铁调素对人胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响.pdf

老年医学研究2023 年第 4 卷第 4 期铁调素对人胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响师萍1，姜曼21 山东第一医科大学附属省立医院内分泌科，山东济南 250021；2 山东第一医科大学附属省立医院老年医学科，山东济南 250021摘要：目的探讨铁调素（Hepcidin）对人胰腺癌细胞株PANC-1增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并探讨可能的机制。方法将PANC-1细胞分为对照组、低剂量组和高剂量组，对照组不做处理，低剂量组和高剂量组分别加入400、800 nmol/L Hepcidin处理。采用CCK-8检测细胞增殖能力，采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力，采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，采用流式细胞术测算细胞凋亡率，采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁含量。结果与对照组相比，低剂量组和高剂量组细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力低，细胞凋亡率高（P均0.05）。与对照组相比，低剂量组和高剂量组细胞胞质中可见大量蓝染铁颗粒。结论Hepcidin可以抑制人胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡，其机制可能与其可增加细胞内的铁含量有关。关键词：胰腺癌；铁调素；细胞增殖；细胞迁移；细胞侵袭；细胞凋亡；铁含量doi：10.3969/j.issn.2096-9058.2023.04.003 中图分类号：R576 文献标志码：A 文章编号：2096-9058（2023）04-0012-04Effects of Hepcidin on proliferation，migration，invasion and apoptosis of pancreatic cancer cellSHI Ping，JIANG Man1 Department of Endocrinology，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University，Jinan 250021，China；2 Department of Gerontology，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University，Jinan 250021，ChinaCorresponding Author：JIANG Man（E-mail：）Abstract：Objective To investigate the effects of Hepcidin on proliferation，migration，invasion and apoptosis of pancreatic cancer cell，and explore the possible mechanisms.Methods PANC-1 cells were divided into control group，low-dose group and high-dose group.The control group was not treated，and the low-dose group and high-dose group were treated with 400 and 800 nmol/L Hepcidin，respectively.Cell proliferation ability was detected by CCK-8，cell migration ability was detected by scratch assay，cell migration and invasion ability was detected by Transwell，cell apoptosis rate was detected by flow cytometry，and intracellular iron content was observed by Prussian blue staining.Results Compared with the control group，the proliferation，migration and invasion of cells were lower in the low-dose and high-dose groups，and the apoptosis rate was higher（all P 0.05）.Compared with the control group，a large number of blue-dyed iron particles could be seen in the cytoplasm of cells in the low-dose and high-dose groups.Conclusions Hepcidin can inhibit the proliferation，migration and invasion of human pancreatic cancer cells and promote cell apoptosis.The mechanism may be related to increasing iron content in cells.Key words：pancreatic cancer；Hepcidin；cell proliferation；cell migration；cell invasion；cell apoptosis；iron content胰腺癌是主要发生于胰腺外分泌腺的一种消化系统肿瘤，其5年生存率仅为8%，中位生存时间不超过1年，恶性程度高且预后极差1。