伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统对SopE表达影响的初步研究.pdf

基金项目:江苏省高等学校自然科学研究重大项目(2 0 K J A 3 1 0 0 0 6);江苏省博士后科研资助计划(2 0 2 1 K 2 0 9 B);江苏大学青年英才培育计划通信作者:张盈,黄新祥C o r r e spo n d e n c e t o:Z H A N G Y i ng E-m a i l:z h a ng yi ngzj8 5 1 6 3.c o m;HU A N G X i n x i a ng E-m a i l:h u x i n x ujs.e d u.c nd o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3-6 1 8 4.2 0 2 3.0 1.0 0 3论著伤寒沙门菌型分泌系统对S o p E表达影响的初步研究石书娟,刘秀雯,翁轶玮,党娟娟,李泽宇,张盈,黄新祥江苏大学医学院,江苏 镇江 2 1 2 0 1 3摘 要:为探索伤寒沙门菌型分泌系统(ty pe 6 s e c r e t i o n sys t e m,T 6 S S)对S opE表达的影响,阐明其中的分子机制,本研究利用自杀质粒同源重组法构建携带s o p E3F l ag的伤寒沙门菌野生株(WT-pB A D 3 3)、T 6 S S功能分子缺陷株(s c i G-pB A D 3 3)和回补株(C-s c i G),用构建成功的菌株感染巨噬细胞T H P-1并在模拟巨噬细胞内环境(L P M培养基、微需氧)下培养,通过实时荧光定量聚合酶链反应(r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e qu a n t i t a t i v e po lym e r a s e c h a i n r e a c t i o n,qR T-P C R)与蛋白质印迹法(W e s t e r n b l o t,WB)试验探索T 6 S S对S opE表达的影响,采用-半乳糖苷酶活性检测来进一步验证s o p E基因启动子的转录水平,N i柱纯化T 6 S S功能蛋白S c i G,电泳迁移率变动分析(e l e c t r oph o r e t i c m o b i l i ty s h i f t a s s ay,E M S A)研究S c i G蛋白对s o p E基因启动子的调控作用。结果显示:s c i G-pB A D 3 3中S opE表达水平较于WT-pB A D 3 3明显降低;S c i G蛋白不能直接与s o p E基因启动子区域结合。本研究结果表明,伤寒沙门菌T 6 S S影响了S opE的表达,但是其功能蛋白S c i G不能直接调控s o p E基因的表达。关键词:伤寒沙门菌;型分泌系统;S opE;巨噬细胞中图分类号:R 3 7 8.2+2 文献标识码:AP r e l i m i n a r y s t u d y o n t h e e f f e c t o f S a l m o n e l l a t y p h i t y p e s e c r e t i o n s y s t e m o n t h e e x p r e s s i o n o f S o p ES H I S h uju a n,L I U X i u w e n,WE N G Y i w e i,D A N G J u a nju a n,L I Z eyu,Z HA N G Y i ng,HUA N G X i n x i a ngS c h o o l o f M e d i c i n e,J i a n g s u U n i v e r s i t y,Z h e n j i a n g 2 1 2 0 1 3,J i a n g s u P r o v i n c e,C h i n aA b s t r a c t:I n o r d e r t o e xpl o r e t h e e f f e c t o f S a l m o n e l l a ty ph i ty pe 6 s e c r e t i o n sys t e m(T 6 S S)o n S opE e xpr e s s i o n a n d c l a r i fy t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m,t h e w i l d S a l m o n e l l a ty ph i s t r a i n(WT-pB A D 3 3),T 6 S S f u n c t i o n a l m o l e c u l e-d e f i c i e n t s t r a i n(s c i G-pB A D 3 3)a n d c o mpl e m e n t i ng s t r a i n(C-s c i G)c a r ryi ng s o p E3F l ag w e r e c o n s