帕拉米韦原料含量测定方法比较研究.pdf

天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第4期收稿日期：2022鄄11鄄03*通讯作者：韩晓捷，E-mail：。药品质量与检验帕拉米韦（peramivir）是一种新型抗流感病毒制剂，其具有3个可以与流感病毒糖蛋白神经氨酸酶（NA）蛋白活性位点残基相互作用的化学基团，可有效对抗A型和B型流感病毒，尤其是对扎那米韦和磷酸奥司他韦已产生耐药性变异的病毒具有良好的治疗效果，且对A型H1N1药力较B型更为有效1-5。本品可采用静脉给药途径，更容易向口服或吸入有困难的患者、丧失意志的重症患者和婴幼儿给药，在血液中浓度比扎那米韦和磷酸奥司他韦更高，保持有效活性时间更长，可更有力地拮抗病毒。帕拉米韦有望成为对抗A型H1N1药物的一颗新星6。帕拉米韦分子式为C15H28N4O4，相对分子质量为328.41。由于胍基和羧基的存在，使得帕拉米韦为极性较强的两性化合物。本文建立了非水滴定法和高效液相色谱法对帕拉米韦原料药的含量进行测定，并对2种方法进行了比较。1仪器与试药1.1仪器梅特勒托利多T50型全自动电位滴定仪，配有DGi113-SC复合玻璃pH智能电极；岛津LC-20AD型高相液相色谱仪，配有紫外检测器；安捷伦1260型高相液相色谱仪，配有二极管阵列检测器；梅特勒托利多XS205DU型十万分之一电子天平。1.2试药帕拉米韦对照品（批号101260-202203，纯度：按帕拉米韦计为85.1%，中国食品药品检定研究院）；帕拉米韦原料药（批号202201，202202，202203，均来自企业）；乙腈为色谱纯，购自默克公司。高氯酸、冰醋酸、醋酐、邻苯二甲酸氢钾基准试剂、磷酸二氢钾、三乙胺、磷酸均为分析纯；水为超纯水。2方法与结果2.1非水滴定法2.1.1高氯酸标准溶液的制备取无水冰醋酸（按含水量计算，每1 g水加入5.22 ml醋酐）750 ml，加入高氯酸（70%72%）8.5 ml，摇匀，在室温下缓慢滴加23 ml醋酐，边加边摇，加完后摇匀放冷，加无水冰醋酸适量使终体积为1 000 ml，摇匀，放置24 h，即得。2.1.2高氯酸标准溶液的标定取在105 干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢约0.16 g，精密称定，加无水冰醋酸20 ml使溶解，加结晶紫指示液1滴，摇匀，用配制好的高氯酸溶液滴定至蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。经标定，该高氯酸标准溶液的浓度为0.099 02 mol/L。帕拉米韦原料含量测定方法比较研究段玺玉，韩晓捷*（天津市药品检验研究院，天津300070）摘 要目的：建立并比较高氯酸非水滴定法和高效液相色谱法测定帕拉米韦原料药的含量。方法：非水滴定法：以无水冰醋酸为溶剂，0.1 mol/L的高氯酸滴定液为滴定剂，电位法指示滴定终点进行滴定。高效液相色谱法：采用Welch Ultimate AQ-C18（150 mm4.6 mm，5 m）色谱柱，以1 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（称取磷酸二氢钾约0.136 g溶于1 000 ml水，加入1 ml三乙胺，并以磷酸调pH 6.0）为流动相A，以乙腈为流动相B，90%A相等度洗脱10 min。流速为1.0 ml/min，柱温为40，检测器波长为210 nm，进样量为20 l。结果：两种方法均符合方法学验证要求。对同一批次样品进行测定，结果无显著性差异（P0.05）。结论：两种方法均能用于帕拉米韦含量测定，为其质量控制提供依据，且各有优势。可根据实际情况和需求选择相应的方法。关键词原料药；帕拉米韦；含量测定；非水滴定法；高效液相色谱法中图分类号：R927.2文献标识：A文章编号：1006-5687（2023）04-0007-067天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第4期2.1.3滴定方法的选择和滴定曲线的绘制帕拉米韦结构中同时含有碱性的胍基和酸性的羧基，但总体表现为弱碱性，在水溶液中直接滴定无明显突跃，而在非水酸性介质中其碱性显著增强，从而能够出现明显突跃7，并且帕拉米韦在酸性介质中溶解性较好。所以本研究选择以无水冰醋酸为溶剂，采用高氯酸非水滴定对帕拉米韦含量进行测定。在高氯酸非水滴定过程中，采用电位滴定法进行滴定终点的判断。并考查了结晶紫指示剂，在等当点前后溶液颜色的变化情况。滴定曲线如图1所示，一阶导数图见图2。由图1可知，本方法滴定突跃大，终点颜色变化明显（从紫色蓝色），指示剂法判断滴定终点与电位滴定结果一致，本研究选择电位法指示终点。2.1.4重复性试验取帕拉米韦（202201）6份，各0.15 g，精密称定，加40 ml无水冰醋酸使溶解后进行滴定，计算帕拉米韦的含量平均值为100.67%，RSD为0.03%，结果表明，方法重复性良好。2.1.5中间精密度试验由2名分析人员在不同时间各对6份供试品进行测定，对2次试验共12个测定结果进行分析以判断方法的精密度。计算帕拉米韦的含量平均值为100.69%，RSD为0.04%，结果表明，方法中间精密度性良好。