前列腺癌患者外周血DNA腺嘌呤N6甲基化修饰的研究.pdf

基金项目:坪山区卫生系统科研项目(2 0 1 9 5 2);深圳市坪山区医疗健康集团院长基金(2 0 2 2 0 2)作者单位:5 1 8 1 1 8 深圳市坪山区人民医院检验科(李凤艳、朱鹏、吴俊霖、刘弘);泌尿外科(潘卫兵)通信作者:潘卫兵,E-m a i l:5 4 x y z 1 6 3.c o m实验研究前列腺癌患者外周血D NA腺嘌呤N 6甲基化修饰的研究李凤艳 朱鹏 吴俊霖 刘弘 潘卫兵d o i:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 4-4 6 2 4.2 0 2 3.0 4.0 0 8【摘要】目的 本研究分析前列腺癌(P C a)患者外周血D NA腺嘌呤N 6甲基化(6 mA)修饰的水平,从而探讨6 mA修饰与P C a的关系,为P C a寻找新的诊断和预后标志物。方法 分别检测P C a组与对照组的外周血6 mA,筛选差异基因6 mA热点,通过生物信息学分析方法,在全基因组范围对疾病相关位点进行筛选与鉴定。结果 与正常组比较,P C a组中6 mA表达上调基因有2 5 5 8个,表达下调基因有1 1 0 6个,主要分布在内含子上。功能富集与信号通路富集分析结果显示,钙离子信号通路和T细胞受体信号通路富集倍数最高,此通路中P L C G 1、I T P R 1、P P P 3 C和C AMK 2等上调基因与上游T细胞受体调控基因共同作用调控钙离子信号转导。结论 钙离子信号通路和T细胞受体信号通路6 mA修饰异常可能与P C a的发生、发展相关。【关键词】前列腺癌;表观修饰;D NA腺嘌呤N 6甲基化;T细胞受体信号T h e D N A a d e n i n e N 6 m e t h y l a t i o n m o d i f i c a t i o n o f p e r i p h e r a l b l o o d i n p a t i e n t s w i t h p r o s t a t e c a r c i n o m aL I F e n g y a n,ZHU P e n g,WU J u n l i n,L I U H o n g,P AN W e i b i n g.C l i n i c a l L a b o r a t o r y o f S h e n z-h e n P i n g s h a n D i s t r i c t P e o p l e s H o s p i t a l,S h e n z h e n 5 1 8 1 1 8,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r:P AN W e i b i n g,E-m a i l:5 4 x y z 1 6 3.c o m【A b s t r a c t】O b j e c t i v e W e a n a l y z e d t h e l e v e l o f D NA a d e n i n e N 6 m e t h y l a t i o n(6 mA)i n p e-r i p h e r a l b l o o d f r o m p a t i e n t s w i t h p r o s t a t e c a n c e r(P C a),s o a s t o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n 6 mA a n d P C a,a n d t o s e a r c h f o r n e w d i a g n o s t i c a n d p r o g n o s t i c m a r k e r s f o r P C a.M e t h o d s P e-r i p h e r a l b l o o d w a s i s o l a t e d f r o m P C a a n d n e g a t i v e c o n t r o l(N C)g r o u p s,a n d w a s s e n t e n c e d t o s c r e e n d i f f e r e n t i a l g e n e s w i t h 6 mA p e a k.T h r o u g h b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s,d i s e a s e-r e l a t e d l o c i w a s i d e n t i-f i e d b y g e n o m e-w i d e s t u d y.R e s u l t s T h e r e w e r e 2 5 5 8 u p-r e g u l a t e d 6 mA g e n e s a n d 1 1 0 6 d o w n-r e g u l a t e d 6 mA g e n e s i n P C a