液相色谱串联质谱法测定肉制品中氯霉素.pdf

现代食品XIANDAISHIPIN182/分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.15.045液相色谱串联质谱法测定肉制品中氯霉素Determination of Chloramphenicol in Meat Products by LC-MS/MS 陈宁宁，张志然（烟台市标准计量检验检测中心，山东 烟台 264003）CHEN Ningning,ZHANG Zhiran(Yantai Standard Measurement Inspection and Testing Center,Yantai 264003,China)摘 要：建立了肉制品中氯霉素的液相色谱串联质谱检测方法。样品经均质后，用乙腈提取，正己烷脱脂，氮吹浓缩后用甲醇/水（1+1，V/V）溶解，液相色谱串联质谱法检测，内标法定量。氯霉素检测的线性范围为 0.5 10.0 ngmL-1，定量限为 0.08 gkg-1，加标回收率在 90%95%，相对标准偏差（RSD）为 3.9%9.4%。本方法缩短了样品前处理和色谱分离时间，具有准确度和灵敏度高的特点，能够满足大规模样品的快速分析。关键词：肉制品；氯霉素；前处理；液相色谱串联质谱Abstract：A liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the detection of chloramphenicol in meat products has been established.After homogenization,the sample was extracted with acetonitrile,defatted with n-hexane,concentrated with nitrogen blowing,dissolved in methanol/water(1+1,V/V),detected by liquid chromatography tandem mass spectrometry,and quantified by internal standard method.The linear range for chloramphenicol detection is 0.5 10.0 ngmL-1,with a quantification limit of 0.08 gkg-1,with a recovery rate of 90%95%and a relative standard deviation(RSD)of 3.9%9.4%.This method shortens sample pre-treatment and chromatographic separation time,has high accuracy and sensitivity,and can be used for rapid analysis of large-scale samples.Keywords：meat products;chloramphenicol;pretreatment;liquid chromatography tandem mass spectrometry中图分类号：O657.63氯霉素是一种抑菌性广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对立克次体、衣原体也有抑制作用1。因其高效廉价，曾在畜牧业中广为应用2。然而由于其对造血系统有严重的不良反应，且细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，所以对其使用已经做出严格控制，国家全面禁止将氯霉素用于所有食品动物3。我国发布的食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第五批）（整顿办函20111 号）中将氯霉素列为在肉制品中可能违法添加的非食用物质，在肉制品中不得检出。肉 制 品 中 氯 霉 素 的 国 家 标 准 检 测 方 法 为 GB/T 223382008，包括气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱/质谱法4。两种方法的前处理均较为复杂，存在步骤烦琐、耗时长的问题。本文旨在通过简化、优化液相色谱串联质谱法的前处理过程，在满足检验需求的基础上提高检测效率，节约检测时间，减少试剂的使用。1 材料与方法1.1 材料与设备样品：肉制品，市售。作者简介：陈宁宁（1991），女，硕士，工程师，研究方向为食品检测。通信作者：张志然（1969），女，本科，高级工程师，研究方向为食品检测。E-mail：。现代食品XIANDAISHIPIN183/分析检测AnalysisandTesting氯霉素标准溶液、氯霉素-D5 标准溶液，浓度均为 100 gmL-1，天津阿尔塔科技有限公司；实验用水为 Millipore 制 18.2 Mcm 超纯水；乙腈、甲醇，均为色谱纯，德国默克股份两合公司；正己烷（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司。LCMS-8050 液相色谱-质谱联用仪，配有电喷雾离子源，日本岛津公司；GM200 刀式研磨仪，德国Retsch（莱驰）公司；Vortex Point-2 迷你混合仪，上海力辰邦西仪器科技有限公司；KQ-500DB 数控超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公司；HC-12A 自动氮吹浓缩仪，上海安谱科学仪器有限公司；TGL20MW 台式高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司。1.2 仪器工作条件（1）色 谱 条 件。Hypersil GOLD 液 相 色 谱 柱（100 mm2.1 mm3 m）；流动相 A 为水，流动相 B 为乙腈。