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临床微生物实验室规范操作草案
第一部分标本采集和运送
标本采集和运送是细菌培养成功的最重要的关键，但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，由此引发的最主要后果是阳性率下降，这也是临床医生最不能接受的问题，为此建议来一次革命，用输送培养基代替传统的标本的容器。
血液及骨髓标本采集运送的规范条例
1、采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎除外。
2、采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血注入厌氧瓶。儿童：采血量是总血量的1％。(儿童败血症含菌量是成人的10-100倍)
体重Kg
抽血量ml
套（需氧+厌氧）
<1
1-2
1
1.1-2
4
2
2.1-12.7
6
2
12.8-36.3
20
2
≥36.3
40-60
2-3
3、采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。
4、采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。
5、迟延培养瓶处理：迟延培养瓶不要放冰箱或孵箱，放常温，尽早送往临床细菌室。
注：皮肤消毒液推荐：建议先用70-80％异丙醇去酯，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。
其他无菌体液的采集运送规范
临床常用于培养的无菌体液包括脑脊液、胆汁、胸腹水等。由于无菌体液细菌培养的价值远高于有菌部位标本。所以无菌部位的采集和运送应遵循以下准则：
1、无菌采集是培养成功的首要因素
2、采集的标本应立即送至临床细菌室，胸膜炎球菌有自溶酶，离体后会迅速自溶。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等对温度敏感的细菌在冰箱会很快死亡。
泌尿标本采集的规范
1、采集后的标本应立即送检。
2、采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集。应采集早晨第一次的尿。
3、标本管不应含防腐剂和消毒剂。
4、采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗。
5、长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。
6、做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。
分泌物采集规范
1、对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用无菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可去感染部位下的组织送检。
2、闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。
便标本采集规范
1、采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采;厌氧菌出现症状即采集。
2、采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接盛于增菌液或保存液中;对不易获得粪便患者及幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。
3、注意事项：
（1）虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。
（2）在患者病情许可的条件下应在用药前采集标本。
（3）应床边接种或置输送培养基送检。
（4）厌氧细菌（艰难梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。
痰标本的采集和运送条例
1、标本采集时间：用抗生素前；晨痰;
2、采集方法：
（1）自然咳痰：用清水漱口3次，应包括咽喉部，用力咳出痰，与灭菌容器中或输送培养基中。
（2）帮助咳痰：不易获得痰的患者可雾化吸入加温的氯化钠（45℃10％氯化钠水溶液）
（3）支气管镜或支气管毛刷：由医生采集，建议直接种入输送培养基。
（4）胃内采集痰标本：婴幼儿不会咳痰而且常把痰误咽入胃中。可在清晨，用胃管插入胃内，用注射器抽出胃液。
（5）小儿采集痰标本：用压舌板刺激咳嗽使肺部和器官的分泌物喷出，用拭子采取标本送检，如不能立即送检应种入输送培养基。
厌氧培养标本采集规范条例
1、痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。
2、尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养
3、便标本厌氧培养标本采集;可用排出的便作厌氧培养但也应少与空气接触。
第二部分标本培养前规范草案
合格的标本是培养成功的最重要的因素，实验室有权利对不合格提出终止检查或要求重送标本的要求，因此实验室必须建立标本接种前的质量控制和标本合格的检测。要求对除血液外的标本均作涂片革兰染色检查，用于评价标本的质量和区别分离细菌是定植菌或致病菌。
血液培养
疑是感染患者首次血培养至少一套，包括一瓶需氧瓶及一瓶厌氧瓶。采集后标本如不能及时送检，应置常温保存，不能放冰箱或35-37度培养箱。

痰培养标本培养前规范
