肾移植受者肠道菌群特征及其与糖代谢紊乱的关联.pdf

DO1:10.3969298X.2023.03.006第32 卷第3期2023年6 月肾脏病与透析肾移植杂志231肾移植受者肠道菌群特征及其与糖代谢紊乱的关联诸医蒙！王江东仇超张孝认？徐鹏杰王依娜！胡雨韵沈洲姬摘要目的：明确肾移植受者肠道菌群结构和代谢改变模式,评估差异菌群对肾移植后糖尿病（PTDM)的预测价值。方法：纳人2 0 0 1年1月至2 0 2 2 年7 月在宁波大学附属李惠利医院手术及随访的肾移植受者，分为移植后高血糖(PTHG)组 包括PTDM组和移植后糖尿病前期(prePTDM)组 和血糖正常组,对其粪便标本进行16SrRNA基因V3-V4区域测序。比较PTHG组与血糖正常组粪便菌群结构及功能改变,分析差异菌群与临床理化指标之间的关联，并评估其辅助诊断PTHG的能力。结果：纳入肾移植受者9 2 例，其中PTHG组36 例（包括PTDM组2 9 例,prePTDM组7 例）。与血糖正常组相比,PTHG患者粪便菌群丰度和多样性的增加无统计学意义。PTHG组中芽孢杆菌属（Gemmiger）和亚诺杆菌属（Anaerobacterium）的相对丰度显著增加，而黄杆菌属（Fl a v o n i f r a c t o r）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和副沙门氏菌属（Parasutterella）的相对丰度显著减少（P 0.3且P O.0 5).In PT H G g r o u p,t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f G e mmi g e r a n dAnaerobacterium increased significantly,while that of Flavobacterium,Bifidobacterium and Parasutterella decreasedsignificantly(P0.3 and P0.05).The ROC curve(AUC=0.830)was drawn with the above sixbacteria,and the flora combined with fasting blood glucose was analyzed(AUC=0.962),which was higher than thediagnostic efficiency of fasting blood glucose alone.Carbohydrate metabolic pathways such as amino sugar,nucleoside sugarand galactose metabolism and bile acid biosynthesis were significantly decreased in PTHG group.Subgroup analysis showedthat Desulfovibrio,Anaerobacterium and Gemmiger showed a decreasing trend among PTDM,prePTDM and Normalgroups,but the trend was not significant.Conclusion:The constitute and function of intestinal flora in patients withPTDM changed significantly,and the difference of microflora was significantly related to glucose metabolism.Some of themicroflora showed a decreasing trend among PTDM,prePTDM and normal blood glucose groups.Key wordsintestinal microflorapost-transplantation diabetes mellitus16S rRNA gene sequencingkidneytransplantation移植后糖尿病(PTDM)指移植后新诊断的糖尿病，包括移植前预先存在但未诊断的和移植后新发糖尿病。近年来，部分研究提示肠道生态失调与免疫抑制剂诱导的PTDM之间存在密切联系。然而，既往研究大多只侧重于发现免疫抑制剂治疗后大鼠肠道菌群变化 2 ,或在PTDM患者中验证与糖代谢相关的肠道菌群改变 3。目前尚无关于肾移植受者肠道菌群与PTDM之间相关性的完整描述，也无明确导致PTDM发生的特定菌群结构或代谢变化模式。本研究旨在利用16 SrRNA基因测序,探索移植后高血糖(PTHG)患者肠道微生物区系结构和代谢途径变化，评估PTHG相关肠道菌群与临床理化指标之间的相关性，并尝试在不同糖代谢亚组中筛选出存在变化趋势的菌属，初步验证早期糖代谢紊乱患者存在肠道菌群改变。