神经干细胞分泌组通过调节小胶质细胞表型抑制体内外神经炎症.pdf

第 卷第 期 年 月江 苏 大 学 学 报(医 学 版)().神经干细胞分泌组通过调节小胶质细胞表型抑制体内外神经炎症周继勤 倪玮 凌亚亭 吕孝瑞 牛冬冬曾宇 仇昀 司雨 王子瑜 胡嘉波(.江苏大学医学院江苏 镇江 .海尔施生物医药股份有限公司医学检验所浙江 宁波)摘要 目的:探究神经干细胞分泌组()对体内外神经炎症的影响及作用机制方法:采用脂多糖诱导神经炎症小鼠模型通过旷场实验评估 对小鼠行为学的影响免疫荧光染色和尼氏染色评估 对脑皮质小胶质细胞表型和神经元损伤的影响体外用脂多糖刺激诱导 小胶质细胞炎症模型通过流式细胞术检测 对 细胞表型的影响采用过氧化物酶体增殖物激活受体()抑制剂 研究 的抗炎机制 结果:经 治疗的小鼠在旷场实验中运动总距离及平均运动速度均显著提高(.)调节小鼠脑皮质中小胶质细胞表型极化并抑制神经元损伤 在体外抑制 细胞 表面标志 表达(.)促进 表面标志 表达(.)然而 阻断了 对 细胞表型的调节作用(.)结论:通过调节小胶质细胞表型在脂多糖诱导的体内外神经炎症中发挥保护作用关键词 神经干细胞分泌组神经炎症小胶质细胞表型中图分类号.文献标志码 文章编号 ():./.引用格式周继勤倪玮凌亚亭等.神经干细胞分泌组通过调节小胶质细胞表型抑制体内外神经炎症.江苏大学学报(医学版)():.基金项目校企协同创新项目()作者简介周继勤()女硕士研究生胡嘉波(通讯作者)教授博士生导师:.(.):().:().().:(.).(.)(.)(.).:.神经炎症是中枢神经系统应对各种损伤或压力所做出的一种级联反应由免疫细胞及其产生的神经炎症物质介导 据报道神经炎症参与各种神经退行性疾病的触发与进展包括多发性硬化、帕金森病、阿尔茨海默病等抑制炎症微环境可以有效治疗神经炎症病理的神经退行性疾病 因此靶向神经炎症是治疗神经退行性疾病的新策略 小胶质细胞作为中枢神经系统中的先天性免疫细胞是神经炎症过程中的主要参与者 研究表明根据功能特性小胶质细胞可分为 促炎表型和 抗炎表型前者主要通过分泌炎症因子加重组织损伤后者主要通过分泌抗炎因子促进炎症消退和组织修复 因此抑制小胶质细胞促炎表型 和促进抗炎表型 有助于炎症性疾病治疗 已证实神经干细胞()分泌的生物活性物质在神经炎症中具有积极作用 本课题组前期研究表明神经干细胞分泌组()具有明显的神经保护作用及免疫调节作用并且在坐骨神经损伤模型中通过重塑免疫微环境改善大鼠周围神经损伤由此进一步支持 的治疗作用 但是 是否能通过调节小胶质细胞表型抑制神经炎症尚不清楚因此本研究拟探讨 对体内外神经炎症的影响及具体作用机制 材料与方法.材料 只雄性 小鼠()购自江苏大学动物实验中心许可证号:(苏)小鼠小胶质细胞株 细胞和小鼠神经瘤母细胞 细胞购自北京协和医学院细胞资源中心人 由课题组先前诱导分化获得、/培养基、胎牛血清均购自美国 公司表皮生长因子()和重组人碱性成纤维生长因子()购自美国 公司脂多糖()和 二脒基苯基吲哚二盐酸盐()购自美国 公司基质胶(美国 公司)蛋白裂解液和地塞米松()购自上海碧云天生物技术公司尼氏染液(北京索莱宝科技有限公司)(美国 公司)乳 酸 脱 氢 酶()检测试剂盒(南京建成生物工程研 究 所)(美 国 公司)固定破膜液试剂盒(杭州联科公司)单克隆兔抗过氧化物酶体增殖物激活受体()抗体(英国 公司)单克隆兔抗 抗体、多克隆兔抗核因子()抗体和多克隆兔抗组蛋白 抗体(美国 公司)多克隆兔抗 抗体和多克隆兔抗微管相关蛋白()抗体(美国 公司)抗小鼠 同型克隆、抗小鼠、抗小鼠 购自美国 公司 多克隆兔抗 肌动蛋白抗体(美 国 公司)多克隆兔抗 抑制因子()抗体和多克隆兔抗磷酸化()购自沈阳万类生物科技有限公司山羊抗兔 标记二抗(苏州睿瀛生物技术有限公司)荧光显微镜(日本 公司)病理切片扫描仪(匈牙利 公司)流式细胞仪(美国 公司)多功能酶标仪(美国 公司).