胰腺癌的发病机制尚不明确，有研究表明，胰腺癌的发生和发展可能与铁代谢的紊乱有关2。铁调素（Hepcidin）是一种肽类激素，是人体内调节铁代谢的主要因子之一，基础研究 通信作者：姜曼（E-mail：）12老年医学研究2023 年第 4 卷第 4 期同时也与许多肿瘤的发生和发展有密切关系，高表达对乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的生长有抑制作用2-6。目前 Hepcidin 在胰腺癌中的作用相关研究较少，因此本研究观察了Hepcidin对人胰腺癌细胞株 PANC-1 细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并进一步探讨其机制，为胰腺癌的治疗提供新的思路。1 材料与方法 1.1试剂及仪器胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶及DMEM培养液购自美国HyClone公司；Hepcidin购自美国abcam公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；普鲁士蓝染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning Costar 公司；Matrigel基质胶、凋亡试剂盒购自美国BD公司。1.2细胞来源、培养及分组人胰腺癌细胞株PANC-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。PANC-1用含有100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素及10%胎牛血清的DMEM培养基，于37、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每23天更换培养基，取第 3 代对数生长期的细胞用于实验。将PANC-1细胞分为对照组、低剂量组和高剂量组，对照组不做处理，低剂量组和高剂量组分别加入400、800 nmol/L Hepcidin。1.3细胞增殖检测采用CCK-8实验。取上述三组对数生长期细胞，胰酶消化，离心重悬，按照5103个/孔细胞密度接种于96孔板中，每组设6个复孔，于培养箱中培养24 h。弃上清，冲洗后每孔重新加入等量培养基，向培养基中加入10 L的CCK-8溶液，培养箱中孵育2 h，使用酶标仪于450 nm处测定OD值，以OD值代表细胞增殖能力。测量3次，取平均值。1.4细胞迁移能力检测采用细胞划痕实验。取上述三组对数生长期的细胞，按照1106个/孔细胞密度接种于 6 孔板中，待其长满约 90%，去除培养基，在无菌条件下用20 L移液器枪头在6孔板中均匀划出3条直线，冲洗干净残余细胞，于显微镜下拍照。加入无血清培养基继续培养，分别于12、24 h置于显微镜下拍照，测量划痕间距，取平均值。1.5细胞迁移及侵袭能力检测采用Transwell实验。细胞分组处理24 h后，胰酶消化，用无血清的培养基制成单细胞悬液，按照1105个/孔细胞密度将细胞加入包被基质胶的小室内，检测其侵袭能力，或加入未包被基质胶的小室内，检测其迁移能力。下室加入含10%胎牛血清的培养基，放入培养箱过夜培养。去除培养基并冲洗，4%多聚甲醛固定20 min，用棉签轻轻擦去上室内细胞，留取底部细胞，0.1%结晶紫染色5 min，冲洗后干燥封片，于显微镜下拍照。每张照片随机选取3个视野拍照，计算穿孔细胞数，取平均值。1.6细胞凋亡检测采用流式细胞术。取上述三组对数生长期细胞，接种于 6孔板，细胞密度为 1106个/孔，各组处理 24 h，再向细胞悬液中加入Annexin 和 PI 染 液 各 5 L，室 温 下 避 光 反 应15 min，用流式细胞仪检测，计算凋亡细胞比例。1.7细胞内铁含量检测采用普鲁士蓝染色。取上述三组对数生长期细胞，胰酶消化重悬后，按照1106个/孔细胞密度接种在 3.5 cm 玻璃底培养皿中，放入培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后，弃上清，冲洗，用 4%多聚甲醛固定 1020 min，再次冲洗后加入普鲁士蓝染液 37 孵育 30 min，蒸馏水充分冲洗后，普鲁士蓝复染液复染1 min，自来水冲洗后于显微镜下拍照，观察各组细胞中蓝染铁颗粒的数量。1.8统计学方法采用SPSS25.0统计软件。计量资料采用 Shapiro-Wilk（S-W）方法进行正态分布检验，符合正态分布数据用-xs表示，3组间比较使用单因素方差分析，两两组内比较采用 LSD 法。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1Hepcidin 对 PANC-1 细胞增殖的影响对照组、低剂量组和高剂量组细胞增殖能力分别为0.790.06、0.690.05、0.600.05，低剂量组、高剂量组与对照组比较P均0.01。2.2Hepcidin 对 PANC-1 细胞迁移及侵袭能力的影响2.2.1划痕实验见表1。2.2.2Transwell实验Transwell迁移实验中，对照组、低 剂 量 组 和 高 剂 量 组 穿 膜 细 胞 数 分 别 为（177.338.02）、（110.677.57）、（81.337.09）个，低剂量组、高剂量组与对照组比较 P 均0.05。表1各组细胞迁移能力比较（-xs）组别对照组低剂量组高剂量组F值P值划痕距离（m）0 h286.955.58290.104.66289.154.293.340.0712 h54.273.30108.833.36*147.879.77*12.50 0.0224 h16.651.8748.044.29#84.253.07#1 284.62 0.01注：与对照组相比，*P0.05、#P0.01。