对象和方法研究对象纳入2 0 0 1年1月至2 0 2 2 年7 月期间在宁波大学附属李惠利医院手术及随访的肾移植受者。纳入标准：（1）临床资料全面、年龄18 8 0岁；（2)移植后至少6 月，免疫抑制剂剂量稳定，移植肾功能稳定；（3）获取标本质检合格。排除标准：（1)移植前已确诊2 型糖尿病；（2)研究期间出现急/慢性排斥反应、感染、移植物失功等并发症者；（2）人组前2 周有消化道症状或疾病、感染性疾病，或服用过调节菌群药物者。PTDM的诊断基于美国糖尿病协会的诊断标准 4：非同日2 次空腹血糖7.0 mmol/L,或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)2h血糖11.1 mmol/L,或糖化血红蛋白6.5%,或高血糖症状合并随机血糖11.1mmol/L,或依赖药物维持血糖稳定者。移植后糖尿病前期(prePTDM)的定义参考糖尿病前期的定义,包括空腹血糖受损和糖耐量减低:空腹血糖6.16.9 mmol/L或 OGTT 2 h 血糖 7.8 11.1mmol/L。本研究经我院伦理委员会批准（编号：KY2021PJ124），并已获得患者的书面知情同意。16SrRNA基因测序严格遵循无菌原则采集受者的新鲜粪便样本,取约5g于无菌收集器内，在30min内放人-8 0 超低温冰箱。使用粪便微型试剂盒提取总细菌DNA，质检合格后利用PCR扩增细菌16 SrRNA基因的V3-V4区。平行扩增3次，将产物混合并纯化，得到原始文库，引人特异性标签序列，并根据电泳结果准确定量测序文库浓度。生物信息学及统计学分析将16 SrRNA序列数据集质控后生成扩增序列变体（ASV），与菌群数据库比对后注释成各菌群。使用Mothur软件计算Chaol、A CE、Sh a n n o n 和Simpson等多样性指数，分析菌群总体数量和种类。使用R软件基于bray、jaccard、u n i f r a c 和wunifrac四种算法进行主坐标分析（Principal Coordinate Analysis，PCo A），比较组间相似程度。分别用Wilcoxon秩和检验、ANOVA分析、Metastats分析和Lefse软件对组间菌群进行差异2023年6 月肾脏病与透析肾移植杂志第32 卷第3期233分析，并利用GraphPad Prism8协助绘图。使用PICRUSt工具分析组间物种功能。通过Spearman相关性分析研究各物种与临床指标之间相关性,并用R软件绘制热图展现。使用SPSSV26.0进行统计分析，定量资料先进行正态性检验，正态资料以均数标准差描述，根据方差齐性采用t检验或校正t检验进行组间比较；偏态资料采用中位数（四分位间距）描述，采用Wilcoxon秩和检验进行组间比较；定性资料采用例数（百分比）进行描述，采用卡方检验或校正卡方检验进行组间比较。P0.05为差异有统计学意义。结果一般资料最终纳人受者9 2 例：血糖正常组56例（6 0.8 7%）为对照组，PTHG36例（39.13%）（PT D M 组2 9 例，prePTDM7例）。PTHG受者年龄更大，体质量指数和三酰甘油更高，而高密度脂蛋白较低(P0.05），也不能完全区分两组。龚便微生物组成改变共发现18 门,30 纲，45Vol.32No.3Jun.2023JNephrolDialyTransplant234目,9 4科，2 2 5属，2 6 3种微生物。LEfSe分析在各分类水平上筛选出了组间差异显著的细菌类别（图1A），基于LEfSe分析绘制的进化分支图显示，差异菌群来源于不同分类水平（图1B）。AB移植后高血糖对照组双歧杆菌具移植后高血糖a:双歧杆菌属双对照组b:双歧杆菌科C:双歧杆菌目利蜜拟杆菌d:柯林斯菌属丹毒丝菌纲的茉命名宜e:伊格尔兹氏菌多枝梭菌f：史雷克氏菌属黄杆菌属g：红蝽菌科埃格特氏菌属共生俊南菌h：红蝽菌目主：另枝菌属液真杆菌厅：理研菌科Papillibacer菌属k：魏氏菌属Papillibacter菌属未命名种1：明串球菌科未命名的主物体m：优杆菌科脱硫弧菌属n：亚诺杆菌属未命名的留胃细菌o:黄杆菌属明串球菌科p：芽孢杆菌属柯林斯菌属q:Papillibacter菌属孢杆菌科床命名属：孢杆菌属亚诺杆菌属s:丹毒丝菌科的未命名属芽孢杆菌属1：脱硫弧菌属u：色盐杆菌属-43-2101234LDA SCORE(log10)图1A：LEf Se 分析显示组间粪便菌群组成差异（ILDAI2且P0.05）B：进化分支图显示各分类水平上的差异菌群（由内到外：门、纲、目、科、属、种）Metastats分析显示，PTHG组中放线菌门显著低于对照组（P0.05），并且属于该进化分支的放线菌纲、双歧杆菌目、双歧杆菌科、双歧杆菌属和部分双歧杆菌种的相对丰度均显著减少（P0.05）。