2.1.6准确度试验取帕拉米韦（批号202201），按照配制供试品溶液称样量的80%、100%和120%称样，精密称定，每个水平称取3份。分别加入无水冰醋酸40 ml使溶解后进行滴定，计算帕拉米韦的回收率（回收率%=测得量/加入量100%），结果平均回收率为99.89%，RSD为0.11%，见表1。结果表明，该方法准确度良好。2.1.7溶液稳定性试验取帕拉米韦（批号202201），制备供试品溶液，置于室温（23）。分别于0、2、4和6 h测定帕拉米韦含量。含量平均值为100.68%，RSD为0.05%。结果表明，室温条件下，帕拉米韦供试品溶液6 h稳定。2.1.8样品测定取本品约0.15 g，精密称定，加无水冰醋酸40 ml使溶解，照电位滴定法（中国药典2020年版四部通则0701）在磁力搅拌下，用高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 ml高氯酸滴定液（0.1 mol/L）相当于32.84 mg帕拉米韦（C15H28N4O4）。以无水物计算，3批样品测定结果见表2。2.2高效液相色谱法2.2.1色谱条件以Welch Ultimate AQ-C18（150 mm4.6 mm，5 m）为色谱柱，以1 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（称取磷酸二氢钾约0.136 g溶于1 000 ml水，加入1 ml三乙胺，并以磷酸调pH 6.0）为流动相A，以乙腈为流动相B，90%A相等度洗脱10 min。流速图2一阶导数曲线V/ml02461 2001 0008006004002000dE/dV图1滴定曲线V/ml600550500450400350U/mV0246水平加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）80%121.45121.3299.89121.30121.0299.77120.98120.7599.81100%151.38151.43100.03151.66151.70100.02152.10152.0499.97120%181.82181.3599.75181.47181.1299.81182.37182.2399.92表1非水滴定法加样回收率试验结果表2非水滴定法含量测定结果批号202201202202202203含量（%）100.7100.5100.78天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第4期1.帕拉米韦图3空白溶剂（A）对照品（B）供试品（C）典型色谱图为1.0 ml/min，柱温为40，检测器波长为210 nm，进样量为20 l。2.2.2溶液的制备2.2.2.1对照品溶液的制备称取对照品约含帕拉米韦20 mg，精密称定，至10 ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密移取帕拉米韦对照品储备液1.0 ml至10 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，作为对照品溶液。溶剂为乙腈-水（1090）。2.2.2.2供试品溶液的制备称取供试品适量（约含帕拉米韦20 mg）至100 ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。2.2.3系统适用性试验取“2.2.2.1”项下对照品溶液（浓度：189.40 g/ml），按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按主峰计算，理论塔板数为6 395，拖尾因子为1.077。结果表明，系统适用性良好。空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液色谱图见图3。2.2.4专属性试验2.2.4.1空白溶剂干扰试验吸取乙腈-水（1090）20 l，按照“2.2.1”项下所述色谱条件进行测定，在帕拉米韦出峰位置，未见干扰峰。结果表明，空白溶剂不干扰帕拉米韦的测定。2.2.4.2强制降解试验称本品适量（按帕拉米韦计约含20 mg），置10 ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液。精密移取供试品储备液1.0 ml置10 ml量瓶中，加入1 mol/L盐酸溶液1 ml，60 加热1 h，用1 mol/L氢氧化钠溶液中和后用溶剂稀释至刻度，作为酸降解溶液；精密移取供试品储备液1.0 ml置10 ml量瓶中，加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，60 加热4 h后，取出放凉至室温，用1 mol/L盐酸溶液中和后用溶剂稀释至刻度作为碱降解溶液；精密移取供试品储备液1.0 ml置10 ml量瓶中，加入30%过氧化氢溶液1 ml，60 加热4 h后，取出放凉至室温，用溶剂稀释至刻度，作为氧化降解溶液；取于105 加热4 h的本品适量（相当于帕拉米韦20 mg），精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，作为热降解溶液；另取于（4 500500）lx光照24 h的本品适量（相当于帕拉米韦20 mg），精密称定，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，作为光降解溶液。