g r o u p,m a i n l y d i s t r i b u t e d i n i n t r o n s.U s i n g G O e n r i c h m e n t a n d K E G G s i g n a l i n g p a t h w a y a n a l y s i s,t h e d i f f e r e n t i a l 6 mA-a s s o c i a t e d g e n e s w e r e m a i n l y e n r i c h e d i n c a l c i u m s i g n a l i n g p a t h w a y a n d T c e l l r e c e p t o r s i g n a l i n g p a t h w a y.I n t h i s p a t h w a y,u p-r e g u l a t e d g e n e s s u c h a s P L C G 1,I T P R 1,P P P 3 C,C AMK 2 i n t e r a c t w i t h u p s t r e a m T c e l l r e c e p t o r r e g u l a t o r y g e n e s t o r e g-u l a t e c a l c i u m s i g n a l t r a n s d u c t i o n.C o n c l u s i o n s A b n o r m a l m o d i f i c a t i o n o f c a l c i u m s i g n a l i n g p a t h-w a y a n d T c e l l r e c e p t o r s i g n a l i n g p a t h w a y 6 mA m a y b e c l o s e l y r e l a t e d t o t h e o c c u r r e n c e a n d d e v e l o p-m e n t o f P C a.【K e y w o r d s】P r o s t a t e c a n c e r;E p i g e n e t i c m o d i f i c a t i o n;D NA a d e n i n e N 6 m e t h y l a t i o n;T c e l l r e c e p t o r s i g n a l i n g 前列腺癌(p r o s t a t e c a n c e r,P C a)是发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤,近年来,我国罹患P C a人数呈逐年递增趋势,仅次于肺癌1。鉴于当前P C a的发病率和死亡率不断升高,亟需探索更加有效的P C a诊疗方法2-3。有研究表明,疾病的发生与机体的生物代谢过程 主要受到遗 传和 表 观 遗 传 的 调控4。D NA序列上的甲基化修饰也是一种主要的表观遗 传 学 调 控 机 制。有 研 究 报 道,人 类D NA C p G二核苷酸胞嘧啶第五位碳原子结合甲基常导致抑癌基因、修复、细胞周期调控等基因表达沉默,922现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 3年8月第1 5卷第4期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,A u g u s t 2 0 2 3,V o l 1 5,N o.4也与P C a的发生密切相关5。有研究发现,在真核生物D NA中存在腺嘌呤第六位氮原子上甲基化修饰(N 6-m e t h y l a t i o n,6 mA),并且发现6 mA在生物生长发育过程中具有重要的调控作用6。目前,在P C a发病机制的研究中尚未见到关于D NA 6 mA修饰的报道。本研究通过N 6-甲基腺嘌呤免疫共沉淀测序技术(N 6-m e t h y l a d e n o s i n e I mm u n o p r e c i p i-t a t i o n S e q u e n c i n g,6 mA-I P S e q)和生物信息学分析比较P C a患者和健康人类外周血D NA 6 mA之间的表达水平和生物学功能差异,进而探讨P C a的发生、发展机制,为P C a的诊断和治疗寻找新靶标。材料与方法一、一般资料本研究的实验样本来自2 0 2 1年1月至8月于我院就诊的P C a患者和同时期体检结果正常的健康人群各1 0例。患者年龄5 3 7 4岁,平均(6 3.5 0 9.5 0)岁,均行直肠指检、经直肠前列腺B超、P S A和病理等检查明确符合P C a早期诊断且无转移。P C a患者无其他癌症或自身免疫性疾病。本研究经医院伦理委员会批准,且所有参与者均知情同意。二、实验方法1.全血标本收集:抽取所有研究对象的空腹外周静脉血12 m l,使用乙二胺四乙酸盐抗凝后置于-8 0 保存。