t r u c t e d by s u i c i d e pl a s m i d h o m o l ogo u s r e c o m b i n a t i o n m e t h o d.T h e s t r a i n s w e r e c o n s t r u c t e d t o i n f e c t m a c r oph age T H P-1 a n d c u l t u r e d i n s i m u l a t e d m a c r oph age e n v i r o n m e n t(L P M m e d i u m,m i c r o a e r o b i c).T h e e f f e c t o f T 6 S S o n t h e e xpr e s s i o n o f S opE w a s i n v e s t iga t e d by r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e qu a n t i t a t i v e po lym e r a s e c h a i n r e a c t i o n(qR T-P C R)a n d W e s t e r n b l o t e xpe r i m e n t s.T h e-ga l a c t o s i d a s e a c t i v i ty t e s t f u r t h e r v e r i f i e d t h e t r a n s c r ipt i o n l e v e l o f s o p E ge n e pr o m o t e r,a n d t h e T 6 S S f u n c t i o n a l pr o t e i n S c i G w a s pu r i f i e d by N i c o l u m n.T h e r egu l a t i o n e f f e c t o f S c i G pr o t e i n o n t h e s o p E ge n e pr o m o t e r w a s 12微生物与感染 J o u r n a l of M i c r o b e s a n d I nfe c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):2 1-2 8 h t tp:jm i.f u d a n.e d u.c na n a lyz e d by e l e c t r oph o r e t i c m o b i l i ty s h i f t a s s ay(E M S A).T h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e xpr e s s i o n l e v e l o f S opE i n s c i G-pB A D 3 3 w a s s ign i f i c a n t ly l o w e r t h a n t h a t i n WT-pB A D 3 3;S c i G pr o t e i n c o u l d n o t d i r e c t ly b i n d t o t h e s o p E ge n e pr o m o t e r r egi o n.I t w a s c o n c l u d e d t h a t S a l m o n e l l a ty ph i T 6 S S a f f e c t s t h e e xpr e s s i o n o f S opE,b u t i t s f u n c t i o n a l pr o t e i n S c i G c a n n o t d i r e c t ly r egu l a t e t h e e xpr e s s i o n o f s o p E ge n e.K e y w o r d s:S a l m o n e l l a Ty ph i;Ty pe 6 s e c r e t i o n sys t e m;S opE;M a c r oph age s 伤 寒 沙 门 菌(S a l m o n e l l a e n t e r i c a s e r o v a r Ty ph i,S.Ty ph i)是一种革兰氏阴性、杆状、有鞭毛的细菌,属于肠道沙门菌D群,人类是其感染的唯一宿主1。S.Ty ph i通常通过摄入污染的食物或水而感染机体2,细菌进入机体后在胃中存活,侵入小肠的黏膜下层,而后被免疫细胞吞噬,在细胞中存活与复制,通过淋巴系统和血液传播,从而引起持续性感染。在卫生条件差的低收入地区,尤其是发展中国家,伤寒仍然是严重的公共卫生问题3。分泌系统是细菌将蛋白质和毒素输送到环境或直接进入宿主细胞的有效分子转运工具,革兰氏阴性菌通常通过型分泌系统(ty pe 3 s e c r e t i o n sys t e m,T 3 S S)将毒力因子注射到真核细胞而引起感染4。