13老年医学研究2023 年第 4 卷第 4 期Transwell侵袭实验中，对照组、低剂量组和高剂量组穿 膜 细 胞 数 分 别 为（143.337.77）、（114.678.96）、（83.677.02）个，低剂量组、高剂量组与对照组比较P均0.05。2.3Hepcdin对PANC-1细胞凋亡的影响对照组、低剂量组和高剂量组细胞凋亡率分别为 3.80%0.09%、5.62%0.08%、8.37%0.49%，低剂量组、高剂量组与对照组比较P均0.01。2.4Hepcidin对PANC-1细胞内铁含量的影响镜下可见，对照组PANC-1细胞呈多边形，细胞核呈亮红色、圆形，胞质呈红色。低剂量组和高剂量组胞质中可见大量蓝染铁颗粒，成团环绕在细胞核周围或聚集在细胞核的一侧。与对照组相比，高剂量组胞质中蓝染铁颗粒数增加（图1）。3 讨论 铁是一种重要的微量元素，广泛参与人体内各组织的生长代谢过程。铁在人体内的吸收、利用和代谢是一个复杂的过程，需要多种铁调节因子的参与，其中 Hepcidin 是调节铁代谢的关键因子3。Hepcidin主要由肝细胞合成和分泌，是一种小分子多肽类的激素，主要作用是减少十二指肠黏膜上皮细胞对铁的吸收和转运，抑制巨噬细胞释放再生铁，抑制肝细胞释放储存铁，导致外周血的铁含量降低、巨噬细胞等储铁细胞内铁含量增加3-4。Hepcidin的受体是存在于细胞膜上的转铁蛋白（FPN），生理状态下，Hepcidin可通过与FPN结合，引起后者发生内吞作用和蛋白质水解，从而减少铁从细胞内释放到血浆和细胞外液5。近年来研究表明，Hepcidin与肿瘤的发生和发展关系密切4。Hepcidin在前列腺癌、原发性肝癌、肾癌及乳腺癌患者血清中均存在高表达6-9。一项大规模多中心研究表明，血清Hepcidin水平与罹患胃癌的风险呈显著负相关10。因此Hepcidin被认为是一种颇具潜力的新兴的肿瘤标志物。与肝细胞相比，大部分肿瘤细胞不能自分泌或只能分泌微量的 Hepcidin，因此 Hepcidin对肿瘤的影响仍主要取决于循环血液和细胞外液中Hepcidin的水平。但在肿瘤微环境中，Hepcidin通过何种机制影响肿瘤的发生和发展进程，迄今相关研究仍较少。有研究表明，肝癌、肾癌组织中Hepcidin的表达较正常组织降低，而在结肠癌部分病理标本中检测出Hepcidin的阳性表达，但在周围正常组织中，Hepcidin的表达呈阴性11。这说明在不同种类的肿瘤组织中，Hepcidin的表达具有极大的差异性。与其他消化系统肿瘤相比，胰腺癌与Hepcidin的相关研究仍较少。目前已经证实，胰腺可自分泌Hepcidin，其来源是胰岛细胞12-13。胰腺癌组织中Hepcidin高表达，且与胰腺癌的分期有关14。敲除小鼠的Hepcidin基因可导致胰腺外分泌腺体的铁超载15。近期一项大规模全基因组的流行病学分析结果显示，与Hepcidin调节基因通路相关的遗传易感性与胰腺癌风险有关，并提示铁代谢在胰腺癌发生中具有潜在作用16。本研究使用的PANC-1细胞是注：图中比例尺长度为50 m。图1各组PANC-1细胞内铁含量（普鲁士蓝染色）14老年医学研究2023 年第 4 卷第 4 期一种高转移性的人胰腺癌细胞株，在裸鼠动物实验中对肝脏、肺和腹腔都有较高的成瘤率，是研究胰腺癌常用的细胞株17。既往研究已证明，PANC-1细胞可以表达 FPN，用铁死亡诱导剂 Erstin可使细胞内FPN的mRNA表达降低18-20。本研究用不同浓度的Hepcidin处理PANC-1细胞，发现高剂量Hepcidin可使胞质内铁染色颗粒明显增加，表明Hepcidin可增加PANC-1细胞内的铁含量。这与Hepcidin对细胞内铁的生理调控作用是相一致的。本研究进一步检测了Hepcidin对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用，结果显示低剂量、高剂量组PANC-1细胞的增殖率和侵袭性明显降低，细胞凋亡率增加，表明Hepcidin对PANC-1细胞有抑制作用。这种细胞内高铁引起的对肿瘤细胞的抑制作用，猜测可能与细胞内铁代谢和铁死亡有关21-24，但相关机制仍需进一步明确。综上所述，Hepcidin可以抑制人胰腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭，促进细胞凋亡，其机制可能与其可增加细胞内的铁含量有关。利益声明 所有作者声明不存在利益冲突作者贡献声明 姜曼：课题设计，文章撰写；师萍：完成实验，文章撰写参考文献：1MIZRAHI J D，SURANA R，VALLE J W，et al.Pancreatic cancer J.Lancet，2020，395（10242）：2008-2020.2AMANO S，KAINO S，SHINODA S，et al.Invasion inhibition in pancreatic cancer using the oral iron chelating agent deferasiroxJ.BMC Cancer，2020，20（1）：681.3RANA S，PRABHAKAR N.Iron disorders and hepcidinJ.Clin Chim Acta，2021，523：454-468.4VELA D，VELA-GAXHA Z.Differential regulation of hepcidin in cancer and non-cancer tissues and its clinical implications J.Exp Mol Med，2018，50（2）：e436.5NEMETH E，GANZ 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