嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲致病力的时间效应及对血淋巴的影响.pdf

收稿日期():接受日期():基金项目:海南省自然科学基金高层次人才项目()作者简介:吕朝军 男 博士 副研究员 研究方向:热带害虫生态防控技术:.通信作者()钟宝珠:.:./.嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲致病力的时间效应及对血淋巴的影响吕朝军 张楚毓 钟宝珠 赵建超 陈 拓中国热带农业科学院椰子研究所海南 文昌 开放科学标识码(码)摘要:【目的】阐明嗜菌异小杆线虫 品系处理对红棕象甲血淋巴免疫系统的影响【方法】采用室内生物测定和生理生化测定法研究了嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲不同虫态的致病力及对血淋巴各项指标的调节作用【结果】嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲不同虫态的致病力与处理浓度和处理时间均呈正相关性经嗜菌异小杆线虫 品系处理后红棕象甲血淋巴总量和血淋巴酯酶均呈前期升高、后期降低的趋势处理后 的血淋巴总量和酯酶活性与对照相比分别降低.和.血淋巴蛋白含量与对照相比呈下降的趋势虽在 时有一个短暂的回升之后又迅速下降其中在处理后 血淋巴的蛋白含量与对照相比下降.【结论】嗜菌异小杆线虫 品系的侵入破坏了红棕象的血淋巴免疫系统本研究结果可为揭示昆虫病原线虫对红棕象甲的致病机理提供依据关键词:嗜菌异小杆线虫 品系 红棕象甲 血淋巴 致病机理 :【】.【】.【】.【】.:红棕象甲 (.)是棕榈科植物的重要害虫对椰子 .(.)、油棕 .(.)、椰枣 .(.)等造成了极为严重的损失 随着人们对食品健康、生态保生物安全学报():.护的要求越来越高生物防治作为重要的防控手段日益受到重视 红棕象甲的生防因子包括绿僵菌(.)、白僵菌()、细菌(.)、昆虫病原线虫(.)等 目前昆虫病原线虫()在农业害虫防治中越来越表现出其优越性由于其喜欢潮湿隐蔽的环境常被用于防治钻蛀害虫和土壤害虫(刘奇志等)研究发现在沙特将 施用到土壤中后可导致 和 的红棕象甲幼虫和成虫死亡()在实验室条件下处理 后嗜菌异小杆线虫 对红棕象甲致死率达到.(.)功效评估结果显示在阿联酋的椰枣园本土分离的异小杆线虫能在短时间内成功杀死红棕象甲的幼虫、成虫和茧椰枣地的 种群也成功减少(.)由于其对昆虫宿主的高致病性(.)种常见的 被用作害虫综合治理中的生物控制剂()钟宝珠等()研究表明嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲幼虫具有一定的防控潜力但其对红棕象甲的血淋巴等免疫系统的影响还未可知 因此本试验系统研究了嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲各虫态的动态毒力水平及对幼虫血淋巴总量、血淋巴酯酶活性及血淋巴蛋白含量的影响以期为揭示嗜菌异小杆线虫 品系侵染红棕象甲的作用机理提供参考 材料与方法.试验材料嗜菌异小杆线虫 品系及红棕象甲各虫态均由中国热带农业科学院椰子研究所生物防治实验室自繁自养 其中嗜菌异小杆线虫 品系以大蜡螟 (.)幼虫为寄主进行扩繁采用 ()方法收集 龄感染期线虫()使用前用蒸馏水稀释至系列浓度备用红棕象甲采用半人工饲料(马子龙等)进行饲养试虫繁育及毒力试验均在温度()、湿度()的室内开展.试验方法.嗜菌异小杆线虫对红棕象甲不同虫态致病力的时间效应 龄幼虫致病力测定:用移液枪吸取 线虫溶液均匀滴加在红棕象甲背部将试虫转移至养虫盒()中养虫盒内预先放置 层甘蔗段作为试虫饲料 每处理 头重复 次处理后逐日统计死亡率连续统计 以昆虫针轻触虫体完全不动者为死亡 以蒸馏水处理为对照卵致病力测定:将卵置于养虫杯()中杯底覆盖滤纸用移液枪滴加 不同浓度线虫液至滤纸上 处理后逐日统计卵死亡率连续统计 每处理 粒重复 次以卵变红色或黑色为死亡 以蒸馏水处理为对照蛹致病力测定:将红棕象甲蛹单独置于养虫杯()中杯底覆盖滤纸用移液枪滴加 不同浓度线虫液至滤纸上 处理后逐日统计蛹死亡率连续统计 每处理 头重复 次以毛笔轻触蛹体蛹不动者为死亡 以蒸馏水处理为对照成虫致病力测定:将红棕象甲成虫单独置于养虫杯()中杯内添加甘蔗块作为试虫饲料杯底覆盖滤纸用移液枪滴加 不同浓度线虫液至滤纸上 处理后逐日统计成虫死亡率连续统计 每处理 头重复 次以昆虫针轻触虫体蜷曲不动者为死亡 以蒸馏水处理为对照.