 C-O伸缩振动)相关的带在Cr(VI)处理后也发生了水平位移,表明这些官能团很可能参与了 Cr(VI)的去除反应过程。针对 A57 菌体表面的 XPS 图谱表明,细菌表面生成物中 Cr 元素主要分为两种结合状态,分别为CrCl3(577.7)及 Cr(OH)3(586.8),验证了生物还原反应的发生以及上述 2.5 结论。3 讨论 近年来,重金属铬污染的微生物治理已经成为当前工农及环境保护方面的热门话题。相对于传统治理手段,Cr(VI)的细菌修复的特点是快速、经济、无化学添加、工艺流程能量需求低。因此,国内外科研工作者在重金属铬耐受细菌的分离鉴定及去除机理研究等方面开展了大量的研究工作,从各种铬污染环境中分离得到多株对重金属铬具有优良耐受性能的菌株。本研究从铬污染工业废水中分离出一株具有优良 Cr(VI)耐受性能的细菌并鉴定为奇异变形杆菌 P.mirabilis A57。本次试验结果证明,实验用菌 P.mirabilis A57拥有良好的 Cr(VI)耐受性能(MIC 约为 300 mgL1),且对溶液内的 Cr(VI)有良好的去除效果。Cr(VI)浓度为 100 mgL1时,A57 常温下即具有较高的 Cr(VI)去 152 生 态 科 学 42 卷 除能力,24 h 时总去除率为 44.79%。SEM 图谱结果表明,150 mgL1Cr(VI)胁迫下,细菌菌体仍未出现挤压变形或者破裂的现象,说明 A57 在该浓度下拥有良好的耐受性能。而菌体表面形成的不规则非晶态物质说明了 Cr(VI)的生物修复作用主要发生在细菌细胞表面。这一类似现象在其他菌株的报道中也有发现,如Pseudochrobactrum saccharolyticum W111。Sujoy 等人12研究发现 Termitomyces clypeatus 在Cr(VI)环境下培养后,青霉菌表面吸附 Cr(VI)后形成了笼状结构,表明该现象在生物界广泛存在。Wu等人9在研究芽孢杆菌去除Cr(VI)时运用FTIR技术对比了 CRB7 在 Cr(VI)环境下培育前后的表面官能团变化,结果表明,-OH,-NH 峰型的变化表明多糖与蛋白质参与了 Cr(VI)的生物修复作用。Debabrata 等人13作了进一步的分析,在 Cr(VI)处理Scenedesmus sp.的FTIR谱图中出现延伸或强度增加的峰以及新峰,表明 Cr(VI)与细菌细胞壁官能团结合,并得出结论这些细胞的表面官能团,如羧基、烷烃、酰胺、羟基、磷酸盐和羰基,与 Cr(VI)的生物吸附反应息息相关。此外,Zainul 等人14发现Acinetobacter haemolyticus 可以通过改变细胞表面官能团来改变细胞结构以吸附重金属,提高细菌在有毒环境中的生存能力。目前,关于吸附重金属 Cr(VI)的研究并不少见,但大多研究重点多集中在抗性菌株的分离鉴定,生物修复反应条件优化等方面,如 Saranraj 等人15优化了钻黄肠球菌 Enterococcus casseliflflavus 吸附Cr(VI)的反应条件,发现钻黄肠球菌在 3545 时有较高的吸附率。Mrudula 等人16优化了琼氏不动杆菌 Acinetobacter junii 还原 Cr(VI)的反应条件,发现琼氏不动杆菌在初始pH为9.0时有较高的吸附率,进一步优化生物吸附反应条件,最终发现在 12 h 内琼氏不动杆菌 A.junii 最多可去除 99.95%的Cr(VI)(14.85 gL1 molasses、4.72 gL1酵母提取物、Cr(VI)初始浓度 54 mgL1)。生物修复技术的重点之一是在自然条件下发挥作用,优化条件下去除效果良好的菌株,受自然环境条件影响去除效果会显著降低。本次研究的抗性细菌 A57 在常温 28,中性pH 即有较高的去除率,在优化条件(30、初始 pH 7.0、反应时间 42 h)下更可 100%去除初始浓度为150 mgL1的含 Cr(VI)水溶液,解决了重金属铬污染的难点,即可将 Cr(VI)浓度降低至国家饮用水标准17限定的阈值 0.05 mgL1以下,表明该菌株有着较好的工业应用前景,为在实际生产上运用 A57治理铬污染提供了理论依据。4 结论 本研究自铬污染废水中分离,并检测抗性菌株生理生化指标,结合抗性菌株 16s rDNA 序列对比,鉴定出兼具优良 Cr(VI)抗性(MIC 为 300 mgL1)及优异去除性的奇异变形杆菌 P.mirabilis A57,该菌株具备六价铬的去除及还原性能,与至今为止已报道的修复菌株相比,该菌株耐受性能较强,且在常温(28)下即有着较好的 Cr(VI)去除效率(44.7%),更是在优化条件下(30,初始pH为7.0),培养42 h后 Cr(VI)去除率可达到 100%。该去除效率解决了理化方法无法解决的重金属铬污染的治理难点:将Cr(VI)浓度降低至国家饮用水标准限定的阈值0.05 mgL1以下,表明该菌株生物修复铬污染的水环境具备优异的工业应用前景。参考文献 1 周建军,周桔,冯仁国.我国土壤重金属污染现状及治理战略J.中国科学院院刊,2014,29(3):315320.2 PRABHAKARAN D C,SUBRAMANIAN S.Studies on the Bioremediation of Chromium from Aqueous Solutions Using C.paurometabolumJ.Transactions of the Indian Institute of Metals,2017,70(2):113.3 SATHISHKUMAR K,MURUGAN K,BENELLI G,et al.Bioreduction of hexavalent chromium by Pseudomonas stutzeri L1 and Acinetobacter baumannii L2J.Annals of Microbiology,2016,67(1):18.4 THACKER U,PARIKH R,SHOUCHE Y,et al.Hexavalent Chromium Reduction by Providencia spJ.Process Biochemistry,2006,41(6):13321337.5 FILALI B K,TAOUFIK J,ZEROUAL Y,et al.Waste Water Bacterial Isolates Resistant to Heavy Metals and AntibioticsJ.Current Microbiology,2000,41(3):151156.6 BELOGOLOVA G,SOKOLOVA MG,GORDEEVA N,et al.Speciation of arsenic and its accumulation by plants from rhizosphere soils under the influence of 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