将上述强制降解溶液按照“2.2.1”项下所述色谱条件进行测定。结果见图4。图4表明，本品在105 加热4 h和（4 500500）lx光照24 h条件下尚比较稳定。在酸降解条件下，产生的主要杂质在4.8 min，与帕拉米韦分离度为6.146。在碱降解条件下，产生的主要杂质在3.7和8.0 min，各杂质之间和各杂质与帕拉米韦分离度分别为10.295和5.260。在氧化降解条件下，产生的主要杂质在2.9、3.6和4.3 min，各杂质之间和各杂质与帕拉米韦分离度分别为2.668、1.541和4.126。将强制降解溶液按照“2.2.1”项下色谱条件，使用二极管阵列检测器进行测定，主峰的峰纯度见表3，均大于999.9。以上试验结果表明此方法专属性良好。2.2.5线性与范围精密称取对照品含帕拉米韦18.93 mg，置于10 ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密移取该溶液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5和3.0 ml，置于10 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为94.70、151.52、189.40、227.28、284.10和568.20 g/ml的标准系列溶液。精密量取各标准系列溶液20 l，注入高效液相色谱仪。以峰面积（Y）为纵坐标，以帕拉米韦质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=1107X+176 248（r=0.999 8）。结果表明，帕拉米韦质量浓度在94.70568.20 g/ml范围内，与峰面积具有良好的线性关系。0510t/minA05101t/minB0510t/minC19天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第4期图4未破坏（A）酸降解（B）碱降解（C）氧化降解（D）热降解（E）光降解（F）试验结果2.2.6精密度试验2.2.6.1仪器精密度取“2.2.2.1”项下对照品溶液（浓度：189.40 g/ml），按“2.2.1”项下所述色谱条件进行测定，连续进样6次，记录色谱图，按主峰峰面积计算，RSD值为0.14%。结果表明，仪器精密度良好。2.2.6.2重复性取同一批样品（批号202201），按“2.2.2.2”项下所述方法平行配制6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下所述色谱方法进行测定，记录色谱图，按照外标法计算含量，6份供试品溶液含量均值为100.63%，RSD为0.07%。结果表明，方法重复性良好。2.2.6.3中间精密度于不同时间，不同分析人员，使用不同高效液相色谱仪，分别取同一批样品（批号202201），按“2.2.2.2”项下所述方法各平行配制6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下所述色谱方法进行测定，记录色谱图，按照外标法计算含量，12份供试品溶液含量均值为100.54%，RSD为0.19%。结果表明，方法中间精密度良好。2.2.7回收率试验按“2.2.2.1”项下所述方法制备对照品储备液。取供试品（批号202201）适量（约含帕拉米韦20 mg），精密称定，置10 ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为供试品储备液，平行配制9份。精密移取各供试品储备液1.0 ml，置不同10 ml量瓶中，分别精密加入0.8、1.0和1.2 ml对照品储备液，每个浓度制备3份。按“2.2.1”项下所述色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算回收率，结果帕拉米韦的平均回收率为99.51%，RSD为1.09%，见表4。结果表明，在80%、100%和120%水平，方法准确度良好。2.2.8稳定性试验分别精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液和供试品溶液，于室温下放置0、2、4、8、12和24 h时按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。结果显示，对照品溶液峰面积的RSD为1.25%（n=6），供试品溶液峰面积的RSD为0.98%（n=6），表明对照品溶液和供试品溶液室温下放置24 h稳定。2.2.9定量限与检测限取帕拉米韦对照品溶液，采用逐级稀释法对其进行稀释后，按照“2.2.1”所述色谱条件进行测定分别以信噪比101和31作为帕拉米韦的定量限和检测限，并对定量限溶液连续进样6强制降解溶液酸降解碱降解氧化降解光降解热降解主峰纯度999.984999.996999.986999.991999.991表3强制降解峰纯度结果表0510t/min0510t/min0510t/min05100510t/mint/min0510t/minABCDEF1111111.