流动相梯度：0 1.5 min，乙腈由 5%升到 25%；1.5 2.5 min，乙腈由 25%升到 45%；2.5 3.0 min，乙腈由 45%升到 95%，保持 1 min；4.0 4.5 min 乙腈由 95%降到 5%，保持 1.5 min。流动相流速为 0.4 mLmin-1，进样量 5 L，柱温 40。（2）质谱条件。LC-MS 接口为电喷雾接口（ESI）负离子模式，检测方式为多重反应监测（MRM）。以 m/z 321.00/152.10 和 321.00/257.00 为目标物氯霉素的定性离子对，以 m/z 326.00/157.00 和 326.00/262.00为内标物氯霉素-D5 的定性离子对，分别以 m/z 321.00/152.10 和 m/z 326.00/157.00 为 氯 霉 素 和 氯 霉素-D5 的定量离子对。雾化气和干燥气为氮气，雾化气流速为 3.00 Lmin-1，干燥气流速为 5.00 Lmin-1。脱溶剂管温度为 250，加热温度为 400。碰撞能量（CE）为-25.0 eV。1.3 样品前处理称取 5 g 粉碎的肉制品于 50 mL 具塞离心管中，加入 100 ngmL-1内标溶液 100 L 和 10 mL 乙腈，在混合仪上涡旋振荡 1 min，离心取上清液，再提取一次合并提取液于分液漏斗中。加入 5 mL 乙腈饱和的正己烷，振荡 5 min，静置分层，取上清液氮气吹干。用 1 mL 甲醇/水（1+1，V/V）定容，涡旋振荡 30 s，经 0.45 m 有机相滤膜过滤后，上机待测。1.4 标准溶液配制氯霉素标准中间液（100 ngmL-1、10 ngmL-1）：氯霉素标准物质（100 gmL-1）用甲醇稀释得到；氯霉素-D5 标准中间液（100 ngmL-1）：氯霉素-D5 标准物质（100 gmL-1）用甲醇稀释得到。氯霉素标准系列溶液：氯霉素标准中间液和氯霉素-D5 标准中间液用甲醇/水（1+1，V/V）稀释得到，其中氯霉素浓度分别为 0.5 ngmL-1、1.0 ngmL-1、2.0 ngmL-1、5.0 ngmL-1、10.0 ngmL-1；内 标 氯 霉 素-D5 的浓度为 10.0 ngmL-1。2 结果与分析2.1 前处理方法的选择氯霉素液质法的样品前处理步骤一般包括提取、净化、浓缩、溶解。标准和相关文献中提取剂主要有乙腈4-5和乙酸乙酯6-7两种，本实验分别以乙腈和乙酸乙酯为提取剂进行对比实验，色谱图见图 1。比较后发现以乙腈作为提取剂时基质干扰更少、响应值更高、灵敏度更好，最后选用乙腈为提取剂。净化步骤的目的是去除脂肪和其他干扰物质，一般使用有机溶剂萃取和固相萃取，使用固相萃取柱需要淋洗液和洗脱液，且步骤多、过程烦琐，因此本实验仅使用正己烷净化。（a）乙腈为提取剂 （b）乙酸乙酯为提取剂图 1不同提取剂下氯霉素加标 0.2 gkg-1样品色谱图 现代食品XIANDAISHIPIN184/分析检测Analysis and Testing2.2 标准曲线绘制按上述仪器工作条件测定氯霉素标准溶液系列，以目标物与内标物浓度比值为横坐标，目标物与内标物的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为 y=0.073 2x+0.004 6，相关系数 r2=0.999 8，氯霉素浓度在 0.5 10.0 ngmL-1的线性关系良好。2.3检出限和定量限通过空白样品加标获得方法的检出限和定量限，加标浓度为 0.1 gkg-1时信噪比平均值为 12，逐步降低加标浓度，信噪比（RSD）约等于 10 时得出氯霉素的定量限为 0.08 gkg-1，信噪比（RSD）约等于 3 时得出氯霉素的检出限为 0.03 gkg-1。2.4 精密度和加标回收实验取空白样品进行不同水平加标回收实验，每个加标水平进行 6 次平行实验，结果如表 1 所示。由表 1可知，氯霉素的加标回收率在 90%95%，RSD 为3.9%9.4%，符合实验室质量控制规范要求。2.5 加标样品检测谱图氯霉素加标 0.6 gkg-1样品色谱图见图 2。由图 2可知，氯霉素和氯霉素-D5 出峰明显，峰形较好，与杂峰分离良好，没有明显干扰，且分析时间短。说明本方法在样品检测时可以实现良好的分离分析。表 1 精密度和加标回收实验结果表（n=6）加标量/gkg-1测定值/（gkg-1）回收率/%RDS/%123456平均值0.10.080.10.080.090.080.090.09909.40.60.610.540.530.580.580.520.56936.31.00.920.981.010.940.930.920.95953.9 （a）加标氯霉素 （b）氯霉素-D5图 2 加标 0.6 gkg-1样品的色谱图3 结论本文通过优化前处理过程，实现了肉制品中氯霉素的简单、快速、准确的检测。该方法不仅降低了检测成本，提高了检测效率，同时方法的检出限和回收率均能满足肉制品中氯霉素的分析要求。参考文献1 吴丽媛.动物源性食品氯霉素类残留检测方法概述 J.中国畜禽种业，2014，10（4）：43-44.2 赵莉云.兽药中氯霉素类抗生素的药理作用及用法用量 J.养殖技术顾问，2013（10）：175-175.3 高林.氯霉素的不良反应及其残留检测方法研究进展 J.动物医学进展，2010，31（4）：90-95.4 国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定：GB/T 223382008S.北京：中国标准出版社，2008.5 王浩，杨红梅，郭启雷.液质联用法测定牛奶中氯霉素类药物残留 J.食品研究与开发，2015（6）：74-76.6 王元凤，白亚龙，魏新林.胶体金免疫层析法检测蜂蜜中氯霉素残留的前处理方法研究 J.食品科学，2009，30（8）：267-271.7 冯雷，尹丽珠，孙文通，等.禽畜肉中氯霉素残留量的液质联用分析方法 J.食品科学，2010，31（4）：243-245.