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使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物张新宇（中国医科院肿瘤研究所，北京100021）电子邮件: zhangxy 在当今分子生物学研究中，PCR技术已成为使用最多，最广泛的技术之一。而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。在PCR扩增以前，一般模板序列已被全部或部分确定。要想扩增出理想的目的片断，一般都得通过正确设计PCR引物。也有的人不经过设计直接取模板序列的两个片段作为引物，这样很可能导致实验失败，如扩增出多条带（引发错配所致），不出目的带或出目的带很弱（引物引发效率低下），引物二聚体带（引物与引物之间形成稳定二聚体）等等。现在PCR引物设计都通过计算机软件进行。生物信息学发展至今日，具有引物设计功能的软件有很多，其中大部分是免费软件，可直接从网上下载，安装并运行。这类软件大都简单易用，但其引物设计功能一般不很强，通过它们设计的引物常常不尽如人意，而专门进行引物设计的商业版软件功能强大，但使用起来不太容易。本文就这一问题进行探讨。引物设计的原则引物设计有几条基本原则：首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，G值(internal stability)，引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin），错误引发位点（false priming site），引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。以使用Oligo软件分析设计引物为例，笔者总结出以下的要点：1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度。2. 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。3. 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72左右。5. G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。7. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3端的连续GGG或CCC会导致错误引发。8. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。引物的自动搜索和评价分析带有引物设计功能的软件有很多，大都是For Windows版本的。在此特别推荐两个专门性的引物设计软件（商业版）：Primer Premier 5（以下简称Premier） 和 Oligo 5.0/6.22软件的引物设计功能主要体现在两个方面，首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以Oligo 软件最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以Premier 为最强且方便易用，Oligo软件其次，其他软件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。当然要想保证得到效果理想的引物，在自动搜索的基础上，还要对引物辅以人工分析，以得到最佳设计的引物。因此，笔者认为引物设计软件的最佳搭配是Oligo 和Premier 软件一起，以Premier进行自动搜索，Oligo进行分析评价，如此可设计出成功率很高的引物。笔者曾以此搭配给多人设计引物，速度又快效果又好。Primer Premier 5.0的使用技巧1.功能简介Premier的主要功能分四大块，其中有三种功能较常用，即引物设计()，限制酶切点分析()，基元查找()。另个功能是同源性分析（），并非Premier的特长，在此略过。该软件还有别的一些功能，如序列”朗读”，DNA与蛋白序列的互换（），发声提示键盘输入（）等，但其中最优秀的却是能设计简并引物。简并引物的出现是出于遗传密码的简并性。有时需要根据一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平设计引物。众所周知，大多数氨基酸（二十种常见结构氨基酸中的十八种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，就遇到部分碱基的不确定性。这种不确定性因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的，甚至植物线粒体与无脊椎动物线粒体以及无脊椎动物线粒体的遗传密码都不尽相同。Premier可以针对各种不同的遗传密码规律设定不同的DNA和氨基酸的相互转换，这取决于被分析序列的出处。这样设计出来的引物实际上是多种序列的混和物，在某些位点有所变化，但大部分还是相同的，称之为简并引物。Primier软件给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear），无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion），支原体（Mycoplasma），植物线粒体（Plant Mitochondrion），原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion），一般标准（Standard），脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion），和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。2. 使用步骤及技巧Premier软件的起动并打开一段序列后，界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制酶或基元。进行引物设计时，点击按钮，界面如下：进一步点击按钮，出现search criteria窗口，有多种参数以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer）都分别查找(Both)，或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible With Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。研究人员可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标都能达标（如下图）。点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示Peimer Premier主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。有时需要对引物进行修饰编辑，如在5端加入限制酶切点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。若要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。当然，对简并引物的分析不能象一般引物那样严格。总之，Premier有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，使用也容易上手，是一个相当不错的软件。Oligo 6.22使用技巧1. 功能简介在专门的引物设计软件中，Oligo是最大名鼎鼎的。Oligo的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和G图；Oligo 6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图，不知底细的人当然一看就蒙了。其实Oligo的主要功能集中在Analyze菜单里，只要把它弄懂了，其他的就很简单了。Oligo的功能比Premier还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。Oligo 6.22比Oligo 5.0的改进有，多序列共用引物设计，排除出现频率高的序列片断，搜索功能更加强大细致，改观了界面等等。使用Oligo自动搜索引物也未尝不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高，但在方便易用上稍不如Premier。2. 使用（以Oligo 6.22为例）Oligo 5.0的安装有个需要注意的地方，安装程序完毕后需要安装一种字体，不然碱基显示不清楚。在软件安装目录（默认为C:oligo）的system下，有一个字体文件，oli.fon。打开控制面板，选”字体”“安装新字体”，找到该路径，安装即可。Oligo 6.22可免去此步骤。起动Oligo 6.22并打开一个序列后，界面如下：图中显示的三个指标为Tm，G，Frq，其中Frq为6.22的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。经过Windows/Tile项后的显示如图：在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低（不要超过9如图：） Tm值曲线以选取72度附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用Frq值相对较低的片断。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先需要检查的是引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。对于一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置，产物大小要求较低，应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。检测的第二项是发夹结构（hairpin）。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好，一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆PCR引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。检测的第三项为GC含量，以45-55为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果不是在基因组中进行PCR，而是一个特定模板序列，那么最好还进行一下False priming site的检测。这项检测可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。一般在错误位点的引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。如果引物在错误位点的引发效率比较高，PCR结果就可能出假阳性，这当然是我们不愿看到的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P键就出来PCR窗口，其中总结性地给出该引物的位置，产物大小，Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。关于Oligo软件的引物自动搜索功能，因为与Primer Premier 5类似，并且似乎并不比它更好用，在此不再冗述。其实使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。Oligo6.0 的Memory Table功能：The oligo position displayed at the bottom of the Internal Stability window. The individual squares indicate positions on the active sequence. A marked nucleotide appears as a blue square and represents a position in the R1-R3 memory tables. It usually represents the 5-end of the selected positive strand primers (top sequence = R1) and 3-end of the selected negative strand primers (sequence in the middle = R2) in searches for oligonucleotides. In hairpin and palindrome searches, the entire hairpin and/or palindrome is marked by blue squares. The Memory Array may be used to manually mark positions by clicking on the grid.Memory Table A table where the results (numerical position data) of a search are stored. There are three Memory Tables R1, R2, and R3. R1 is the active table for positive strand searches and R2 for negative strand searches.P.E. 是Priming Efficiency的意思。除了本地引物设计软件外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute 开发的Primer3，由European Molecular Biology Laboratory of Heidelberg开发的JaMBW（本网站http:/210.72.11.60已引进并调试好这两种软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计，可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。8