2.D NA样本的制备:将样本分为P C a组和对照(N C)组。分别取适量的血样本,采用D NA提取试剂盒(美国赛默飞公司)提取D NA。采用N a n o-D r o p 2 0 0 0微量分光光度计检测D NA提取纯度,若吸光度2 6 0/2 8 0比值在1.82.0范围内则认为样本纯度较高;使用Q u b i t荧光光度计检测浓度(1 n g/l);采 用 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 验D NA完 整 性(1 0 05 0 0 b p)。3.建库和测序:随机打断D NA,将一部分D NA不共沉淀作为对比(I n p u t),一部分D NA用来免疫共沉淀(I P)。采用a n t i-6 mA抗体进行I P反应特异性地富集目的蛋白结合的D NA片段,对共沉淀获得的目标序列进行末端修复,加碱基A、测序接头,进行聚合酶链式反应扩增,最后进行片段筛选获得目标长度的6 mA-I P S e q文库,可获得P C a-I n p u t、P C a-I P、N C-I n p u t和N C-I P共4个文库。构建好的文库经过文库质控合格后,采用H i s e q 2 5 0 0测序平台(美国I l l u m i n a公司)对文库进行H i S e q测序。4.数据的过滤和对比:分析数据需要对原始序列进行过滤,去除原始序列的测序接头序列以及低质量 序 列,得 到 高 质 量 的 待 分 析 数 据(C l e a n R e a d s)。通过P h r e d数值预测碱基发生错误的概率,当碱基质量值(Q-S c o r e)3 0、碱基正确识别率达9 9.9%时,则提示本次实验C l e a n R e a d s碱基质量较高。采用B o w t i e 2软件将获取的C l e a n R e a d s进行对比,得到基因上的定位信息。5.统计6 mA-I P S e q测序C l e a n R e a d s在全基因组的分布:采用MA C S软件基于已定义的分析模型扫描全基因组的6 mA富集区域(P e a k s),可以预测P e a k s的位置和序列等。对预测出来的P e a k s采用P o i s s o n分布计算每个C l e a n R e a d s的P值。当P0.0 0 0 0 1时,认为此区域是一个P e a k s。采用MEME和D R EME软件检测前1 0 0 0个P e a k s序列中显著的模体序列并进行模体分析,检测最为可能的模体,筛选条件为每一个模体在每条序列至多出现1次,并且允许模体出现在其互补链上。三、生物信息学分析利用D AV I D数 据 库(h t t p s:/d a v i d.n c i f c r f.g o v/h o m e.j s p)进行富集分析,通过基因本体(G e n e O n t o l o g y,GO)分析对甲基化差异明显的基因分别进行分子功能、生物学过程和细胞组分富集;通过京都基因和基因组百科全书(K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s,K E G G)进行信号通路分析,将分析结果进行F i s h e r检验,选择差异有统计学意义(P3 0,碱基正确识别率达9 9.9%以 上,这 说 明 本 次 实 验 获 得 的C l e a n R e a d s碱基质量较高。P C a-I P和N C-I P两组样本中分别检测到4 6 1 8 4 5 0 1个C l e a n R e a d s和4 5 5 5 8 3 1 2个C l e a n R e a d s,见表1。P C a组样本中富集热点主要分布在D o w n s t r e a m 2 k、E x o n s、I n t e r g e n i c、I n t r o n s、U p s t r e a m 2 k、UT R 3和UT R 5等基因功能元件上,其中在I n t r o n s上甲基化水平最高,见图1。6 mA表达上调基因有2 5 5 8个,6 mA表达下调基因有1 1 0 6个,见图2。032现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 3年8月第1 5卷第4期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,A u g u s t 2 0 2 3,V o l 1 5,N o.4表1 测序结果的比对统计项目N C-I PN C-I n p u tP C a-I PP C a-I n p u t总C l e a n R e a d s4 5 5 5 8 3 1 24 9 2 6 3 9 4 14 6 1 8 4 5 0 14 6 9 5 4 4 2 2唯一位置上的C l e a n R e a d s数2 6 0 2 9 9 5 83 5 6 5 0 6 8 82 5 8 0 9 0 1 93 3 9 9 5 7 8 6唯一位置的C l e a n R e a d s数的比例(%)5 