1、实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色（加入消化液后涂片），当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上皮细胞大于25个每视野时应作为不宜作培养的标本
2、当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌分布作判断；
（1）当标本中细菌种类超过3种以上，未见到纤毛柱状上皮细胞，作为不合格标本；
（2）如见到数量不等的白细胞或纤毛柱状上皮细胞或两者同在，含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析；
（3）当涂片中见到1-3种细菌，少量的扁平上皮细胞，少量或较多纤毛柱状上皮细胞均可按合格标本继续培养。
3、白细胞大于10个每视野、上皮细胞小于25个每视野为合格标本。
厌氧培养
1、 在正常上班时间。
2、 申请厌氧培养的可适应邀请实验室，由临床医生或护士采集，细菌室行床边接种。
3、 自然排出的便标本和尿标本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰标本均为不合格的厌氧培养标本，应于退检。
4、 没有条件或不能及时送检的情况下均应用输送培养基放置标本。
培养结果结合涂片判断定置菌或致病菌
1、尿培养分离出3种以上的细菌，或分离出凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌，涂片未见到，应在报告中提示可能是污染细菌建议结合临床表现考虑结果的参考价值。
2、眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。
3、前列腺液标本分离出凝固酶阴性葡萄球菌或革兰阳性小杆菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。
4、当涂片中见到的细菌，并由细菌吞嗜现象存在，在培养时分离出该细菌可推测为致病菌。（涂片应注明细菌是细胞内或细胞外）
5、涂片报告的日期和培养报告日期要对应便于医生判别结果的参考价值。
6、并每一视野可见到>20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%，可推测是标本中的优势菌。
第三部分分离培养规范草案
有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病菌分离成功。
痰培养
1、培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、加MRSA显色琼脂。
2、培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂置5-7%CO235℃环境培养、其他培养置35℃空气培养。
3、结核培养：罗世鸡蛋斜面，每一标本种2支，37度空气培养
尿标本
1、培养基：5%羊血琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、CP3尿致病菌分离显色琼脂。
2、接种量：用加样器或定量接种环取样本200ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平皿，此日作菌落计数。
3、培养环境：35℃空气环境培养
便培养
1、培养基：中国兰或伊红美兰，沙门氏志贺氏琼脂（SS）或加沙门菌分离琼脂。
2、培养环境：35℃空气环境培养
3、疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面、梭状芽孢杆菌分离琼脂（CCFA）。5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面置35度空气环境培养。CCFA置35度厌氧环境培养。
4、其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。
脑脊液培养
1、培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂
2、培养环境：置5-7%CO235℃环境培养。
分泌物培养
1、培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤
2、培养环境：置5-7%CO2 35℃环境培养
胆汁或胸水或腹水
1、培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本量有限，可接种5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤
2、培养环境：置5-7%CO2 35℃环境培养
第四部分细菌鉴定规范草案
但分离到细菌后进行鉴定分类是十分必要的，由于各级医院所具有的技术水平、设备条件差异，但对菌株的鉴定应包括以下基本步骤：
涂片染色
涂片染色应具备最基本的两种染色技术，即革兰染色和抗酸染色
1、革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，是葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。
2、抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可以抗酸杆菌三种结果，报告中应加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌++；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议在送标本。
趋向性鉴定试验
革兰阳性球菌：触酶试验、凝固酶试验
革兰阴性杆菌：氧化酶试验
生化试验