细胞相关实验.细胞培养 参考本课题组之前的研究将人胚胎干细胞分化成 并将其置于含有 青霉素 链霉素、非必需氨基酸、/和 /的/中进行培养 细胞和 细胞用含有胎牛血清的 置于 、的培养箱中培养.收集和浓缩 参考文献收集第 代的 当 细胞融合度为 时 洗涤 次加入新的无血清 孵育 收集培养液并以 /离心 以去除细胞碎片和杂质然后取上清液即为 保存供后续实验使用将收集的 置于 培养皿中 江苏大学学报(医学版)第 卷于 放置 使其完全凝固在超净台中弃培养皿盖并用锡箔纸包裹培养皿表面用针头戳孔放在真空冻干机上冻干约 后取出用 无菌超纯水充分溶解即为浓缩 倍的 分装保存于 备用(周内用完)将基质胶包被于无 生长的培养瓶用 同样处理作为对照.脂多糖诱导 细胞炎症模型及分组 将 细胞接种于 孔板进行如下分组:对照组细胞常规培养 更换新的无血清 孵育 组细胞常规培养 更换含有 /的无血清 孵育 组细胞常规培养 更换含有 /和 的无血清 孵育 组:细胞常规培养 用终浓度为/的 预先处理 再加入含有/和 的无血清 孵育至 .流式细胞术检测、表达取“.”分组处理细胞每组收集 细胞分别加 标记小鼠 同型对照、抗小鼠 以及抗小鼠 孵育 /离心 取细胞沉淀用含 胎牛血清的 洗涤 遍最后重悬于 中 内用流式细胞仪检测 检测 时事先采用固定破膜液破膜 然后加抗体在破膜缓冲液中孵育.与 细胞共培养在 的 孔板中共培养 小胶质细胞和 细胞 细胞接种于上部小室中(/孔)细胞(/孔)接种于下部 孔板中 先按照“.”分组处理细胞弃上清液用 洗涤 细胞 次然后转移到含有 细胞的 孔板中共培养 后移除上室的 细胞对 孔板中的 细胞进行后续实验.和 分别检测 细胞存活率与细胞毒性 细胞和 细胞共培养 后根据说明书行 和 检测 用酶标仪分别在 和 处测定光密度()测定计算公式如下:活性 测定 对照 标准 空白 标准 式中:样本测试前稀释倍数标准标准液浓度./单位换算().细胞免疫荧光染色观察 细胞轴突长度按照“.”制备 细胞玻片用多聚甲醛固定 用含 的 破膜 用牛血清白蛋白于室温封闭 随后与 一抗于 孵育过夜次日与相应的二抗室温染色 复染 洗涤后用抗荧光猝灭剂封片 采用尼康荧光显微镜采集图像.蛋白免疫印迹法检测 通路以及 通路相关蛋白表达按照“.”分组处理细胞弃上清液用 洗涤 遍每孔加入 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 缓冲液裂解细胞用细胞刮刀研磨收集裂解物于 管中冰上孵育 每 振荡 次 离心 收集上清液并检测蛋白含量以 比例与上样缓冲液混合 金属浴 保存于 配制 的凝胶行 电压设为 转膜 牛血清白蛋白封闭 洗涤后将 膜放入稀释好的一抗中 孵育过夜次日室温孵育二抗 洗涤 系统曝光条带用 对蛋白印迹进行灰度分析 所使用的一抗为多克隆兔抗 肌动蛋白抗体、单克隆兔抗 抗体、多克隆兔抗 抗体、多克隆兔抗组蛋白 抗体、多克隆兔抗 抗体和多克隆兔抗 稀释比均为 二抗 标记的羊抗兔 稀释比为 .动物相关实验.