7.1 47 2.3 75 5.8 87 2.4 0多个位置的C l e a n R e a d s数1 7 2 4 7 1 4 31 3 1 8 2 8 5 61 7 9 8 4 2 7 41 2 5 2 6 2 5 9多个位置的C l e a n R e a d s数的比例(%)3 7.8 62 6.7 63 8.9 42 6.6 8对比到基因组位置上C l e a n R e a d s数的比例(%)9 4.9 99 9.1 39 4.8 29 9.0 8A:4组数据获得的C l e a n R e a d s在基因功能元件上的分布;B:两组样本基因功能元件上的甲基化分布情况图1 P e a k s在基因功能元件上分布情况图2 P C a组和N C组相关基因文氏图 二、两组样本6 mA的模体分析模体是蛋白质分子中一种具有特定空间构象和特定功能的结构成分,每个模体都以其特征性的氨基酸序列与转录因子和组蛋白等结合,从而发挥独特的功能。因此,转录因子和组蛋白与D NA的结合并不是随机的,而是有一定的序列偏好性。与N C组 相 比,P C a组 中 比 较 常 见 的 修 饰 模 体 为MA 0 5长模体,见图3 A、B;通过短模体分析,在N C组和P C a组中分别筛选出1 4个和1 6个修饰序列,并且发现N C组与P C a组中6 mA修饰多位于AG碱基富集的位点,见图3 C、D。A:P C a组6 mA修饰的MA 0 5长模体;B:N C组6 mA修饰的长模体;C:N C组的6 mA易甲基化位点;D:P C a组的6 mA易甲基化位点图3 P C a组与N C组D NA 6 mA模体分析结果132现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 3年8月第1 5卷第4期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,A u g u s t 2 0 2 3,V o l 1 5,N o.4 三、GO功能富集分析本研究通过细胞成分、生物过程和分子功能3个层面对差异基因进行了G O功能富集分析。结果表明,这些差异基因主要涉及细胞核、核质、细胞膜、细胞质和染色体等细胞组分。与N C组相比,P C a组中的差异基因调控主要包括离子结合、金属离子结合等分子功能,6 m A下调基因参与转移酶活性、转移含磷基团和黄素腺嘌呤二核苷酸结合等分子功能,见表2。此外,这些差异基因主要涉及细胞成分组织的调节、单一生物过程以及生物调控等生物过程,见表3。表2 6 mA表达水平变化显著基因涉及分子功能G O条目 描述富集倍数q值表达水平G O:0 0 4 3 1 6 9阳离子结合50.0 1上调G O:0 0 4 6 8 7 2金属离子结合50.0 1上调G O:0 0 4 3 1 6 7离子结合60.0 1上调G O:0 0 1 6 7 4 0转移酶活性30.0 5下调G O:0 0 1 6 7 7 2转移酶活性,转移含磷基团20.0 5下调G O:0 0 5 0 6 6 0与黄酮腺嘌呤二核苷酸结合20.0 5下调 注:q值为多重检验校正的P值表3 6 mA表达水平变化显著基因参与生物过程G O条目 描述富集倍数q值表达水平G O:0 0 5 1 1 2 8细胞成分组织的调节60.0 5上调G O:0 0 4 4 6 9 9单一的生物过程60.0 1下调G O:0 0 4 4 7 6 3单个有机体细胞过程60.0 1下调G O:0 0 6 5 0 0 7生物调节50.0 5下调 注:q值为多重检验校正的P值 四、K E G G信号通路富集分析通过K E G G信号通路富集分析发现,富集倍数大于5倍的差异基因主要富集在钙离子信号通路和T细胞受体信号通路,其中钙离子信号通路的富集倍数最高(图4),此通路中P L C G 1、I T P R 1、P P P 3 C和C AMK 2等上调基因与上游T细胞受体共同作用调控钙离子信号转导,见图5。图4 差异基因K E G G信号通路富集图232现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 3年8月第1 5卷第4期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,A u g u s t 2 0 2 3,V o l 1 5,N o.4图5 钙离子信号通路中P L C G 1、I T P R 1、P P P 3 C和C AMK 2等上调基因与上游T细胞受体共同作用调控钙离子信号转导讨 论P C a早期症状隐匿,常无明显临床症状,国内很多患者确诊时已发生局部进展或转移。目前公认的早期诊断方式包括经直肠超声检查和血清P S A检测。直肠超声检查的诊断阳性率较低,而血清P S A虽然敏感性较佳,但特异性较低,尤其是在P S A诊断灰区(P S A 41 0 n g/m l),前列腺穿刺阳性率不到3 0%1 1-1 2。这种情况导致临床上产生大量不必要的穿刺,增加了社会的经济负担和患者的心理压力。因此,寻找新的生物学靶标用于P C a的癌变监测和干预是目前亟待解决的问题。