沙门菌致病岛1(S a l m o n e l l a pa t h oge n i c i ty i s l a n d 1,S P I-1)和沙门菌致病岛2(S a l m o n e l l a pa t h oge n i c i ty i s l a n d 2,S P I-2)分别编码2种类型的T 3 S S:T 3 S S-1和T 3 S S-2。T 3 S S是一个高度保守的蛋白复合体,主要由基座复合体、针状结构和针尖复合体组成5,其分泌的效应蛋白在沙门菌感染的各个阶段发挥了重要作用。S opE是T 3 S S-1分泌的重要毒力因子。s opE基因位于S P-1外6,其编码的S opE是鸟嘌呤核苷酸交换因子(gu a n i n e n u c l e o t i d e e x c h a nge f a c t o r,G E F),通过以下方式参与到沙门菌感染人体的过程中。S opE通过T 3 S S-1进入非吞噬细胞,激活 R a c 1 和C d c 4 2,从而导致F-肌动蛋白聚合,诱导膜褶皱,引导细菌侵入非吞噬细胞7-8。沙门菌被宿主细胞吞噬后,S opE通过募集和激活 G T P a s e R a b 5 来 促 进 含 沙 门 菌 的 液 泡(S a l m o n e l l a-c o n t a i n i ng v a c u o l e,S C V)和早期内体之间的融合,从而影响细菌在宿主细胞内的存活9。在鼠伤寒沙门菌(S a l m o n e l l a e n t e r i c a s e r o v a r Ty ph i m u r i u m,S.Ty ph i m u r i u m)侵入宿主细胞后,S opE持续性分泌并短暂定位于早期S C V,影响早期S C V的稳定性,从而有利于细菌在巨噬细胞内的生存与增殖1 0。S.Ty ph i m u r i u m 通过T 3 S S-1效应蛋白 S opE、S opE 2 和 S opB刺激 R h o G T P 酶来激活 MA P 激酶和 N F-B 信号通路,未涉及先天免疫系统受体,从而引发肠道炎症1 1。S opE 还通过激活C d c 4 2 和 R a c 1 诱导c a spa s e-1 活化,引发肠黏膜炎症1 2。S.Ty ph i m u r i u m 的S opE 和 S opE 2通过刺激 R h o G T P 酶和调节肌动蛋白细胞骨架来破坏紧密连接结构,从而破坏肠道屏障,引发腹泻1 3。型分泌系统(ty pe 6 s e c r e t i o n sys t e m,T 6 S S)是一个类似于T 4噬菌体的细菌表面跨膜结构,由1 3种核心结构蛋白组成1 4。T 6 S S结构与T 3 S S相似,包括:基座复合物、跨膜复合物、由溶血素共调节蛋白(H cp)内管与T s s B C鞘组成的管状结构、管状结构顶端的Vgr G-P A A R复合物等。T 6 S S被激活时,H cp蛋白与T s s B、T s s C鞘被招募到基座复合物形成管状结构,在A T P酶C lpV提供的能量下T s s B C鞘收缩,将携带效应蛋白的Vgr G-P A A R复合体推向靶细胞等,完成效应蛋白的分泌1 5。S.Ty ph i T 6 S S由沙门菌致病岛6(S a l m o n e l l a pa t h oge n i c i ty i s l a n d 6,S P I-6)编码完整的基因簇,其中s c i G基因编码C lpV(A T P a s e A A A+家族成员)的同源物,s c i K编码H cp(T 6 S S结构蛋白与分泌蛋白)的同源物,但有研究认为S.Ty ph i S P I-6中的s c i I为假基因,因s c i I编码的T 6 S S结构成分S c i I(V ipB同源物)为一个假定蛋白,导致T 6 S S无分泌功能1 6。前期研究发现,S.Ty ph i可以编码功能性的T 6 S S,T 6 S S基因缺陷可使T 6 S S分泌功能缺失1 7。近年来有研究发现,T 6 S S功能分子s c i G缺陷使细菌在巨噬细胞中的生存能力下降,说明S.Ty ph i 的T 6 S S有利于细菌在巨噬细胞内的生存与增殖1 8。本研究组通过蛋白组学分析技术进一步探究了S.Ty ph i在巨噬细胞内利用T 6 S S发挥毒力作用的机制,发现 s c i G菌株的分泌蛋白中T 3 S S-1效应蛋白S opE的水平明显下降。基于蛋白组学分析结果,以及沙门菌能够利用S opE增加S C V的稳定性从而有利于细菌在巨噬细胞中存活这一特性,本文推测:S.Ty ph i的T 6 S S可能与T 3 S S-1有交叉作用,并通过T 6 S S促进T 3 S S-1的效应蛋白S opE表22微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):2 1-2 8达或分泌。