凝血实验的标准化和质量控制问题WORD.doc

凝血实验的标准化和质量控制问题由于血栓与止血实验的特殊性，故迄今为止仅有凝血酶原时间（prothrombin time, PT）、活化的部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT）和纤维蛋白原(fibrinogen,FG) 等三项实验有了标准化的试剂（如PT）、标准品（如Fg）、质控品和统一的报告形式等，其他，如血小板功能、抗凝因子和纤溶因子等检测尚缺乏成熟的标准化方案。本文就经国际血液学标准化委员会（ICSH）和国际血栓与止血委员会 (ICTH) 或美国国家临床生化室标准委员会 (NCCLS) 等国际组织以文件形式公布的PT、APTT和Fg三项实验的标准化和质量控制问题作一简介。一、 标准化和质量控制的重要性 所谓血栓与止血检测方法的质量控制（质控），是指采用统计学原理，运用物理、化学、生物学的方法，对血栓与止血实验室的技术、操作、仪器、试剂等项的质量水平，进行合理的检测、评价和指导改进，以堵绝误差，提高质量而言。 血栓与止血实验质控的目的，在于提高血栓与止血实验的可靠性。可靠性首先取决于检测结 果的精密度（主要靠实验室内部质控保证），其次取决于检测结果的准确度（主要靠实验室 外部质控保证）。质量控制的重要性在于：1. 为临床诊治提供可靠的依据# 实验结果若为假阳性就会造成误诊、误治；若为假阴性就会造成漏诊、漏治；实验结果偏高或偏低都会影响患者的病情和疗效的判断。2. 提高血栓与止血基础研究的效率和价值# 血栓与止血基础研究的形式就是进行各种实验。实验可靠性好，就能揭示血栓与止血的客观规律，甚至可带来重大理论突破及（或）社会、经济效益；若实验可靠性差或有错误，则不仅费时、费力，徒劳无功，还会造成假象或错误理论。3. 有助于人群健康调查和建立血液学参数的正常范围# 为了解一定人群的健康水平，建立具有广泛意义的血液学参考值的范围须进行较大规模人群的健康调查，健康调查必须要有实验结果的可靠性作保障，不然会导致不准确或错误的结果，故质量控制对群体医学也有重要意义。 总之，血栓与止血实验室的质量控制，从一定程度上反映一个国家，一个地区，一个单位血栓与止血医疗水平和研究水平的高低。因此，应倍加重视。二、 凝血酶原时间（PT）（一）PT的标准化问题自从1953年Quick建立了PT测定方法以来，至今仍然是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，并且是监测口服抗凝药治疗的主要手段。PT测定受很多因素影响，诸如标本的采集方法及器材，储血容器的性质，抗凝剂的种类和用量，标本的运送和储存条件，孵育温度及时间，凝血活酶试剂的种类和质量（敏感性）以及判读终点的方法等，均会影响测定结果。此外，报告结果的方式也必须统一，特别是用于监测口服抗凝药物治疗时。所有这一切，都必须使方法标准化和建立有效的质量控制。早在1973年，在维也纳召开的第四届血栓与止血国际会议上，由ICSH和ICTH联合成立了口服抗凝药控制专家组（Expert Panel on Oral Anticoagulant Control），要求该组制订推荐一个PT测定标准化方案。经过多个实验室的协作研究，在1975年该专家组提出了第一个人血一期凝血酶原时间试验参考方法（reference method for the one-stage prothrombin time test on human blood）并于1976年发表（编号ICSH-EP14/1：1975）。该文件重点是讲标本采集和PT的测定方法，对于报告结果和质量控制只简单地提了几句。而至关重要的PT试剂凝血活酶的标准化问题，当时虽然注意到，但因条件尚未成熟，仅答应进一步研究完成后再修订。众所周知，不同的凝血活酶，检测相关的凝血因子缺乏的敏感性是不同的。因此要使PT标准化，使不同的实验室虽用了不同的凝血活酶，也能得到同样的（可比的）结果。此后，经过几个著名实验室历时数年的共同努力，并由世界卫生组织（WHO）参与，以当时已在英国作为统一标准使用的“英国比较凝血活酶”（british comparative thromboplastin, 简称BCT）为基础，制备了WHO的原级凝血活酶参考品 (primary reference preparation) 人脑制品，编号67/40；同时制备了牛脑 （68/434）和兔脑（70/178）两个用67/40标化的次级参考品（secondary reference preparation）。后来，WHO又发表了其他一些次级参考品，迄今已在世界各国广泛用于校正本地制备或工厂生产的PT参考物。与此同时，在口服抗凝药物治疗中，用PT监测时的报告方式也列入了议事日程。如上所述，各种凝血活酶对凝血因子有不同的敏感性。为了使不同敏感性的试剂得到同样的测试结果，首先要制定一个共同的敏感性指标。这就要通过用自制的试剂与IRP进行比较后，得到一个校正值。