据统计,遗传因素是P C a的主要致病因素1 3。因此,深入研究P C a的遗传机制具有非常重要的意义。尽管已有研究报道了P C a相关的癌基因、抑癌基因以及相关肿瘤信号通路,但其发病机制尚未完全清楚。近年来,随着测序技术的发展,D NA甲基化在疾病发病机制中的作用逐渐受到关注。6 mA在基因复制、修复和表达调控等方面发挥着重要的作用1 4。S h e n g等1 5研究发现三阴乳腺癌(t r i p l e n e g a t i v e b r e a s t c a n c e r,T N B C)癌 组 织 中6 mA表 达 水 平 下 调,同 时 在T N B C细胞系MD A-MB-2 3 1中发现6 mA水平增高可以有效影响T N B C的耐药性,并指出6 mA可能作为T N B C诊疗的新标志物。C u i等1 6研究报道6 mA的密度与基因转录的激活有关,在肝细胞癌中重复序列的6 mA密度降低。因此,D NA 6 mA甲基化修饰也可能是一种潜在的癌症诊断和治疗的生物标志物。C h e n等1 7研究发现D NA 6 mA表观遗传修饰在人类食管鳞状细胞癌中增加,可作为预后标志 物。本 研 究 通 过6 mA-I P S e q技 术 绘 制 了P C a的6 mA图谱,深入了解P C a的发病机制,期望能为P C a的早期诊断、干预和治疗带来新的契机。本研究应用6 m A-I P S e q检测P C a组和N C组的全血样本,并获得了高质量的C l e a n R e a d s碱基。P C a-I P和N C-I P两组样本中分别检测到4 6 1 8 4 5 0 1个C l e a n R e a d s和4 5 5 5 8 3 1 2个C l e a n R e a d s,可见两组样本在碱基数量上相当,但结果显示6 mA富集热点主要 分 布 在D o w n s t r e a m 2 k、E x o n s、I n t e r g e n i c、I n-t r o n s、U p s t r e a m 2 k、UT R 3和UT R 5等基因功能元件上,其中内含子上的甲基化水平最高。此外,本研究还发现了6 mA表达上调基因有2 5 5 8个,6 mA表达下调基因有1 1 0 6个。本研究模体分析中,发现MA 0 5长模体是N C组与P C a组中常见的修饰模体,该模体与一种锌指结构蛋白的结合元件(Z N F 2 6 3)极为相似。Z N F 2 6 3是调控多种基因生物作用的顺式作用元件1 8-1 9,张林峰等2 0的研究发现,血管瘤Z N F 2 6 3模体上6 mA修饰水平高于癌旁正常皮肤组织。比较N C组与P C a组6 mA修饰的短模体,筛选出N C组有1 4个被修饰序列,P C a组有1 6个被修饰序列。通过短模体分析发现,N C组与P C a组6 mA修饰多位于AG富集的位点上,这与已有文献的结果一致1 9-2 1。332现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 3年8月第1 5卷第4期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,A u g u s t 2 0 2 3,V o l 1 5,N o.4GO富集分析结果显示,本研究发现差异基因主要涉及细胞核、核质、细胞膜、细胞质和染色体等细胞组分。李猷等2 2利用G E O数据库的4个P C a基因芯片数据集进行差异甲基化基因的筛选,GO富集主要表现在细胞质、质膜、胞浆等细胞组分,这与本研究分析结果基本一致。此外,我们在前期研究中发现T淋巴细胞受体在P C a抗原识别免疫应答中发挥了重要作用,其多样性与宿主免疫反应以及肿瘤预后的判断密切相关2 3。与N C组相比,P C a组6 mA下调基因参与转移酶活性、转移含磷基团和黄素腺嘌呤二核苷酸结合等分子功能。有研究报道,6 mA在调控D NA复制、修复、转座和转录中起着重要作用,我们前期的研究也得出了同样的结论1 4,2 4。本研究结果与已有报道基本相符。在P C a组中,6 mA上调基因主要包括离子结合、金属离子结合等分子功能。此外,通过K E G G信号通路富集分析,我们发现富集倍数大于5倍的差异基因主要富集在钙离子信号通路和T细胞受体信号等通路,其中钙离子信号通路的富集倍数最高。在此通 路 中,上 调 基 因P L C G 1、I T P R 1、P P P 3 C和C AMK 2等与上游T细胞受体调控基因共同作用调控钙离子信号转导。据M a l y等2 5研究报道,钙离子的信号转导在P C a细胞侵袭与转移中发挥了重要作用。T细胞在P C a免疫微环境中起着核心作用2 6。我们在前期研究中对P C a患者肿瘤组织和癌旁组织中T细胞受体库的克隆多样性进行了研究,发现与癌旁组织相比P C a癌组织有更高度的扩增克隆,进一步探讨了T细胞在P C a发病机制中的作用2 7。由此,我们进一步推测6 mA甲基化可能在P C a发生、发展中发挥重要的作用。本研究使用6 mA-I P S e q技术对P C a患者外周血中D NA进行分析,初步筛选出了与P C a相关的差异6 mA甲基化基因位点。