液相色谱法在测定粮食作物中真菌类毒素的应用研究.pdf

Analysis and Testing175XIANDAISHIPIN现代食品分析检测doi:10.16736/41-1434/ts.2023.20.056作者简介：梁辉（1993），男，本科，助理工程师，研究方向为粮油真菌毒素。粮食安全关系国计民生，粮食作物的品质和安全是保障粮食安全的关键环节1。作为真菌类微生物的有害代谢产物，真菌类毒素是粮食作物中常见的一类有害物质，严重威胁着人类和动物健康2。因此，对粮食作物中真菌类毒素的准确测定显得尤为重要。液相色谱法是一种基于液体为流动相的色谱技术，具有高分辨率、高灵敏度等优点。在毒素测定领域，液相色谱法已被广泛应用于多种毒素的分析，如真菌类毒素、有机磷农药、重金属等3。真菌类毒素是一类由真菌产生的有毒代谢产物。其中，黄曲霉毒素 B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是粮食作物中最常见的3 种真菌毒素4-5。本研究利用液相色谱串联紫外和液相色谱法在测定粮食作物中真菌类毒素的应用研究Study on the Application of Liquid Chromatography in the Determination of Mycotoxoids in Grain Crops 梁 辉（海南省粮油产品质量监督检验站，海南 海口 570203）LIANG Hui(Hainan Provincial Grain and Oil Product Quality Supervision and Inspection Station,Haikou 570203,China)摘要：液相色谱法是一种高效、灵敏度高的分析方法，被广泛应用于食品、药品、环境等领域。本研究建立了一种同时测定粮食作物中黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的液相色谱方法。结果表明，该方法快速、准确可靠。关键词：粮食作物；真菌类毒素；液相色谱法；应用Abstract：Liquid chromatography is an efficient and sensitive analytical method widely used in fields such as food,medicine,and the environment.This study established a liquid chromatography method for the simultaneous determination of aflatoxin B1,zearalenone,and deoxynivalenol in food crops.The method is fast,accurate and reliable.Keywords：food crops;mycotoxoids;liquid chromatography;application中图分类号：R155.5176现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing荧光检测器，对 3 种真菌类毒素进行检测，旨在为粮食产品的检验检测提供可靠依据。1 材料与方法1.1 仪器与试剂1290 型高效液相色谱仪（配制荧光检测器和紫外检测器）；JOANLAB 轨道式振荡器；SHZ-D()型循环水真空泵；MS204S 型电子天平；Milli Q 超纯水器；TG18G-型高速离心机；黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液购自国家标准物质平台；水为超纯水；乙腈购自默克股份两合公司。1.2 样品来源在市场上购买所需粮食样品。1.3 实验方法1.3.1 样品的制备称取 50.0 g 粉碎后粮食样品于 250 mL 磨口具塞三角瓶中，加入 80%乙腈 100 mL，振荡提取30 min（300 rmin-1）；取滤液 50 mL 置离心管中（5 000 rmin-1），离心 5 min。取滤液 10 mL，加水40 mL，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤，备用。取 20.0 mL 上述提取滤液，以 1.52 mLmin-1流速缓慢通过免疫亲和柱。以 10 mL 水淋洗柱子 2 次，弃去全部流出液，并使部分空气通过柱体。准确加入1.0 mL 乙腈洗脱，流速控制为 12 mLmin-1，收集全部洗脱液于样品瓶中，氮气吹干。用 20%乙腈溶解混匀后，过 0.22 m 滤膜，待液相色谱测定。1.3.2 标准溶液的配置精密量取黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液适量，用色谱纯乙腈稀释制成含各标准品 100 gmL-1的混合标准品溶液。1.3.3 主要仪器参数色 谱 条 件：色 谱 柱 选 择 Diamonsil C18，250 4.6 mm，5 m；柱温：30；进样量：20 L；流速：1.0 mLmin-1；VWD 检测器波长为 220 nm；荧光检测器激发波长 305 nm，发射波长 460 nm；流动相：乙腈和 0.1%乙酸溶液。洗脱程序见表 1。表 1 洗脱程序表时间/minA（乙腈）/%B（0.1%乙酸）/%020805505010802020802020.120802520801.3.4 标准曲线的绘制分 别 用 刻 度 管 移 取 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.00 mL 混合标准品溶液于 20 mL 的容量瓶中，分别用乙腈溶液定容，得到一系列不同浓度的标准溶液。浓度分别为 1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 gmL-1的标准曲线系列溶液。