红棕象甲幼虫血淋巴总量测定参考胡美英等()的方法 以 条嗜菌异小杆线虫 品系处理红棕象甲 龄幼虫处理方法同.用电子天平准确称量处理后、和 的红棕象甲 龄幼虫活虫质量(精确至.)用昆虫针刺破胸部挤出血淋巴让其在吸水纸上爬行.后再次称质重最后计算血淋巴总质量(每克幼虫体重中血淋巴的毫克数)以蒸馏水处理为对照.红棕象甲血淋巴酯酶活性测定采用陈长琨()的方法 以 条线虫液处理红棕象甲 龄幼虫处理方法同.在浓度为 的 醋酸萘酯溶液中加入.磷酸缓冲液().摇匀后置于 下平衡 各加入血淋巴.立即摇匀计时 下平衡 迅速加入显色剂.(固蓝 盐溶液使用前 混匀)终止反应并显色 后待出现稳定的蓝绿色后测定 值 以蒸馏水处理为对照生物安全学报 第 卷.红棕象甲血淋巴蛋白含量测定采用考马斯亮蓝 法(陈钧辉等)以 条线虫液处理红棕象甲 龄幼虫处理方法同.预先用.牛血清蛋白制作标准曲线 将处理后的红棕象甲血淋巴溶液.加入蒸馏水.考马斯亮蓝试剂 摇菌放置 后测定 值对照标准曲线统计每毫升血淋巴中的蛋白质含量()以蒸馏水处理为对照.数据统计参考黄剑和吴文君()的方法采用 统计软件求出毒力回归方程及、的 置信区间等 结果与分析.嗜菌异小杆线虫对红棕象甲不同虫态致病力的时间效应嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲不同虫态的毒力水平和致死效果如表 和图 所示 以为参考随处理时间延长嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲各虫态的毒力水平也呈现上升的趋势其中以对卵的毒力水平最高以处理后 的 置信区间是否重叠为参考值处理后 嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲各虫态的毒力以卵最高而 龄幼虫、蛹和成虫处理组的毒力值未出现显著差异处理后 和 后对各虫态的毒力值仍以卵最高其次为 龄幼虫和蛹对成虫的毒力水平低于 龄幼虫处理组但与蛹处理组差异未达到显著水平在处理后期(和 )嗜菌异小杆线虫 品系对成虫的毒力水平均显著高于蛹处理组嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲不同虫态的致死率结果表明随着处理时间的延长红棕象甲的死亡率均呈现上升的趋势(图)表 嗜菌异小杆线虫 品系处理对红棕象甲的毒力 .虫态 处理时间/毒力回归方程致死中浓度/(条)相关系数 置信区间.卵.龄幼虫 .蛹.成虫.“”表示未出现死亡“”.第 期吕朝军等:嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲致病力的时间效应及对血淋巴的影响图 嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲不同虫态的致死率.红棕象甲幼虫血淋巴总量的测定经嗜菌异小杆线虫 品系处理后红棕象甲血淋巴总量呈现一个前期()升高后期()逐渐降低的趋势其中在处理后 的血淋巴总量为.与对照组相比升高.在 降低至与对照相当水平处理后 的血淋巴总量为.与对照相比降低.(图)图 嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲幼虫血淋巴总量的影响.红棕象甲幼虫血淋巴酯酶活性的测定经嗜菌异小杆线虫 品系处理后红棕象甲血淋巴酯酶活性短期内()升高处理后 的酯酶活性升高.之后逐渐下降处理后 和 的血淋巴酯酶活性与对照相比分别降低.和.(图)图 嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲幼虫血淋巴酯酶活性的影响.红棕象甲幼虫血淋巴蛋白含量的测定经嗜菌异小杆线虫 品系处理后红棕象甲幼虫血淋巴蛋白含量与对照相比呈现下降的趋势生物安全学报 第 卷(图)处理后 呈现一个短暂的回升之后又迅速下降其中在处理后 血淋巴的蛋白含量与对照相比下降.图 嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲幼虫血淋巴蛋白含量影响.