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纳米孔测序在肿瘤并发感染中的应用刘熙，刘馨，蔡静静，杜亚茜，李鸿生，周永春（昆明医科大学第三附属医院分子诊断中心，云南 昆明650118）摘要 目的评估纳米孔测序在肿瘤患者并发感染性疾病中的临床应用价值，为肿瘤患者感染性疾病的快速、灵敏诊断提供新的检测方法。方法收集 2022 年 7 月至 8 月云南省肿瘤医院 36 例疑似感染的肿瘤患者样本 46 份，利用纳米孔测序鉴定样本中的病原微生物。结果纳米孔测序细菌检出率 72.22%，真菌检出率31.48%，病毒检出率 42.59%。细菌和真菌检出率均较微生物培养法（23.91%和 10.87%）明显升高（2=23.19，P 0.0001；2=13.14，P=0.0003）。纳米孔测序结果与微生物培养结果比较，检出的细菌和真菌种属明显增多。结论纳米孔测序鉴定病原微生物具有检出率高，检测病原菌种属广，诊断快速的优势，在肿瘤并发感染性疾病的诊断中具有潜在的临床应用价值。关键词纳米孔测序；肿瘤；感染；病原微生物；微生物培养中图分类号 R44 文献标志码 A 文章编号 2095 610X（2023）07 0009 07Application of Nanopore Sequencing in Tumor with InfectionLIU Xi，LIU Xin，CAI Jingjing，DU Yaxi，LI Hongsheng，ZHOU Yongchun（The Molecular Diagnosis Center，The 3rd Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650118，China）Abstract ObjectiveTo evaluate the clinical application value of nanopore sequencing in tumor patientswith concurrent infectious diseases and to provide a new detection method for rapid and sensitive diagnosis ofinfectious diseases in tumor patients.MethodsSamples of inpatients with suspected infections from July to August2022 at Yunnan Cancer Hospital were collected，and pathogenic microorganisms in the samples were identifiedusing nanopore sequencing.ResultsForty-six samples from 36 patients with suspected infection were collected.Nanopore sequencing detected 72.22%of bacteria，31.48%of fungi，and 42.59%of viruses.Both bacterial andfungal detection rates were significantly higher（2=23.19，P 500 bp）、实时测序的优势为高通量病原微生物测序运用于临床感染性疾病的诊断提供了可能5,7。本 研 究 应 用 ONT 公 司 的 纳 米 孔 测 序 仪GridION 对云南省肿瘤医院住院的疑似感染患者样本进行病原微生物鉴定，与同期同种类型标本的微生物培养结果比较，综合评价纳米孔测序病原微生物鉴定的临床应用价值，为肿瘤患者并发感染性疾病的早期、准确、快速诊断提供可靠的检测方法。1资料与方法1.1研究对象收集 2022 年 7 月至 8 月于云南省肿瘤医院住院，疑似感染的 36 例肿瘤患者样本 54 份。血液样本采集双侧肘静脉血各 2 mL。除血液外的标本采集后立即于冰袋低温转运箱送到实验室，取样到检测时间不超过 24 h，超 24 h 样本至于-80保存。排除可疑污染的样本。