在GO富集和K E G G信号通路中,钙离子信号通路和T细胞受体信号通路富集倍数最高,并且上调基因与上游T细胞受体调控基因共同参与调控钙离子信号转导,这些异常6 mA修饰的基因可能与P C a的发生、发展密切相关。未来我们将结合生物信息学的筛选方法对候选基因进行进一步研究,并对其甲基化程度及位点进行验证,以期发现与P C a相关的特异性基因,为P C a的预测和诊断提供新的思路和线索。参 考 文 献1 R a w l a P.E p i d e m i o l o g y o f P r o s t a t e C a n c e rJ.W o r l d J O n-c o l,2 0 1 9,1 0(2):6 3-8 9.2 徐思琪,李红胜,吴晓燕,等.异常甲基化的原钙黏蛋白7对雄激素非依赖性前列腺癌细胞生长的影响J.江苏医药,2 0 2 0,4 6(9):8 6 5-8 6 8.3 S c o t t E,M u n k l e y J.G l y c a n s a s B i o m a r k e r s i n P r o s t a t e C a n c e rJ.I n t J M o l S c i,2 0 1 9,2 0(6):1 3 8 9.4 L i m J H,L e e B Y,K i m J W,e t a l.E v a l u a t i o n o f e x t r a c t i o n m e t h o d s f o r m e t h y l a t e d c e l l-f r e e f e t a l D NA f r o m m a t e r n a l p l a s m aJ.J A s s i s t R e p r o d G e n e t,2 0 1 8,3 5(4):6 3 7-6 4 1.5 W a n g Q,W a n g G,L i u C,e t a l.P r o g n o s t i c v a l u e o f C p G i s-l a n d m e t h y l a t o r p h e n o t y p e a m o n g h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a p a t i e n t s:A s y s t e m a t i c r e v i e w a n d m e t a-a n a l y s i sJ.I n t J S u r g,2 0 1 8,5 4(P t A):9 2-9 9.6 F r a m e FM,M a i t l a n d N J.E p i g e n e t i c C o n t r o l o f G e n e E x-p r e s s i o n i n t h e N o r m a l a n d M a l i g n a n t H u m a n P r o s t a t e:A R a p i d R e s p o n s e Wh i c h P r o m o t e s T h e r a p e u t i c R e s i s t a n c eJ.I n t J M o l S c i,2 0 1 9,2 0(1 0):2 4 3 7.7 周朴帆,沈瑞林,熊烈,等.前列腺癌相关生物标志物的研究进展J.中华老年多器官疾病杂志,2 0 2 1,2 0(1):7 2-7 6.8 B o s e t t i C,B e r t u c c i o P,M a l v e z z i M,e t a l.C a n c e r m o r t a l i t y i n E u r o p e,2 0 0 5-2 0 0 9,a n d a n o v e r v i e w o f t r e n d s s i n c e 1 9 8 0J.A n n O n c o l,2 0 1 3,2 4(1 0):2 6 5 7-2 6 7 1.9 M a l v e z z i M,B e r t u c c i o P,R o s s o T,e t a l.E u r o p e a n c a n c e r m o r t a l i t y p r e d i c t i o n s f o r t h e y e a r 2 0 1 5:d o e s l u n g c a n c e r h a v e t h e h i g h e s t d e a t h r a t e i n E U w o m e n?J.A n n O n c o l,2 0 1 5,2 6(4):7 7 9-7 8 6.1 0 S i e g e l R L,M i l l e r K D,J e m a l A.C a n c e r s t a t i s t i c s,2 0 1 5J.C A C a n c e r J C l i n,2 0 1 5,6 5(1):5-2 9.1 1 G a o J B,S a n n