应包括临床常见分离致病菌的生物特征；有条件的实验室建议购买商品鉴定系统，根据标本量选择手工操作的API系统或半自动的ATB系统或全自动的VITEK-2COMPACT，或PHENIX-100等，无条件的实验室可自行配制生化试剂，但应有质量控制记录保证试剂的实效性。

血清学试验
肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清学试剂。
血清学鉴定
1、志贺氏菌多价和单价凝集血清
2、沙门氏菌多价和单价凝集血清
3、致病性大肠杆菌多价和单价凝集血清
4、耶尔森氏菌凝集血清
真菌检测
1、每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别曲菌或毛霉菌
2、开展真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基
3、真菌鉴定应区别是白色念珠菌或非白色念珠菌；是曲菌或毛霉菌，可用显色培养基或传统手工鉴定厚膜孢子的方法，对丝状真菌用小培养观察生长过程初步鉴定真菌种并区别曲菌或毛霉菌。有条件的实验室也可用自动化设备或分子生物学方法作鉴定。
4、有条件的单位可开展真菌药敏试验（应用稀释法报告MIC结果），真菌耐药监测为临床用药提供参考。
第五部分药物敏感试验规范
基层细菌室应开展K-B纸片扩散法药敏试验，应用WHONET软件开展本单位的耐药监测为临床用药提供参考
药敏标准
1、用CLS指南推荐的K-B药敏标准进行常规药敏试验判断
2、根据CLSI更新及时替换应用的标准
3、根据CLSI推荐的方法，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。
药敏方法
1.K-B纸片扩散药敏方法作为常规药敏方法。
2.CLSI没有设定标准的抗生素应用稀释法报告MIC结果。
药敏试验的质量控制
1. 初始质量控制应换CLSI要求连续30天直到失控小于3次为止。
2. 常规药敏质量控制应保持一周一次。
3. 发生失控后应按CLSI程序纠控，选择对失控抗生素的标准菌株，做纸片扩散药敏，同一药敏贴5张纸片，连续测试5天，寻找原因，纠正错误。如第一天已找到合理的原因，可提前恢复常规药敏质控。
第六部分临床微生物实验室的质量控制
质量控制是保证实验室检测结果正确的重要措施，质量指控包括室内和室间质量控制。参加室间质量控制有利于发现实验室的系统误差，是对室内质量控制的评价，因此二级或以下医院细菌室应参加本省或本市的临床细菌室的定期的质量控制活动。
. 实验室的质量控制和方法标准化是一对相互制约的矛盾，实验室只有建立标准化方法学才能进行质量控制才能获得好的结果。而连续的质量控制可维护方法学的稳定性和正确性，随时发现问题，解决问题。
临床细菌学质量控制的内容应包括工作人员的专业水平；实验室各种仪器、试剂、培养基和染色液等。
质量控制资料保留三年。
质量控制内容
1. 药敏敏感试验的质量控制：应包括30天的初始质量稳定测试；每周一次的常规质量控制；5天的纠控程序v。
2. 鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量控制。
3. 染色液质量控制：应包括染色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量控制。染色液内不长细菌，可长真菌。
4. 分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养菌的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进行测试，判断其分离能力。
5. 培养箱的质量控制：每天第一个开箱和最后离开实验室均应对培养箱的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。
6、冰箱温度记录：按每一次冰箱存放的物品不同设置不同的指控范围，特别对低温冰箱；每天记录一次。
7、自动化设备：试剂质控要求同鉴定试剂；但在设备软件升级或修改版本时均应进行质量控制程序。向厂家要SOP文件。
第七部分临床细菌室报告制度的规范
细菌实验室应对不同的细菌检验报告时间和内容应有相应的规定，并告诉临床各科，依此可防止不明原因的报告延迟
1、危重感染报告：
2、常规报告：
涂片报告
1. 革兰染色：危重报告30分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。
2. 抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。常规报告24小时，危重报告1小时。
血液和无菌体液培养的报告制度
实行三级报告制度：
第一级：培养液直接涂片结果；
第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果。直接将阳性瓶内含菌培养基密涂直接做药敏
第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。
便培养
1、48小时可发出初始报告；
2、72小时应报告药敏试验结果；
3、根据检测范围报告检测结果，如未检测出沙门菌、志贺菌。
4、错误报告：未见到致病菌
尿培养
可在24小时报告初始结果，包括菌落计数和可能细菌种类，如氧化酶阴性的革兰阴性杆菌；金黄色葡萄球菌等。
痰培养
24小时初始报告，报告内容包括痰标本是否合格、优势细菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等特征明显细菌的鉴定结果
分泌物报告
24小时初始报告：有无细菌生长；革兰阳性或革兰阴性或特征明显的细菌名称；根据涂片结果推测致病菌
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