诱导小鼠模型及 处理 采用腹腔注射(/)诱导神经炎症模型 将 只小鼠随机均分为 组每组 只:对照组尾静脉注射 组腹腔注射(/)组腹腔注射(/)后尾静脉注射 组腹腔注射(/)后尾静脉注射(/)后进行后续相关实验.旷场实验评估小鼠自发性运动采用旷场实验对小鼠自发运动活动进行评价 将小鼠放置在一个相对安静、光线较暗的盒子里 测试前用乙醇将盒子底部区域清理干净以避免之前测试的影响 将小鼠放置在开放的盒子中 .(荷兰 公司)软件分析 内小鼠的运动轨迹、总运动距离和平均运动速度.脑切片制备采用腹腔注射.水合氯醛(/)麻醉小鼠然后固定于操作台上打开胸腔暴露出心脏从心尖处缓慢灌注 至血液颜色逐渐变淡四肢呈白色再灌注 多聚甲醛溶液至四肢及肝脏僵硬然后进行断头取脑并浸泡于第 期周继勤等.神经干细胞分泌组通过调节小胶质细胞表型抑制体内外神经炎症多聚甲醛溶液中继续固定 将固定好的脑组织进行石蜡包埋、切片(厚度为 ).免疫荧光染色检测、表达将脑冠状切片用 多聚甲醛固定 用含.的 破膜 牛血清白蛋白室温封闭 与抗、抗 和抗 等免疫荧光一抗于 孵育过夜次日用相应的二抗室温染色 复染 洗涤后用抗荧光猝灭剂封片 采用尼康荧光显微镜采集图像.尼氏染色检测神经元损伤 参照 染色试剂盒的说明将脑切片用 甲酚紫染色 再用 分化液分化 经无水乙醇迅速脱水、二甲苯透明最后用中性树胶密封 用病理切片扫描仪进行观察.统计学分析定量数据以均数 标准差()表示 采用 软件.版本进行单因素方差分析以确定组间差异采用 检验进行进一步两两比较 .为差异具有统计学意义 结果.改善 诱导的小鼠行为与对照组相比 组小鼠在旷场实验中的运动总距离显著缩短平均运动速度显著下降(.)与 组相比 组和 组小鼠在旷场实验中的运动总距离显著增长(.)平均运动速度明显增快(.)见图.对脑皮质中小胶质细胞表型的影响脑皮质免疫荧光染色结果显示与对照组相比 组小鼠脑皮质中 小胶质细胞表面标志 表达增强 小胶质细胞表面 表达减弱而 组与 组表现出相似的结果 表达减弱 表达增强见图:内各组小鼠在旷场中的运动轨迹:内各组小鼠在旷场中的运动总距离:内各组小鼠在旷场中的平均运动速度:.与对照组比较:.:.与 组比较图 改善 诱导的小鼠行为障碍图 免疫荧光染色检测各组脑皮质小胶质细胞表型标志、表达().对脑皮质中神经元数量及结构的影响如图 所示与对照组相比 组小鼠脑皮质区域的神经元数量减少并且神经元中的尼氏小体减少而 组和 组中的脑皮质神经元数量与结构接近于对照组箭头示尼氏小体消失的神经元图 各组脑皮质尼氏染色结果()江苏大学学报(医学版)第 卷.对 细胞表型的影响如图 所示流式细胞术检测结果显示与对照组相比 组 细胞 表达显著增加(.)表达显著减少(.)与 组相比 组 细胞 表达明显减少(.)表达显著增加(.):表达:表达图 流式细胞术检测 细胞表型标志、表达.抑制 细胞对 细胞产生的炎症损伤建立 细胞与 细胞共培养系统结果显示与对照组相比 组 细胞轴突长度显著缩短(.)细胞存活率显著降低(.)乳酸脱氢酶活性显著增加(.)当 细胞与 处理的 细胞共培养时与 组相比 组 细胞轴突长度显著增长(.)细胞存活率明显提高(.)乳酸脱氢酶活性明显降低(.)见图.激活 通路并抑制 通路免疫印迹结果显示与对照组相比 组 细胞 胞核表达显著降低(.)胞核表达显著增加(.)而胞质表达显著减少(.)表达水平显著增加(.)与 组相比 组 细胞 胞核表达显著增加(.)核表达明显减少(.)而胞质表达明显增加(.)表达水平显著降低(.)