分别精密量取各标准曲线系列溶液各 20 L，在拟定的液相色谱条件下进样分析，记录峰面积。以真菌毒素的浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标进行线性回归，获得标准曲线。1.3.5 检测限与定量限取混合标准品溶液拟定的色谱条件下进行分析，根据分析结果逐级稀释样品浓度，分别测定黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。1.3.6 加标回收率测定称取 50.0 g 粉碎后粮食样品于 250 mL 磨口具塞三角瓶中，分别加入混合标准品溶液。照“1.3.1”进行样品处理，并将制备好的样品进行液相色谱测定。1.3.7 样品的重复性的测定照“1.3.1”项下方法，处理样品并测定粮食样品中的黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。2 结果与分析2.1 标准曲线、检测限和定量限的测定结果黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定结果见表 2。在拟定的色谱条件下，黄曲霉毒素 B1在 1.0150.30 gmL-1范围内，线性方程为y=12 139x-2 703.2，R2=0.999 8；玉米赤霉烯酮在 1.0250.75 gmL-1范围内，线性方程为y=495.28x-85.947，R2=0.999 9；脱氧雪腐镰刀菌烯Analysis and Testing177XIANDAISHIPIN现代食品分析检测醇在 1.0251.15 gmL-1范围内，线性方程为y=26.292x+10.985，R2=0.998 4。2.2 样品的加标回收率测定结果黄 曲 霉 毒 素 B1、玉 米 赤 霉 烯 酮 和 脱 氧 雪腐 镰 刀 菌 烯 醇 的 加 标 回 收 率 结 果 见 表 3。结 果显 示，本 方 法 测 定 各 添 加 剂 的 加 标 回 收 率 在97.02%101.95%范围内，测定结果的 RSD 值均小于 5%。因此，用本方法测定粮食样品中黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇准确度良好。表 2 标准曲线数据表组分线性方程R2检出限 gmL-1定量限 gmL-1线性范围 gmL-1黄曲霉毒素 B1y=12 139x-2 703.20.999 80.210.631.01 50.30玉米赤霉烯酮y=495.28x-85.9470.999 90.310.931.02 50.75脱氧雪腐镰刀菌烯醇y=26.292x+10.9850.998 40.120.361.02 51.152.3 样品的重复性测定结果采用本方法，对“1.3.8”中加标回收率样品连续测定 6 次，测定结果见表 4。表 4 样品的重复性测定结果表样品黄曲霉毒素B1（gg-1）玉米赤霉烯酮（gg-1）脱氧雪腐镰刀菌烯醇（gg-1）15.115.055.0325.394.974.9535.365.175.1845.215.325.0755.025.195.3265.365.085.21RSD（%）2.932.412.64从表4的测定结果看出，对同一样品连续测定6次，黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定结果的 RSD 分别为 2.93%、2.41%和 2.64%，均小于 5%。因此，本方法测定样品的重复性良好。3 结语本研究建立了一种同时测定粮食作物中黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的液相色谱方法。通过对定量分析方法的验证，得到以下结论：所测定的 3 种真菌毒素类化合物的线性关系良好，R2均大于 0.990。3 种真菌毒素中，检测限浓度最高为 0.31 gmL-1，定量限浓度最高为 0.93 gmL-1，表明该方法灵敏度较高。本方法测定黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的加标回收率为 97.02%101.95%，测定结果的 RSD 值均小于 5%。对同一样品连续测定 6 次，黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定结果的 RSD 分别为2.93%、2.41%和 2.64%，均小于 5%，表明该方法测定样品的重复性良好。综上所述，本研究结果能够为粮食产品提供更好的安全保障，对于粮食作物中真菌类毒素的检测和控制具有重要意义。参考文献1 卢精蕊，张圣国，杨靖.新形势下我国粮食安全的重要性 J.河北农业，2022（12）：28-29.2 王春红，张宝善，孟泉科.常见真菌毒素对人体的危害及生物降解研究进展 J.陕西农业科学，2009，55（4）：99-101，107.3 毕瑞锋，赫秀萍.高效液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素研究进展 J.粮食与油脂，2012（3）：4.4 陈芳芳.高效液相色谱法同时检测花生中 6 种真菌毒素的方法及应用研究 D.济南：山东大学，2017.5 曾艳，张矛，陈亚，等.液相色谱-串联质谱法检测茶叶中真菌毒素的研究进展 J.食品安全质量检测学报，2022（12）：13.表 3 粮食样品的加标回收率测定结果表化合物取样量/g样品平均含量/g加标样量/g加标后平均含量/g平均回收率/%RSD/%黄曲霉毒素 B150.00.215.035.0997.022.36玉米赤霉烯酮50.00.155.085.28100.984.72脱氧雪腐镰刀菌烯醇50.00.115.125.33101.953.35