具体的做法是：用多份口服抗凝药后不同程度地缺乏凝血因子的病人血浆和正常对照（至少混合10个正常人）的血浆，同时用自制凝血活酶和国际参考品（IRP）测定PT（结果用秒表示），分别计算出各自与正常对照血浆的比率。然后在双对数纸上作图，以IRP的比率为纵坐标，自制凝血活酶的比率为横坐标，通过回归分析，其回归线的斜率称为国际敏感指数（international sensitivityindex, ISI）。此数值愈低PT试剂愈低敏感（人脑制的原级标准作为1.0）。从理论上讲，不管何种凝血活酶，只要标上ISI，就可以与国际参考制品进行对比校正，并可用同一种计量单位报告。1985年，ICSH和ICTH发表了在口服抗凝药监测中推荐的PT报告方式(即ICSH/ICTH recommendations for reporting protrombin time in oral anticoagulant control)。该文件提出用国际标准化比率（international normalized ratio, INR）来报告PT试验结果，INR的计算公式如下：INR=PTRISI式中PTR表示患者的PT与正常对照PT的比值；ISI为国际敏感指数。文件要求试剂厂家每批凝血活酶试剂都必须标明ISI值，以便使用者计算INR。目前各国在口服华法令类抗凝药物时，已广泛使用INR作为控制用药量的指标。在用INR以后，各种敏感性不同的凝血活酶均可得到相同的INR值，这对于用手工法（倾斜试管法）测定PT值并用手工法测定PT来讲是正确的。但后来发现，手工与仪器以及仪器与仪器之间，INR仍有差别。为此，等提出建议，同一凝血活酶试剂用于不同的仪器时，可用所谓“仪器特有的ISI”（instrument specific ISIs）来计算INR。WHO在发放IRP时，亦附上这种仪器特有的ISI。除了ICSH、ICTH和WHO发布的有关PT测定标准化的文件以外，1992年美国的NCCLS也发表了编号为H28-T的有关PT测定标准化的文件。本文以下将综和上述文件，提出我国PT测定标准化和质量控制的方案，供讨论。（二） 凝血酶原时间（PT）的推荐方法原理将凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37保温，测定血浆凝固时间，即为PT。本法主要用于过筛检测外源凝血途径的第、因子和相关因子的抑制物。试剂1、 抗凝剂 109mmol/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水的枸橼酸钠32g/L）。2、 凝血活酶试剂 市售商品，应标有ISI、批号及有效期。冻干者应按说明书加指 定的缓冲稀释剂复溶。3、 氯化钙（CaCl2）溶液 浓度为25 mmol/L。（目前有些商品试剂已将凝血活酶液与氯化钙液混合好，可不必另配CaCl2液）。4、 质控物 正常及异常对照血浆 仪器1、 手工法 秒表，保持371的恒温水浴箱或电热块。2、 仪器法 各种自动或半自动凝血仪，严格按说明书操作。血液样品的采集、运送及储存1、 用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器。采血时止血带不可束缚过紧，并不应超过 5分钟（针筒内见到血即应解开止血带）。否则某些凝血及纤溶因子会活化，并可能 使Hct长高。2、 血与枸橼酸钠抗凝剂按9:1 混合，轻轻颠倒混匀。可用特制的已加有定量枸橼酸钠液的抽空硅化试管（国内已大量生产）采血，可保证血与枸橼酸钠比例准确，防止凝血因子活化，并保持清洁，防止试管和不合格橡皮塞的污染。 血液如发现凝固即应弃去不用，也不可污染组织液。3、 储血应用塑料管或硅化试管（国内已有商品大量供应）或其他不沾湿的容器，避免接触活化凝血因子。取得血液后应尽快送到血液检验室。在运送中应避免剧烈振动和日光直射。一般要求，自采血到测定在2小时内完成，不可久储。如在室温中储存过久，第因子等会破坏；另一方面，冷冻或在4储存过久，会导致第因子活化，使PT缩短。有报道有些口服抗凝药的患者，全血在4储存2-4小时，其PT可接近正常。故实验室在取得血样后应尽快离心，分离血浆并尽快测定。4、 标本制备：PT和APTT都应用乏血小板血浆（PPP），分离血浆时要求相对离心力20002500g，离心30分钟，用浊度法测定终点的自动化凝血仪，溶血和较明显的黄疸及脂血均会影响结果，此时可用手工法或电子机械式凝血仪测定。 测定步骤：1、 手工法（1） 测定温度36.538.5C，上述各试剂及被测血浆，均应预温至此一温度，但凝血活酶 试剂预温不可超过30分钟，血浆预温一般不宜超过10分钟。（2） 所用试管及加样器等接触血浆的器具均为塑料或硅化玻璃管。（3） 吸取枸橼酸抗凝血浆0.1ml，加入一小试管中：加入凝血活酶试剂0.1ml混匀后置 37C 水浴中。再加入25mmol/L CaCl2液0.1ml，（也可先将凝血活酶试剂与CaCl2溶液 等量 混合，加入0.2 ml）。立即混匀并开动秒表：试管仍浸于水浴中，至约10秒钟时， 自水浴中取出，在纱布上迅速擦去试管外水滴，在明亮处不断倾斜试管，在流动状态 下观察有无纤维蛋白形成。