另外，将上述 36 例患者中与纳米孔测序同类型标本且相同日期送检的 46 份病原微生物培养样本作为对照组。另 8 份样本无同期微生物培养结果，无法比较。本研究获云南省肿瘤医院伦理委员会批准（伦审编号：KYLX2022185），入组患者均签署了知情同意书。1.2主要仪器与试剂主要仪器包括北京天根生化科技有限公司的TGrinder H24 组织研磨均质仪（OSE-TH-01）；杭州朗基科学仪器有限公司提供的三通道 PCR 仪（T30）；Thermo Fisher 公司生产的 qubit 4 荧光定量仪（Q33226）和 ONT 公司的 GidION X5 纳米孔测序仪。主要试剂核酸提取或纯化试剂盒（DG001-1），测 序 反 应 通 用 试 剂 盒（DG005，DG006，DG007），清洗液（DG004-2）均购自武汉臻熙医学检验实验室有限公司。测序芯片（FLO-MIN106）和 MinKNOW 21.10.8 软件由 ONT 公司提供。1.3实验方法血液样本通过低速离心后转移上层血浆及中间白细胞层至研磨管，再进行高速离心后弃上清至 300 L 沉淀的方法尽量去除宿主细胞核酸。黏稠样本取 300 L 添加 30 L 核酸保护剂促进液化；不黏稠的样本取 1 mL 高速离心，弃上清，留管底 300 l 沉淀。预处理后样本加入裂解液和核酸保护剂放置于组织研磨均质仪研磨，离心后采用磁珠法依照试剂盒说明书提取核酸并纯化。提取的核酸通过逆转录为 cDNA。根据测序反应通用试剂盒说明书，不同样本类型选择不同的引物（包括 M01，M02，M03-1，M03-2，M05 和 M06）进行 PCR 扩增，扩增产物通过 qubit 定量后进行混样、末端修复和接头连接。配制文库体系，在自检合格的芯片上上样，最后上机测序。根据每次芯片自检的有效纳米孔数，测序时间 6 h 至 12 h，平均测序 8 h，下机数据达到 1.73 GB 至 3.36 GB，平均一次上机数据量为 2.4 GB，保证每份样本有效 Reads 数不低于 2 万条。下机数据与 16S rDNA/ITS 序 列 数 据 库（http:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci）和病毒参考序列数据库（http:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/viral）分别进行比对。病原微生物培养对照组的血液样本用需氧和厌氧培养瓶各采集静脉血 10 mL，其他样本采用灭菌试管无菌采集，送云南省肿瘤医院病原微生物室进行微生物培养。1.4统计学处理实验数据采用 Microsoft Excel 收集整理。应用 Venn 2.1（https:/b.csic.es/tools/venny/index.html）作图，并运用 Graph Pad Prism 9.4.1 应用软件做统计学分析。计数资料用例数或百分比表示，2 种检测方法检出率的比较采用配对四格表2检验，P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1样本来源和样本类型该研究 54 份样本来自疑似感染的 36 例肿瘤10昆明医科大学学报第 44 卷患者。男性患者 20 例，女性患者 16 例。年龄 14到 93 岁。患者来自重症监护室（53.70%），神经外科（14.81%），血 液 科（14.81%），其 他 科 室（16.67%）。其中肺癌 11 例，血液系统肿瘤 8 例，消化系统肿瘤 7 例，神经系统肿瘤 7 例，其他包括妇科肿瘤、泌尿系肿瘤等 3 例。诊断为疑似或确诊肺部感染患者 21 例，确诊脓毒血症 10 例，腹腔感染 2 例，尿路感染 1 例，颅内感染 2 例，发热原因待查 7 例。36 例患者中有感染相关手术操作史者 14 例，放化疗史 13 例，其他 9 例包括不明原因发热和重度骨髓抑制患者。54 份标本涵盖血液（59.25%）、痰液（29.62%）、肺泡灌洗液（1.85%）、脑脊液（3.70%）、胸腹腔引流液（5.56%）5 种样本类型，见图 1图 3。