E E,W a n g X Y,e t a l.V i s u a l d e t e c t i o n o f t h e p r o s t a t e s p e c i f i c a n t i g e n v i a a s a n d w i c h i mm u n o a s s a y a n d b y u s i n g a s u p e r w e t t a b l e c h i p c o a t e d w i t h p H-r e s p o n s i v e s i l i c a n a n o p a r t i c l e sJ.M i k r o c h i m A c t a,2 0 1 9,1 8 6(8):5 5 0.1 2 T h e E N C O D E P r o j e c t C o n s o r t i u m.I d e n t i f i c a t i o n a n d a n a l y-s i s o f f u n c t i o n a l e l e m e n t s i n 1%o f t h e h u m a n g e n o m e b y t h e E N C O D E p i l o t p r o j e c tJ.N a t u r e,2 0 0 7,4 4 7(7 1 4 6):7 9 9-8 1 6.1 3 P a u l i A,R i n n J L,S c h i e r A F.N o n-c o d i n g R NA s a s r e g u l a-t o r s o f e m b r y o g e n e s i sJ.N a t R e v G e n e t,2 0 1 1,1 2(2):1 3 6-1 4 9.1 4 H a o Z,W u T,C u i X,e t a l.N6-D e o x y a d e n o s i n e M e t h y l a t i o n i n M a mm a l i a n M i t o c h o n d r i a l D NAJ.M o l C e l l,2 0 2 0,7 8(3):3 8 2-3 9 5.e 8.1 5 S h e n g X,W a n g J,G u o Y,e t a l.D NA N 6-M e t h y l a d e n i n e(6 mA)M o d i f i c a t i o n R e g u l a t e s D r u g R e s i s t a n c e i n T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e rJ.F r o n t O n c o l,2 0 2 1,1 0:6 1 6 0 9 8.1 6 C u i H,R o n g W,M a J,e t a l.D NA N 6-A d e n i n e m e t h y l a t i o n i n H B V-r e l a t e d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m aJ.G e n e,2 0 2 2,8 2 2:1 4 6 3 5 3.1 7 C h e n L,Z h a n g M,G u o M,e t a l.D NA N 6-m e t h y l a d e n i n e i n c r e a s e d i n h u m a n e s o p h a g e a l s q u a m o u s c e l l c a r c i n o m aJ.D i s c o v M e d,2 0 2 0,2 9(1 5 7):8 5-9 0.1 8 L i u J,Z h u Y,L u o G Z,e t a l.A b u n d a n t D NA 6 mA m e t h y l a-t i o n d u r i n g e a r l y e m b r y o g e n e s i s o f z e b r a f i s h a n d p i gJ.N a t C o mm u n,2 0 1 6,7:1 3 0 5 2.432现代泌尿生殖肿瘤杂志2 0 2 3年8月第1 5卷第4期 J C o n t e m p U r o l R e p r o d O n c o l,A u g u s t 2 0 2 3,V o l 1 5,N o.41 9 F r i e t z e S,L a n X,J i n V X,e t a l.G e n o m i c t a r g e t s o f t h e K R A B a n d S C AN d o m a i n-c o n t a i n i n g z i n c f i n g e r p r o t e i n 2 6 3J.J B i o l C h e m,2 0 1 0,2 8 5(2):1 3 9 3-1 4 0 3.2