帕拉米韦10天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第4期表4高效液相色谱法加样回收率试验结果水平测得量（mg）本底值（mg）80%3.5801.9983.5951.9933.5822.001100%3.9801.9564.0282.0164.0672.043120%4.3682.0024.3641.997加入量（mg）1.6041.6041.6042.0062.0062.0062.4072.407回收率（%）98.5599.8098.52100.93100.32100.9198.3398.364.4132.0102.40799.85次，计算峰面积的相对标准偏差为1.21%（n=6）。结果显示，帕拉米韦的定量限为0.284 1 g/ml，检测限为0.085 2 g/ml，且在定量限浓度水平下，精密度良好。2.2.10样品测定 按“2.2.2”项下所述方法配制对照品溶液和供试品溶液，按“2.2.1”所述色谱条件进行测定，以外标法计算帕拉米韦含量，结果见表5。表5高效液相色谱法测定帕拉米韦含量结果3讨论3.1结果比较分别采用非水滴定法和高效液相色谱法测定帕拉米韦原料含量，对两种方法的检测结果进行F检验和t检验（重复6次）8，结果见表6。结果说明，两种方法对帕拉米韦进行含量测定结果无显著性差异（P0.05）。3.2非水滴定法优缺点讨论采用非水滴定法对帕拉米韦进行含量测定操作简便快速、不需要使用对照品和昂贵仪器、方法重复性和准确度高，满足分析要求。但由于冰醋酸的结晶点较低（15.1），膨胀系数较大（0.001 1），因此采用冰醋酸为溶剂，高氯酸滴定液为滴定剂时，试验结果的准确性容易受到外界环境的影响。非水滴定自动化程度低，样品较多时耗时长，效率低。每次样品检测所需样品量较大。3.3含量测定方法的选择本文所述的高氯酸非水滴定法和高效液相色谱法测定帕拉米韦原料含量，结果没有显著性差异。由于不需要对照品，设备易获得，操作简便快速，准确度高，适于推广。但是采用高氯酸非水滴定影响因素较多，冰醋酸的质量变化、实验室的温湿度变化、待测样品的含水量和纯度、所用玻璃器皿是否干净且干燥等都会影响实验的测定结果，方法专属性低、灵敏度差，所需样品量较多，自动化程度低。而高效液相色谱法在专属性和灵敏度方面具有更多优势9-10，分离效率高，选择性好，且对环境温湿度要求不苛刻，自动化程度高，应用范围广。但高效液相色谱法需要对照品、仪器的购买和维护费用高、对操作人员要求较高。本文所述的非水滴定法和高效液相色谱法均能准确有效测定帕拉米韦含量，为其质量控制提供依据，可以根据实验室条件和目的，选择适宜方法。参考文献1Babu Y S，Chand P，Bantia S，et al.BCX-1812（RWJ-270201）：Discovery of a novel，highly potent，orally active，and selective influenzaneuraminidase inhibitor through structure-based drug designJ.J MedChem，2000，43（19）：3482-3486.2Gubareva L V，Webster R G，Hayden F G.Comparison of the activities批号202201202202202203含量（%）100.5100.3100.6表6两种方法含量测定结果比较序号含量（%）非水滴定法高效液相法1100.65100.572100.69100.633100.66100.564100.67100.685100.62100.586100.70100.73平均值100.67100.63RSD（%）0.030.07F检验0.081 0t检验0.229 611天津药学TianjinPharmacy2023年第35卷第4期of zanamivir，oseltamivir，and RWJ-270201 against clinical isolates ofinfluenza virus and neuraminidase inhibitor-resistant variantsJ.Antimicrobial Agents&Chemotherapy，2001，45（12）：3403-3408.3顾觉奋.新型抗流感病毒强效神经氨酸酶抑制剂帕拉米韦研究进展 J.中国新药杂志，2013，22（9）：9.4Bantia S，Arnold C S，Parker C D，et al.Antiinfluenza virus activity ofperamivirinmicewithsingleintramuscularinjectionJ.AntivirRes，2006，69（1）：39-45.5De Clercq E.Antiviral agents active against influenza a virusesJ.NatRev Drug Discov，2006，5（12）：1015-1025.6赵丽嘉，王利华，胡雅萍，等.A/B型流感病毒治疗药物帕拉米韦水合物（Peramivir hydrate）J.