在属水平上，PTHG组中芽孢杆菌属（Gemmiger）和亚诺杆菌属（Anaerobacterium）的相对丰度显著增加，而黄杆菌属（Flavonifractor）、双歧杆菌属（Bi f i d o b a c t e r i u m）和副沙门氏菌属（Parasutterella）的相对丰度显著减少(P0.3且P0.05作为显著性筛选阈值，我们发现芽孢杆菌属和Anaerobacterium菌属与空腹血糖呈显著正相关，而丹毒丝菌科的未命名属（Er y s i p e l o t r i c h a c e a e _i n c e r t a e _s e d i s）与空腹血糖呈显著负相关。基于粪便微生物区系特征区分PTHG与血糖正常受者我们评估了上述组间显著差异菌属及与血糖具显著相关性的菌属作为生物标志物区分两组的潜在价值。首先生成单种差异菌属ROC曲线（图4A），曲线下面积（AUC）分别芽孢杆菌属（0.6 8 6）、Anaerobacterium菌属（0.6 32）、黄杆菌属（0.6 8 6）、双歧杆菌属（0.6 34）、副沙门氏菌属（0.58 3）和丹毒丝菌科的未命名属（0.6 43）。再通过多元逐步Logistic回归分析来评估，将6 种菌群联合分析，AUC为0.8 30,表示具一定的诊断效能。将上述菌群联合空腹血糖进行分析，其AUC为0.9 6 2，大于空腹血糖的单独诊断效能（图4B）。利用亚组进一步分析差异菌群发现早期移植后糖尿病的潜力ANOVA分析显示,PTDM、p r e PT D M和Normal三组间存在17 种差异菌群，其中脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、A n a e r o b a c t e r i u m菌属和芽孢杆菌属在三组间呈递减趋势，但相关趋势并不显著(图5)。第32 卷第3期2023年6 月肾脏病与透析肾移植杂志235表2菌群KEGG功能预测分析均值KEGG编号KECG途径名称P值PTHG 组对照组ko00120初级胆汁酸的生物合成2.692.773.458.740.003ko00121次级胆汁酸生物合成24232.9431 126.850.003ko04075植物激素信号转导7.0212.670.007ko00511其他多聚糖降解24558.5831 252.950.008ko00531糖胺多糖的降解6575.039 191.270.012ko00980细胞色素P450对外源物质的代谢432.3577.640.014ko04146过氧物酶体3.410.593 703.300.016ko00520氨基糖和核苷酸糖代谢22763.2125 065.460.017ko00052半乳糖代谢26 202.1028585.840.025ko03050蛋白酶体26.0065.090.026ko00040戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化15 238.1116 590.290.038ko05410肥厚型心肌病7.7023.800.038ko00523聚酮糖单元生物合成1954.98562.070.040ko04974蛋白质消化吸收360.37523.320.040ko00430牛磺酸和次牛磺酸代谢11 272.0612 185.460.047PTHG：移植后高血糖；KEGG：京都基因与基因组百科全书丹毒丝菌科的未命名属0.4凯特百可特菌属布劳特氏属肠杆菌属0.2葡萄球菌属亚诺杆菌属芽孢杆菌属0多尔氏菌属粪杆菌属Pseudoflavonifractor菌属-0.2阿克曼菌属颤螺旋菌属克里斯滕森菌属粪球菌属丁酸弧菌属紫单胞菌梭菌属IV群intestinimonas菌年TH图3菌属相对丰度与临床理化指标的相关性热图BMI：体质量指数；TIME：移植后时间；FK506：他克莫司血药浓度；CRE：血清肌酐；HDL：高密度脂蛋白；UA：血尿酸；TC：总胆固醇；LDL：低密度脂蛋白；Alb：血清白蛋白；TG：三酰甘油；Mg：血清镁离子；颜色深浅表示相关系数强弱，方格上的*表示P0.05，*表示P0.01Jun.2023Vol.32No.3JNephrolDialyTransplant236A1.00.90.80.70.60.50.4芽孢杆菌属0.3亚诺杆菌属黄杆菌属0.2双歧杆菌属副沙门氏菌属0.1丹毒丝菌科的未命名属00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01-特异度B 1.00.90.80.70.60.50.40.30.2空腹血糖6种差异菌群联合0.1差异菌群联合空腹血糖00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01-特异度图4A：单种菌群各自绘制ROC曲线；B：菌群联合空腹血糖绘制ROC曲线讨论PTDM是肾移植后常见的代谢并发症，易对移植物功能和存活产生不利影响。既往研究发现肠道菌群结构和代谢改变在宿主免疫系统和糖代谢的调节中似乎起着关键作用 5-6 。