本研究通过初步探索S.Ty ph i T 6 S S与T 3 S S-1效应蛋白S opE的关系,为研究S.Ty ph i引起的严重全身系统性感染的致病机制提供新思路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒和细胞株 人髓系白血病单核细胞T H P-1购自中国科学院细胞库;S.Ty ph i 野生株 G I F U 1 0 0 0 7(WT)为日本岐阜大学医学院微生物 学 教 研 室 馈 赠;pGM B 1 5 1、P e t 2 8 a(+)、pHR P 3 0 9载体,以及E.c o l i 3 7 2与DH 5 由本实验室保存;S.Ty ph i 携带s opE3F l ag的 WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3与C-s c i G菌株,以及s c i G-P e t 2 8 a-B L 2 1重 组 蛋 白 表 达 菌、pHR P 3 0 9-s opE由本研究制备。1.1.2 主要试剂 R P M I-1 6 4 0、胎牛血清(f e t a l c a l f s e r u m,F B S)、胰酶均购自美国G i b c o公司;佛波 醇 乙 酯(ph o r b o l-1 2-myr i s t a t e-1 3-a c e t a t e,P MA)、T r i z o l试剂购自美国S igm a公司;逆转录试剂盒、S Y B R荧光定量试剂盒、快速D N A消化试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司;电泳迁移率变动 分 析(e l e c t r oph o r e t i c m o b i l i ty s h i f t a s s ay,EM S A)结合缓冲液、上样缓冲液以及-半乳糖苷酶活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。A n t i-F L A G t ag r a b b i t po lyc l o n a l a n t i b o dy购自上海生工生物工程有限公司;D n a k(E.c o l i)mA b购自美国E n z o公司。1.1.3 主要仪器 全自动凝胶成像系统购自上海勤翔科学仪器有限仪器公司;荧光定量P C R仪购自美国B i o-R a d公司;二氧化碳细胞培养箱购自美国T h e r m o公司;超净工作台为上海博讯公司产品;pH计购自德国S a r t o r i u s公司;超灵敏化学发光凝胶成像系统购自美国G E公司;台式冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1.1.4 引物 基因特异性引物委托苏州泓讯生物科技有限公司合成,具体序列如表1所示。表1 特异性引物名称及相应序列T a b.1 N a m e s a n d c o r r e s p o n d i n g s e q u e n c e s o f s p e c i f i c p r i m e r s引物名称引物序列(5 -3)用途P-s o p E-AA G T G G A T C C C T A T C G G C A G T T T A C A G C A菌株构建P-s o p E-BT C A C T T G T C A T C G T C A T C C T T G T A G T C G A T G T C A T G A-T C T T T A T A A T C A C C G T C A T G G T C T T T G T A G T C G G G A G-T G T A T T G T A T A T A T T菌株构建P-s o p E-CA G G A T G A C G A T G A C A A G T G A A C A C A G A A A A A C C A A-A A A A T A T G C G G A G C C菌株构建P-s o p E-DA G C G G A T C C A C G G A A A A T A T A T C G A G C A C A菌株构建R T-s o p E-FC A G C G A A A A A T G C A G G T C T GqR T-P C RR T-s o p E-RG G A T G C C T G C T G A T G T T G A TqR T-P C RR T-1 6 S-FA A A C G G T G G C T A A T A C C G C AqR T-P C RR T-1 6 S-RG A G C C G T T A C C T C A C C A A C AqR T-P C Rs o p E-F(S a l I)A T A G T C G A C G C T G G T A C A A T A T C G C C A CL a c Z/E M S As o p E-R(E c oR I)G C C G A A T T C C T G C G A G A A T A C T T T T T G C TL a c Z/E M S A1 6 S D N A-FA T C G T C G A C A C A T C C C A G G T T C G T C A C A GL a c Z/E M S A1 6 S D N A-RA T C G A A T T C G G A A A C T C A C A G C C G T T C A GL a c Z/E M S A注:下划线表示酶切位点。