肺部感染浓毒血症腹腔感染16(61.5%)3(11.5%)5(19.2%)0(0%)0(0%)0(0%)2(7.7%)图1患者感染情况Fig.1Patientinfectionstatus30%59%4%样本类型肺泡灌洗液脑脊液血液痰液引流液2%5%图2可疑感染样本类型Fig.2Typesofsuspectedinfectedsamples.2.2纳米孔测序微生物检出率所有样本中纳米孔测序细菌检出率 72.22%，真菌检出率 31.48%，病毒检出率 42.59%。其中痰液样本中细菌检出率高达 81.25%，真菌检出率达 62.5%，病毒检出率为 31.25%。血液样本中细菌检出率为 62.5%，真菌检出率为 12.5%，病毒检出率为 43.75%，见图 4。2.3纳米孔测序结果与微生物培养结果的比较相同患者有 46 份同类型样本同期送病原微生物培养。纳米孔测序结果与微生物培养结果比较，纳米孔测序法细菌和真菌检出率分别较微生物培养法（23.91%和 10.87%）明显升高（2=23.19，P 0.0001；2=13.14，P=0.0003）。2 种方法比较细菌和真菌鉴定符合率分别为 28.27%和76.09%。其中细菌阳性符合率均为 8.70%；细菌阴 性 符 合 率 为 19.57%，真 菌 阴 性 符 合 率 达67.39%。细菌的漏检率和不一致率分别为 8.70%和 6.52%；真菌漏检率和不一致率均为 2.17%，见图 5、图 6。纳米孔测序在 54 份样本中检测出2%可疑感染样本来源ICU神经外科血液科放射治疗科胸外科干疗科泌尿外科4%5%5%15%15%54%图3感染样本科室来源Fig.3Sourceofinfectedsamples9072.2242.5962.5纳米孔测序阳性检出率43.7581.2562.531.2512.531.48807060504030纳米孔测序微生物检出率(%)2010所有样本血液样本痰液样本0细菌真菌病毒图4纳米孔测序病原微生物检测率Fig.4Detection rate of pathogenic microorganisms bynanoporesequencing50*4030检出阳性例数(n)细菌真菌病毒纳米孔检测微生物培养纳米孔检测微生物培养纳米孔检测微生物培养20100图5不同检测方法病原微生物阳性检出例数的比较Fig.5Comparison of the number of positive cases ofpathogenic microorganisms detected by differentdetectionmethods*P 0.001。第 7 期刘 熙，等纳米孔测序在肿瘤并发感染中的应用11的细菌主要包括屎肠球菌、肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等 27 种，真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌等 11 种、病毒主要包括 EB 病毒、人巨细胞病毒、细环病毒等 7 种。较 46 份微生物培养的样本中检出的细菌（9 种）和真菌（3 种）种属明显增多，见表 1、表 2。2.4纳米孔检出 reads 数同时将测序 4 h 的数据与下机数据比较显示89.74%的细菌可在 4 h 时得到有效 Reads 数，100%的真菌 4 h 数据可提示感染的真菌种属。而47.83%的病毒在测序 4 h 后获得了有效 Reads 数。2.5与临床相关感染指标考察临床常用的检测和监测感染的指标，包括外周血白细胞数、中性粒细胞数，C 反应蛋白（C reactional protein，CRP），降钙素原（procalci-tonin，PCT），G 试验，GM 试验。白细胞数、中6040例数(n)细菌真菌阳性符合数阴性符合数纳米孔单独检出漏检不一致200图6纳米孔测序与微生物培养结果对比Fig.6Comparison of results with nanopore