见图:细胞免疫荧光染色():细胞轴突长度定量分析:法检测 细胞存活率:细胞乳酸脱氢酶活性检测图 各组细胞 免疫荧光染色、细胞存活率以及乳酸脱氢酶活性比较:免疫印迹分别检测、蛋白表达 :、蛋白相对表达定量分析图 蛋白免疫印迹检测 通路及 通路相关蛋白表达第 期周继勤等.神经干细胞分泌组通过调节小胶质细胞表型抑制体内外神经炎症.通过激活 调节 细胞表型流式细胞术检测结果显示与对照组相比组 细胞 表达显著增强(.)表达显著减弱(.)与 组相比 组 细胞 表达明显减弱(.)表达显著增强(.)当用 抑制剂 抑制 激活时与 组相比 组 细胞的 标志 表达明显增强(.)而 标志 表达明显减弱(.)见图:表达:表达:对照组:组:组:组图 流式细胞术检测 细胞表型标志、表达 讨论本研究采用 治疗神经炎症小鼠相比于直接细胞疗法 规避了移植的 不易存活、免疫排斥、易致瘤等风险 本研究结果显示在体内实验中 明显增强小鼠的自发性运动表明 能够有效改善 诱导的小鼠行为障碍 小胶质细胞是大脑中的主要免疫细胞其表型的变化影响神经炎症的多个方面调节小胶质细胞表型有助于神经炎症的消退 本研究中 显著促进脑皮质的小胶质细胞由 促炎表型向 抗炎表型的转换说明 通过对小胶质细胞表型的调节发挥抗炎作用另外 组小鼠脑皮质的神经元减少并呈现出胞体固缩、尼氏小体减少的变化而 治疗明显抑制神经元的减少以及其内部结构的变化表明 能够减轻小鼠脑中神经元的损伤在体内发挥神经保护作用 此外本研究体外实验结果表明 对 细胞表型具有调节作用 在 细胞与 细胞共培养系统中由于 诱导了 细胞 促炎表型因此共培养的 细胞轴突生长与细胞活力受到抑制而经 处理的 细胞明显恢复了 细胞轴突生长与细胞活力说明 能够通过调节 细胞表型抑制 诱导的 细胞对 细胞产生的炎症损伤进一步证明了 的抗炎作用 是炎症进展中的关键转录因子可调节多种促炎介质的表达在各种炎症相关疾病的发展过程中发挥重要作用 研究表明抑制 信号通路可致小胶质细胞从 促炎表型转变为 抗炎表型 为核激素受体家族成员其本质是一类转录调节因子具有配体依赖性经配体激活后进入细胞核中调节基因转录 激活在各种疾病中具有抗氧化和抗炎功能 最近研究表明 及其激动剂可减轻神经炎症一方面 可以通过抑制促炎信号通路 从而抑制炎症反应另一方面 可以通过直接抑制炎症细胞因子以及趋化因子的基因转录从而下调促炎基因表达 此外 激活能够通过增加抗炎标志物调节小胶质细胞表型这也是其抵抗神经炎症的重要机制之一 本研究结果表明 抑制 通路并激活 通路但 特异性抑制剂 阻断了 对 通路的抑制也抑制了 对 细胞由 表型向 表型转变的促进作用由此说明 可能通过 依赖方式调节 细胞表型综上所述本研究表明 可提高神经炎症小鼠的自发运动能力通过激活 促进小胶质细胞由 表型转换为 表型在体内外发挥抗炎作用及神经保护作用 但是 中的物质复杂繁多究竟是何种物质起作用有待后续进一步探究参考文献 .():.:.():.江苏大学学报(医学版)第 卷 .:.():.:.:.:.():.:.():.:.():.:.:.陈天琰 张磊 高建一 等.人胚胎干细胞源神经干细胞微囊泡对巨噬细胞极化的影响.江苏大学学报(医学版)():.余佳红 童玉 叶开 等.人神经干细胞微囊泡对谷氨酸诱导 细胞损伤的保护作用.江苏大学学报(医学版)():.():.():.纪贤严 高建一 叶开 等.人胚胎干细胞源神经球条件培养液对大鼠施万细胞增殖和迁移的影响.江苏大学学报(医学版)():.:.():.():.():./.():.():.():.():.():.():.收稿日期 编辑 刘星星第 期周继勤等.神经干细胞分泌组通过调节小胶质细胞表型抑制体内外神经炎症