药物评价研究，2010，（5）：400-406.7黄巧巧，丁俊杰，罗金文.非水滴定法测定奈拉滨原料药的含量 J.中国药业，2012，21（4）：2.8马斌荣.医学统计学 M.第五版.北京：人民卫生出版社，2010：46.9陆广马.高氯酸滴定法与高效液相色谱法测定地巴唑片中地巴唑含量比较 J.中国药业，2019，28（8）：3.10 Johnson C S，Moyes D，Schroeder W A，et al.Hemoglobin pasadena，2275（E19）Leu Arg identification by high performance liquidchromatographyofanewunstablevariantwithincreasedoxygenaffinityJ.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Protein Structure，1980，623（2）：360-367.高效液相色谱法测定沉香舒郁片中沉香四醇和厚朴酚含量李朝义（天津市药品检验研究院北辰药品检验所，天津300400）摘 要目的：建立高效液相色谱法测定沉香舒郁片中沉香四醇和厚朴酚含量。方法：采用高效液相色谱法，以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为252 nm；柱温：30；流速：1.0 ml/min；进样量：10 l。结果：沉香四醇的线性范围为4.7094.08 g/ml（r=0.999 9，n=5），厚朴酚的线性范围为4.3987.84 g/ml（r=0.999 9，n=5），平均加样回收率分别为100.0%（RSD为1.0%）和99.6%（RSD为0.8%）。结论：该方法简便、准确，重复性好，可作为沉香舒郁片质量控制方法。关键词高效液相色谱法；沉香舒郁片；沉香四醇；厚朴酚中图分类号：R927.2文献标识：A文章编号：1006-5687（2023）04-0012-04Content determination of agarotetrol and magnolol in Chenxiang Shuyu tablets by HPLCLi Chaoyi（Beichen Drug Testing institute，Tianjin Institute for Drug Control，Tianjin 300400）ABSTRACT Objective：To establish a high-performance liquid chromatography（HPLC）method for determining thecontents of agarotetrol and magnolol in Chenxiang Shuyu Tablets.Method：High-performance liquid chromatography was usedwith acetonitrile as mobile phase A and 0.1%formic acid solution as mobile phase B，and gradient eluted.The detectionwavelength is 252 nm；Column temperature：30 C；Flow rate：1.0 ml/min；Injection volume：10 l.Results：The linear range ofagarotetrol was 4.7094.08 g/ml（r=0.9999，n=5），the linear range of magnolol was 4.39 g87.84 g/ml（r=0.9999，n=5），and the average sample recovery rates（n=9）were 100.0%（RSD was 1.0%）and 99.6%（RSD was 0.8%），respectively.Conclusion：The method is simple，accurate，and repeatable，which can be used as a quality control method for ChenxiangShuyu tablets.KEY WORDS HPLC，Chenxiang Shuyu tablets，agarotetrol，magnolol收稿日期：2022鄄12鄄26沉香舒郁片收载于 卫生部药品标准中药成方制剂第十五册 中，由沉香、厚朴、木香、肉豆蔻、甘草等十三味药组成，具有疏气开胃，化郁止痛的功效。用于脘腹胀满，胃部疼痛，呕吐酸水，消化不良等症。方中沉香被作为药材用于治疗疾病最早可追溯至梁代，名医别录 将其列为木部上品。沉香辛、苦，微温，归脾、胃、肾经，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘功效。用于治疗胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急等症1。沉香中所含有效成分沉香四醇被用于鉴定药材质量优劣的指标性成分。方中厚朴苦、辛，温，12