1.2 方法1.2.1 菌 株 构 建 本 研 究 采 用 自 杀 质 粒pGM B 1 5 1介导的同源重组法构建3F l ag融合菌株,以S.Ty ph i野生株基因组D N A为模板,特异性引物P C R扩增s opE的上、下游同源片段F 1、F 2和总同源片段F。反应体系如表2所示,P C R扩增参数为9 4 预变性5 m i n,9 4 变性3 0 s、5 5 退火3 0 s、7 2 延伸3 0 s,共3 0个循环,最后7 2 延伸1 0 m i n。各取3 L P C R产物进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定扩增情况。F片段与pGM B 1 5 1质粒酶32石书娟,等:伤寒沙门菌型分泌系统对S opE表达影响的初步研究切后酶连,热击到E.c o l i 3 7 2感受态细胞中,筛选阳性质粒送测序,序列比对完全正确后再电击到WT与s c i G感受态细胞中,筛选同时含有短片段与长片段的单克隆菌落,使用同源重组的方法在5%蔗糖板上筛选直至只有长片段,稳定传3代后,再在普通L B平板上稳定传3代,经P C R鉴定只有长片段,即携带s opE 3 F l ag的 WT与s c i G菌株构建成功。将s c i G-pB A D 3 3质粒电击到携带s opE 3F l ag的s c i G感受态细胞中,制备相应的回补株。将pB A D 3 3质粒电击到携带s opE3 F l ag的WT与s c i G感受态细胞中,制备相应的对照株。经P C R鉴定确认,携带s opE 3 F l ag的WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3与C-s c i G菌株构建成功。表2 高保真P C R反应体系T a b.2 H i g h-f i d e l i t y P C R r e a c t i o n s y s t e m成分体积(L)d d H2O7.22 P h a n t a m a x b u f f e r1 0引物P-s o p E-A/B或P-s o p E-C/D0.8/0.8d N T P M i x0.4P h a n t a S upe r-F i d e l i ty D N A P o lym e r a s e0.4模板D N A0.4总体积2 01.2.2 S.T y p h i感染巨噬细胞 使用含1 0%F B S的R P M I 1 6 4 0培养液,将T H P-1细胞置于3 7、体积分数5%C O2的培养箱中培养。细胞培养板中每孔接种5 1 05个细胞,加入1 5 0 ng/m L P MA诱导T H P-1细胞分化4 8 h,诱导率为7 0%。携带s opE3F l ag的WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3接种于2 m L L B液体培养基中,3 7、2 5 0 r/m i n培养过夜;次日按1 1 0 0转接到2 0 m L L B液体培养基中,培养细菌至对数期(O D6 0 0 n m=0.4)。将细菌离心分离后弃上清液,用R P M I-1 6 4 0培养液悬浮菌体,将细菌浓度调至O D6 0 0 n m约为0.4。实验前1 h给细胞更换新鲜的R P M I-1 6 4 0培养液。将上述细菌按MO I=3 01加入T H P-1细胞培养板中培养1 h。每孔加入1 0 0 g/m L庆大霉素后继续培养1 h杀死胞外菌。弃掉一半培养液,加入新鲜的R P M I 1 6 4 0培养液,以此时间点为起始时间点,继续培养1 2 h,弃掉所有培养液,加入1 m L T r i z o l或R I P A裂解液,待用。实验进行3次生物学重复。1.2.3 巨噬细胞内环境下的S.T y p h i模拟培养 将携带s opE3F l ag的WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3和C-s c i G接种于2 m L L B液体培养基中,3 7、2 5 0 r/m i n培养过夜;次日将细菌置于2 5,以 4 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,用新鲜L P M洗2次后按1 5 0转接到2 0 m L新鲜L P M液体培养基中,加入终质量分数为0.2%的L-阿拉伯糖,在微需氧环境(微需氧袋培养:O2体积分数为6%1 2%,C O2体积分数为5%8%)中培养1 2 h后,将细菌置于4,以4 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n,弃掉L P M培养液,用1 m L T r i z o l或用1磷酸缓冲盐溶液(ph o sph a t e b u f f e r e d s a l i n e,P B S)洗涤2次后重悬,待用。