讨论昆虫不同虫态体内所含营养物质不同如紫棕象甲 ()高龄幼虫体内蛋白含量达.而成虫蛋白含量为.()侵入虫体后需取食虫体内营养物质才可完成增殖进而杀死寄主寄主的龄期、虫态及体内激素分泌和免疫调节等均会影响线虫的寄生效果(刘勇)本研究中嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲卵的毒力水平显著高于其他虫态其次为幼虫和蛹而对成虫的毒力水平最低这可能与红棕象甲各虫态体内的营养物质差异有关 红棕象甲卵个体较小仅需较少线虫个体即可达到对其致死的效果同时 在寄主体内会释放共生细菌引起细胞毒性破坏免疫系统导致寄主死亡()线虫通过卵孔进入后不仅取食卵内营养物质且通过共生细菌破坏卵内细胞的分裂造成卵死亡幼虫和蛹体内富含脂肪和蛋白质等营养物质(.)虽可为线虫提供繁殖所需营养但体内的酯滴和蛋白又是虫体免疫的重要物质(葛君等)对于缓解线虫内生细菌对寄主的伤害起到了一定作用 同时本研究供试的 龄幼虫和蛹个体相对较大嗜菌异小杆线虫 品系需在虫体内增殖到一定数量才能对其起到致死效果而成虫表皮甲壳致密坚硬且体内营养物质低于其他虫态不利于 侵染 是昆虫专化寄生性天敌(丛斌等)可通过寄主孔口、伤口等部位进入血腔后释放细菌()使寄主血淋巴表现出明显的病理学变化(孙昊雨等)损坏寄主的免疫系统并最终导致寄主死亡 昆虫血淋巴中含有昆虫生理活性所需的一切代谢物质对血淋巴成分和功能的干扰必然会影响其正常的代谢功能 在本研究中经嗜菌异小杆线虫 品系处理后血淋巴总量前期迅速升高而之后又降低此趋势与丁晓帆等()的研究相似可能是由于在线虫侵染前期寄主防御系统开始起作用血细胞开始大量分裂导致血淋巴总量急剧升高之后随着病原线虫共生菌急剧增殖红棕象甲血细胞快速崩解致使后期血淋巴总量减低酯酶广泛存在于昆虫体内起着生化调节、神经传导及解毒代谢等作用(陈长琨 从斌等)肖猛()和丁晓帆等()采用 接种家蚕 .和大蜡螟 (.)均发现在供试时间内()血淋巴酯酶活性持续升高 本研究中红棕象甲受 侵染后血淋巴酯酶活性呈现前期()升高后期()降低的趋势 肖猛等()认为受线虫侵染后酯酶活性升高是由于对酯类物质分解增多和分解性酶活性的增强在本研究后期出现的酯酶活性逐渐降低情况笔者认为可能是由于在线虫侵染后期随着 和共生细菌在红棕象甲体内增殖血淋巴内脂肪等物质被大量消耗酯酶活性无法满足免疫需求导致酯酶活性逐渐降低昆虫血淋巴蛋白与体内代谢、抗药性及免疫调节等功能密切相关血蜱雌蜱受嗜菌异小杆线虫 品系感染 后其血淋巴蛋白出现升高在 后又出现显著降低(高志华等)孙昊雨等()研究表明蛴螬感染嗜菌异小杆线虫沧州品系后 内血淋巴蛋白含量大幅度增加随后急剧降低感染线虫 后显著低于同时间的对照(.)本研究中嗜菌异小杆线虫 品系侵染后红棕象甲血淋巴蛋白含量呈现持续降低的趋势虽在处理后 出现短暂的回升但之后仍迅速降低 线虫侵染红棕象甲后会大量消耗寄主体内的蛋白进行繁殖导致蛋白含量降低但在 出现短暂回升的具体原因还有待进一步阐明 第 期吕朝军等:嗜菌异小杆线虫 品系对红棕象甲致病力的时间效应及对血淋巴的影响参考文献陈钧辉 陶力 李俊 朱婉华 袁玉荪.生物化学实验.北京:科学出版社.陈长混.昆虫生理生化实验.北京:农业出版社.丛斌 刘维志 杨怀文.昆虫病原线虫研究和利用的历史、现状与展望.沈阳农业大学学报():.丁晓帆 林茂松 刘亮山.几种昆虫病原线虫对大蜡螟幼虫血淋巴及其能源物质含量的影响.南京农业大学学报():.高志华 杨小龙 刘敬泽 简恒.长角血蜱雌蜱感染嗜菌异小杆线虫后血淋巴的变化.昆虫学报():.葛君 李兵 沈卫德.昆虫脂肪体与抗药性的关系研究现状与分析.江苏农业科学():.胡美英 钟国华 林进添 孙之潭.闹羊花素对昆虫血淋巴能源物质含量的影响.华中农业大学学报():.黄剑 吴文君.利用 快速进行毒力测定中的致死中量计算和卡方检验.昆虫知识():.刘奇志 赵映霞 严毓骅 王玉柱 .我国昆虫病原线虫生物防治应用研究进展.中国农业大学学报():.马子龙 覃伟权 李磊 黄山春 魏娟 阎伟.红棕象甲幼虫的半人工饲料:.孙昊雨 李克斌 席景会 尹姣 曹雅忠.昆虫病原线虫侵染对宿主血淋巴免疫系统的影响中国植物保护学会成立 周年庆祝大会暨 年学术年会论文集.北京:中国植物保护学会:.孙昊雨 刘树森 席景会 田雷雷 刘春琴 尹姣 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