然而，在肾移植背景下，代谢紊乱、微生物变化和免疫抑制药物之间的相互作用错综复杂，目前尚没有完全阐明其中的变化规律和机制。如能明确肠道菌群与PTDM之间相互关系，通过检测菌群情况尽早预测和诊断PTDM的发生，早期利用抗生素、益生菌、益生元或粪菌移植等手段对菌群变化进行干预,并提前调整对血糖有影响的抗排异药物种类或剂量，对临床上PTDM的预防和治疗将有非常大的指导意义。本研究通过16 SrRNA基因检测技术分析受者粪便菌群发现,与对照组相比,PTHG受者肠道菌群P1=0.983P3=0.223PTDMA400prePTDMP2=0.005对照组门3002001000B400P1=0.207P3=0.998IPTDMprePTDMP2=0.005口对照组3002001000C10000P1=0.999P3=0.279PTDMprePTDM8.000P2=0.018口对照组400040002.0000图5脱硫弧菌属（A）、亚诺杆菌属（B）和芽孢杆菌属(C)的相对丰度PTDM:移植后糖尿病;prePTDM:移植后糖尿病前期丰度和多样性指数均略增加，但增加程度不明显，这与在2 型糖尿病患者中观察到菌群多样性显著减少的研究结果不一致 7 。PTDM 与普通糖尿病的病理生理机制并不完全相同，移植前尿毒症期肠道屏障已破坏，移植后服用大量抗排异药物等因素，肠道负担增加,势必导致菌群改变 8 。由于个体之间存在显著差异,PCoA分析也不能区分PTHG与对照组，这表明除差异菌群外，两组菌群结构大体相仿。在菌门水平上的分析中，本研究未观察到在普通糖尿病人群中出现的厚壁菌门与拟杆菌门的比值变化 9 ,只发现PTHG组中放线菌门及其属支显著减少（P0.05）。放线菌门及其属支可直接或间接生成短链脂肪酸（SCFA），通过激活G蛋白偶联受体或抑制组蛋白去乙酰化酶等多种机制，维持肠道屏障动态平衡 10-1PTHG组粪便放线菌门及其属陈婷（本文编辑第3期2023年6 月第3 2 卷肾脏病与透析肾移植杂志237支的减少将导致肠道内环境紊乱，通透性增强，致使内毒素移位到血清中，触发免疫系统的激活,诱导慢性炎症状态，从而导致胰岛素抵抗和糖尿病的发生 12 。菌群功能预测分析结果显示，组间菌群差异与糖代谢和胆汁酸生物合成密切相关。胆汁酸是胆固醇衍生的代谢物,其与核法尼醇X受体和G蛋白偶联胆汁酸受体结合，激活转录网络和信号级联，可改善肠道菌群结构，调节胰岛素分泌、肝脏糖异生、糖原合成等相关基因的表达和活性 13。结合Martin等 14 对菌属与胆汁酸结合作用的分析，本研究PTHG组中芽孢杆菌属相对丰度增加和副沙门氏菌属相对丰度减少将不利于胆汁酸生物合成，进而参与诱导糖脂代谢紊乱。根据ROC分析发现，多种菌群联合空腹血糖可以提高对PTHG的诊断效率,并且部分与糖代谢相关的差异菌群在PTDM、p r e PT D M 和对照组三组间呈递减趋势，但或许是由于样本量偏少及各组间样本量差距较大，相关趋势并不显著,后续研究可以此为基础,在更大样本量的人群中验证这一发现。基于本研究结果推断,在移植后糖尿病早期,肠道菌群已然发生改变，且差异菌群能够影响SCFA生成，参与受者糖脂代谢及胆汁酸生物合成等，可能是移植后糖尿病触发因素之一。通过检测差异菌群，或能提前预测、早期诊断PTDM,并探索性地尽早采取粪菌移植、补充SCFA制剂或改善胆汁酸代谢等干预措施，阻断PTDM的发生，为临床PTDM的防治提供新的启示。小结：本研究对PTDM相关粪便微生物群的全面分析为该疾病的发病机制提供了新的见解，并为PTDM的预测、诊断和个体化治疗提供了新的思路和策略。未来还有较多的研究方向和空间可以进一步深人，比如研究差异菌群的功能及机制，并对细菌代谢产物进行评估，进一步的动物实验可能有助于确定这些细菌与PTDM发病机制之间的因果关系。参考文献1SHARIF A,HECKING M,DE VRIES A P,et al.Proceedings froman international consensus meeting on postransplantation diabetesmellitus:recommendations and future directions.Am J Transplant,2014,14(9):1992-2000.2BHAT M，PA SI NI E，C O PELA ND J,e t a l.I m p a c t o fImmunosuppression on the Metagenomic Composition of the IntestinalMicrobiome:a Systems Biology Approach to Post-Transplant Diabetes.Sci Rep,2017,7(1):10277.3LECRONIER M,TASHK P,TAMZALI Y,et al.Gut 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