实验进行3次生物学重复。1.2.4 R N A提取和检测 充分混匀上述 1 m L T r i z o l重悬的样本,用T r i z o l法提取总R N A,取1 g总R N A,消化基因组D N A后用逆转录试剂盒将其逆转录为c D N A。以1 6 S r R N A为内参基因,使用s opE特异性引物进行qR T-P C R,采用相对定量法分析目的基因mR N A表达水平。每组设平行样,实验进行3次生物学重复。1.2.5 蛋白提取和检测 在上述蛋白样本中加入5蛋白l o a d i ng b u f f e r并充分混匀,9 0 煮1 0 m i n,冰上放置5 m i n,离心(1 3 5 0 0 r/m i n,1 0 m i n,4),取上清液为点样样本。配制体积分数为1 0%的聚丙烯酰胺凝胶,上样后进行电泳。电泳结束后转膜,再用体积分数为5%的脱脂奶粉室温振荡封闭1 h,用A n t i-F L A G t ag r a b b i t po lyc l o n a l a n t i b o dy、D n a k(E.c o l i)mA b在4 下孵育过夜,次日将P V D F膜用1T B S T在摇床上振荡洗涤3次,然后于室温下用羊抗兔IgG-HR P和羊抗鼠IgG-HR P分别振荡孵育1 h,用1T B S T洗涤3次。最 后 用 增 强 型 化 学 发 光 试 剂(e n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e,E C L)在超灵敏化学发光凝胶成像系统上进行曝光及拍照。1.2.6 -半乳糖苷酶活性检测 将携带有L a c Z重组质粒的WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3和C-s c i G接种于2 m L L B液体培养基中,3 7、2 5 0 r/m i n培养过夜;次日以 4 0 0 0 r/m i n、2 5 离心1 0 m i n,用新鲜L P M洗2次后按15 0转接到2 0 m L新鲜L P M液体培养基中,加入终质量分数为0.2%的 L-阿拉伯糖,在微需氧环境(微需氧袋培养:O2体积分数为6%1 2%,C O2体积分数为5%8%)中培养1 2 h后离心弃上清液,用预冷的P B S洗涤2次后重悬。取一部分重悬液加入甲醛溶42微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,F e b r u a ry 2 5,2 0 2 3,1 8(1):2 1-2 8液后,测定其O D6 0 0 n m值,剩余进行超声仪破菌后离心,将上清液分别加入到-半乳糖苷酶活性检测酶联板孔中,每组设有3个平行样,然后加入3 0 L检测液混匀,3 7 静置至溶液完全变黄,记录反应时间,加入反应终止液混匀,利用酶标仪检测混合液的O D4 1 5 n m值和O D5 9 5 n m值。实验进行3次生物学重复。采用M i l l e r U n i t s的数值来表示-半乳糖苷酶活性(Ae),计算公式如下:Ae=1 06Rd(O D4 1 5 n m-O D5 9 5 n m)1.7 5/(VTO D6 0 0 n m),式中Rd表示稀释倍数,V表示体积(L),T表示作用时间(m i n)。1.2.7 S c i G蛋白的表达和纯化 接种s c i G-pE T 2 8 a-B L 2 1重组蛋白表达菌至液体L B培养基中培 养 至 对 数 期(O D6 0 0 n m约 为0.6),加 入0.2 mm o l/L 异 丙 基 硫 代-D-半 乳 糖 苷(i s opr op yl t h i o-D-ga l a c t o s i d e,I P T G),3 0,1 8 0 r/m i n诱导6 h。收集菌体后超声波破碎,离心收集上清液,用0.4 5 m的滤嘴过滤掉杂质后用N i柱纯化,然 后 于 透 析 袋 中 冰 上 透 析4 h后,用P E G 2 0 0 0吸去透析袋中部分水分以浓缩蛋白,检测浓度后使用S D S-P A G E分析其纯度,置于-8 0 保存。1.2.8 E M S A检测S c i蛋白与s o p E基因相互作用 以S.Ty ph i野生株基因组D N A为模板,P C R特异性扩增s c i G基因起始密码子上游约5 0 0 bp的启动子区域序列并纯化,1 6 S D N A作为阴性对照。已纯化的H i s-S c i G蛋白溶液加入含2 0 mm o l/L新鲜乙酰磷酸盐的结合缓冲液,室温孵育1 0 m i n使S c i G磷酸化,结合体系配制完成后,分别加入1 0 0 ng各基因启动子区D N A片段,于3 0 温育3 0 m i n后使用体积分数为6%的非变形聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,溴化乙啶染色后于凝胶成像仪下显影并分析结果。1.3 统计学分析利用G r aph P a d P r i s m 8.0统计软件分析数据,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间均数比较采用t检验。