一旦见到纤维蛋白（同时将出现液体流动减慢），立即停表， 记录时间。每次测定二管，按平均数报告。 本试验的最后混合液其PH应为7.27.3，大部分商品凝血活酶试剂均用含缓冲液的 溶液配制。（4） 每批均同时做正常和异常对照，方法应与测定标本完全相同。 2、仪器法凝血测定仪大体可分为光电浊度法和电子机械法两大类，自动化程度也不一 样。一般仪器均供应配套试剂，各有详细说明书，应严格按说明书操作。报告方式1、 以PT的秒（S）数报告（最接近的0.5秒）2、 以患者血浆PT（S）/正常对照PT（S）的比率（PRT）报告。3、 在口服华法令类抗凝药物治疗监控时，应报告国际标准化比率，INR。大部分自动化化仪器可根据所测的PTR和凝血活酶试剂的ISI，自动算出INR。手工法可根据下列公式，用一计算器直接计算： INR=PTRISI INR=Antilog(ISI logPRT)Poller设计了一个简便的列线图，在取得PTR和ISI值后，即可从图上直接查找出INR值，十分便利，国内已有介绍。ICSH规定，不再用稀释曲线或百分比（活动度）报告。参考值因仪器/试剂不同，会得出不同结果，故很难统一规定参考值。各实验室应根据自己的仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或当条件有变化时，根据新的条件，重新建立。PT测定的一切条件均应与患者血浆PT测定相同（包括采血、容器、抗凝剂等）。健康供血者应选至少20个1855岁的男性和非妊娠、月经期女性，不可服药，在平静休息状态采血，以减少个体差异（有条件时，可测一批老年人和小儿，分开统计）。同时应分开几天采血和测定，以减少天间差异。测定结果经统计学处理，计算标准差：以两个标准差（2SD）或95%可信限作为参考范围。对于三个标准差是正常还是异常，需结合具体情况进行评估。从统计学上讲，其中有些人是正常的。用以上标准，病人（PT异常）则很少会遗漏。三、活化部分凝血活酶时间（APTT）（一） APTT的标准化问题 APTT是检测内源凝血系统诸凝血因子缺陷和相关抑制物的筛选试验，也是当前用于凝血因子治疗、肝素抗凝治疗以及狼疮抗凝物质检测的主要手段。与PT测定一样，不同的部分凝血活酶、不同的活化剂和不同的激活时间对各种凝血因子缺陷、对肝素和对狼疮抗凝物质的敏感性相差很大。例如，检测APTT的试剂中，所用活化剂（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他们对检测肝素、狼疮抗凝物质和因子、的敏感性不同，见表1。表1 不同活化剂对检测物的敏感性比较 APTT试剂 对因子敏感性 对肝素敏感性对狼疮抗凝物质敏感 性 硅藻土+ + 白陶土+ + 鞣花酸+迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT检测标准化或试剂标准化的可行方案问世，仅NCCLS于1992年，提出一个编号为H29-T的暂行方案。（二）活化的部分凝血活酶时间（APTT）的推荐方法原理 将一种磷脂和激活剂加到血浆中，经过孵育后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间（以秒计），即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径凝血因子和共同途径因子的缺陷，如因子XII、VIII、IX、PK、HMWK以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定、肝素治疗的监测以及狼疮抗凝因子的检查。仪器 本法所用仪器、设备（包括采血、贮血容器、加样装置等）以及对它们的要求完全与PT相同。PT所用自动化仪器同样适于本法。试剂 1、部分凝血活酶试剂（一种脑磷脂）由商品供应，一般已与激活剂按比例配在一起（或分开配制），常用的激活剂由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用的激活剂，由厂方配套供应。APTT试剂/仪器结合，应能使第VIII、IX或XI因子活性低于0.3u/ml（或0.55%时未校正枸橼酸盐液体积。（3） 用了不正确的抗凝剂（如EDTA或草酸盐）或未加抗凝剂，或浓度不正确。（4） 用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品。（5） 血样混匀不当或太剧烈的混匀。（6） 采血器或贮血管不洁，已受到污染。（7） 污染了肝素。 2、分析前的错误 血样送验延误或用了不合规定的方法运送、处理或贮存血样。 3、与试剂有关的问题 （1）试剂已被污染。 （2）复溶时稀释剂加量不准确。 （3）复溶时未用推荐的试剂。 （4）试剂在运输、贮存过程中，由于处理不当而变质。 （5）试剂复溶后超过了规定的稳定期或试剂已超过有效期。 4、分析过程的错误 如孵育时间不准确；温度、加试剂量以及仪器操作步骤不准确等。8