sequencingandmicrobialculture表1纳米孔测序检出的病原微生物种属（n）Tab.1Pathogenicmicrobialspeciesdetectedbynanoporesequencing（n）检出细菌种属检出例数检出真菌种属检出例数检出病毒例数检出例数铜绿假单胞菌3白色念珠菌3人疱疹病毒6型3肺炎链球菌4热带念珠菌3人类疱疹病毒1型2血液链球菌1葡萄牙棒孢酵母2EB病毒10大肠埃希氏菌1似平滑念珠菌3人巨细胞病毒6肺炎克雷伯菌2克柔念珠菌3人疱疹病毒7型1屎肠球菌6耶氏肺孢子菌1细环病毒5戈登链球菌1限制性马拉色菌1JC病毒1内氏放线菌2解脂耶氏酵母菌1人类疱疹病毒1型2口腔链球菌1清酒念珠菌1杰氏棒杆菌2光滑念珠菌1鲍曼不动杆菌4酿酒酵母1荧光假单胞菌2蜡样芽孢杆菌1蕈状芽孢杆菌1棉子糖球菌1阴道加德纳菌2副流感嗜血杆菌2产气克雷伯菌1金黄色葡萄球菌3维隆气单胞菌1产碱假单胞菌1缓症链球菌1阿氏肠杆菌1枯草芽孢杆菌1斯氏假单胞菌1路登葡萄球菌1栖稻假单胞菌154份样本中共检测出细菌27种，9份样本同时检出2种细菌；真菌11种，3份样本同时检出2种真菌；病毒7种，5份样本同时检出2种病毒，1份样本同时检出3种病毒。12昆明医科大学学报第 44 卷性粒细胞数，CRP 和 PCT 值与鉴定出病原微生物与否以及病原微生物的种属无相关性。54 份样本中 GM 试验结果均为阴性。3 份样本中 G 试验阳性，纳米孔测序分别在其中 2 份腹腔引流液中检测到限制性马拉色菌和白色念珠菌，1 份血液样本中检测出热带念珠菌。同期有 2 份同类型样本行微生物培养，仅 1 份腹腔引流液标本中培养出白色念珠菌。3讨论纳米孔测序概念的提出最早是在 20 世纪 80年代，随着纳米孔和马达蛋白相关技术的不断革新，2014 年 ONT 公司推出了第一台纳米孔测序仪 MinION，在 2015 年开始商业化的应用8。纳米孔测序技术依赖于纳米级生物蛋白质孔，纳米孔作为一个生物传感器，嵌在电阻聚合物膜中并置于电解质溶液环境里，当给予恒定的电压产生穿过纳米孔的离子电流时，带负电的单链 DNA或 RNA 分子从纳米孔一侧穿到带正电一侧，不同碱基通过纳米孔产生不同的离子电流变化，最后通过计算机将电流信号的变化转换为碱基序列9。基于上述纳米孔测序原理，使纳米孔测序具有单分子、长读长和实时测序的优势，在人类基因组测序，生物和植物等基因组的组装，感染、遗传和肿瘤等疾病的诊治方面有广阔的应用前景1013。本研究对纳米孔测序用于肿瘤患者并发感染性疾病病原微生物的鉴定进行了初步探讨。肿瘤患者并发的感染以呼吸道和手术操作相关感染为主，这一特征与综合性医院住院患者院内感染以下呼吸道感染（32.6%）和手术部位相关感染（20.1%）为主一致3。疑似感染样本主要来自重症监护室，重症监护室是危急重症感染患者的最终选择，同时也是引起院内感染的重要因素之一14。重症感染的患者易并发脓毒血症，通常为原发感染病灶和血液的双重可疑感染样本，甚至是多部位样本的多次送检。本研究中来自重症监护室的 11 例（11/12）患者为双重送样，4 例患者在双样本中均检测到致病菌，其中 3 例检出的致病菌不同，仅 1 例相同。一方面提示肿瘤患者低免疫力状态引起的重症感染往往为多重感染，另一方面多重送样有助于明确致病菌，全面评估病情。据文献统计，导致人感染性疾病的微生物有1415 种，其中细菌 538 种，真菌 307 种，病毒217 种，原生动物 66 种，蠕虫 287 种，且大多数微生物是无法进行分离培养的15。纳米孔测序对病原菌包括细菌、真菌和病毒的检出率和检出的病原微生物种属均明显高于微生物培养。痰液样本细菌检出率最高，可能与呼吸道感染的高发生率有关，开放性标本也是导致痰液细菌高检出率的原因。吴泽刚等16应用纳米孔测序鉴定血液感染中的病原菌，结果示细菌和真菌检出率分别为41.8%和 11.2%。本研究中血液样本的细菌检出率为 62.5%较其明显增高，是否与研究对象是血液原发感染人群和其他部位感染引起菌血症人群不同有关，有待进一步探讨。血液样本真菌检出率为 12.5%，与研究报道基本一致。肿瘤患者的低免疫状态是导致感染的重要因素23。细菌是最常见的感染病原体，主要是革兰氏阳性菌，如葡萄球菌、链球菌、肠球菌，且由于医源性暴露和预防性抗生素的使用常伴有耐甲氧西林（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）和耐万古霉素（vancomycin-resistant entero-cocci，VRE）耐药17。本研究结果亦提示肿瘤患者并发感染的细菌主要以屎肠球菌、肺炎链球菌常见，真菌种类相对丰富，病毒以 EB 病毒为主。