P0.0 5表示差异有统计学意义。2 结果分析2.1 菌株构建为了检测S opE蛋白的表达量,本文构建了携带s opE 3 F l ag的WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3与C-s c i G菌株。首先,由P C R扩增s opE基因上、下游片段F 1、F 2,电泳结果如图1 A所示,以F 1、F 2片段为模板,P C R扩增,将F 1、F 2片段连接成F片段,结果如图1 B所示。F片段与pGM B 1 5 1质粒酶切后酶连,热击到E.c o l i 3 7 2感受态细胞中,P C R扩增筛选阳性重组质粒,电泳结果如图1 C所示。阳性重组质粒送测序,序列比对完全正确后电击到WT与s c i G感受态细胞中,筛选同时含有短片段与长片段的单克隆,在5%蔗糖板上稳定传3代后,再在普通L B平板上稳定传3代,经P C R鉴定发现只有长片段,即携带s opE3 F l ag的 WT与s c i G菌株构建成功,电泳结果如图1 D所示。将pB A D 3 3空载体电击到携带s opE 3F l ag的 WT与s c i G菌株中,经P C R鉴定后筛选阳性菌株,电泳结果如图1 E所示。将s c i G-pB A D 3 3载体电击到携带s opE3F l ag的s c i G菌株中,由P C R鉴定筛选阳性菌株,电泳结果如图1 F所示。A:泳道1、2分别为F 1片段、F 2片段;B:泳道1为F片段;C:泳道1、3为阳性重组质粒;D:泳道1、2为WT,泳道3、4为s c i G,泳道5为阳性对照,泳道6为以野生株D N A为模板扩增的阴性对照;E:泳道1、2为WT,泳道3、4为s c i G;F:泳道1、3为单克隆菌落P C R产物。图1 菌株构建结果F i g.1 R e s u l t s o f s t r a i n c o n s t r u c t i o n52石书娟,等:伤寒沙门菌型分泌系统对S opE表达影响的初步研究2.2 巨噬细胞中T 6 S S对S o p E表达的影响为了研究在巨噬细胞中T 6 S S对T 3 S S-1效应蛋白S opE表达的影响,本研究使用WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3感染巨噬细胞,提取R N A进行qR T-P C R检测s opE mR N A水平,提取蛋白使用WB检测S opE蛋白表达水平,结果显示:s c i G-pB A D 3 3的S opE表达水平在巨噬细胞中低于WT-pB A D 3 3(见图2),说明在巨噬细胞中,T 6 S S的缺失抑制了S opE的表达。*:P 0.0 1。图2 q R T-P C R与W e s t e r n b l o t检测巨噬细胞中S o p E的表达水平F i g.2 T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f S o p E i n m a c r o p h a g e s d e t e c t e d b y q R T-P C R a n d W e s t e r n b l o t2.3 巨噬细胞内T 6 S S对S o p E表达的影响在模拟巨噬细胞内环境下培养WT-pB A D 3 3、s c i G-pB A D 3 3和C-s c i G菌 株,并 进 行qR T-P C R、W B与-半乳糖苷酶活性检测实验,结果显示:在模拟巨噬细胞内环境中,s c i G-pB A D 3 3的S opE表达水平较于WT-pB A D 3 3显著降低,C-s c i G的S opE表达水平较于s c i G-pB A D 3 3部分恢复(见图3 A、3 B),s c i G-pB A D 3 3的s opE基因启动子的mR N A表达水平较于WT-pB A D 3 3与C-s c i G显著下降(P0.0 1)(见图3 C)。说明在模拟巨噬细胞内环境中,T 6 S S的缺失使S opE的表达受到抑制,与在巨噬细胞中的结果一致。*:P 0.0 0 0 1,*:P 0.0 0 1。图3 q R T-P C R、W e s t e r n b l o t与l a c Z融合实验检测模拟巨噬细胞内环境中S o p E的表达水平F i g.3 T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f S o p E i n s i m u l a t e d m a c r o p h a g e s e n v i r o n m e n t d e t e c t e d b y q R T-P C R,W B a n d l a c Z f u s i o n e x p e r i m e n t2.4 S c i G蛋白的表达与纯化为了获得S c i G蛋白,使用s c i G-pE T 2 8 a-B L 2 1重组蛋白表达菌株表达蛋白。用0.2 mm o l/L I P T G诱导后,H i s-S c i G蛋白的表达量较未诱导明显增加,并且存在于上清液中,说明H i s-S c i G是可溶性蛋白;经N