在耐药菌和药敏鉴定方面，病原微生物的分离培养同时可获得部分药物敏感信息，对临床治疗有一定提示作用。而本研究中的纳米孔测序仅针对微生物种属的鉴定，尚未涉足耐药基因的检测。高通量测序对耐药基因的检测以及耐药基因与耐表2微生物培养检出的微生物种属（n）Tab.2Pathogenicmicrobialspeciesdetectedbymicrobialculture（n）检出细菌种属检出例数检出真菌种属检出例数耐碳青霉烯铜绿假单胞菌1白色念珠菌2革兰氏阳性杆菌1克柔念珠菌1鲍曼不动杆菌1光滑念珠菌3耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌1产酸克雷伯菌1超广谱B内酰胺酶大肠埃希菌1耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌1肠膜明串珠菌1超广谱B内酰胺酶肺炎克雷伯菌1肺炎克雷伯1阴沟肠杆菌146份样本中共检测出细菌9种，每一份样本均只检出1种细菌；真菌3种，1份样本同时检出2种真菌。第 7 期刘 熙，等纳米孔测序在肿瘤并发感染中的应用13药表型的相关性值得深入研究。本研究进一步比较了纳米孔测序和微生物培养在多种类型样本中的细菌鉴定完全符合率（28.27%）较刘晔等18报道的单一肺泡灌洗液样本中的纳米孔测序与细菌培养结果33.3%的一致率低。可能与呼吸道病原菌培养检出率高和肺泡灌洗液样本背景菌相对较少有关。值得注意的是虽然纳米孔测序在病原微生物检出率和种属鉴定上均明显优于微生物培养，但其仍存在一定的漏检率（细菌 8.70%，真菌 2.17%）和不一致率。文献报道在不同样本中纳米孔测序与微生物培养细菌的漏检率从 3.6%到 21.1%不等16,19。除了样本类型干扰外，可能与微生物测序强人源背景和纳米孔测序精确度较 Illumina 平台低相关11，20。实时测序没有固定的最小运行时间，可以即时对数据进行信息学分析是纳米孔测序的另一优势20。本研究中纳米孔测序时长 612 h，JanaBatovska 等21报道采用 MinION 对虫媒病毒进行测序，上机测序 10 min 即可产生 12%的病毒Reads，1 h 后 Reads 数增加到 32.2%，在 10 h 后可得到 87.3%的目的病毒 Reads。在纳米孔测序技术检测呼吸道病原体中，叶福强等22也报道测序开始8 min 后，MinION 产出第 1 条人呼吸道腺病毒 7 型序列，测序 5 h，可获得至少 50%的目标序列，测序 9 h 得到 78.95%的目标序列。本研究中纳米孔测序样本制备 68 h，上机测序612 h，测序 5 min 后便可在计算机端获得数据，4 h 得到可分析的微生物鉴定信息，这种高效的微生物鉴定对于感染的早期精准诊断，第一剂抗生素的选择和扭转危急重症感染患者预后有重要的意义。综上，纳米孔测序技术用于鉴定微生物相较传统微生物培养优势明显，通过纳米孔测序能够在 24 h 内获取样本微生物信息，病原微生物检出率高，鉴定的病原微生物种属多。快速、有效的鉴定病原微生物种属，能够有效地指导临床抗生素的应用，满足临床需求，具有潜在的临床应用价值。本研究亦存在一定局限性，回顾性分析了疑似感染样本的纳米孔测序结果，未对纳米孔测序结果进一步行 Sanger 测序或 PCR 验证；扩大样本量，丰富样本类型，前瞻性研究将为评价纳米孔测序在病原微生物鉴定中的敏感性和应用价值提供支撑。参考文献 Zheng Y，Chen Y，Yu K，et al.Fatal infections among can-cer patients：A population-based study in the UnitedStatesJ.Infectious Diseases and Therapy，2021，10（2）：871-895.1Zorina T，Styche A.Infectious diseases in cancer patients：An overviewM.Shurin M R，ThanavalaY，Ismail N.In-fection and Cancer：Bi-Directorial 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