临床微生物实验室规范操作草案.doc

临床微生物实验室规范操作草案第一部分标本采集和运送标本采集和运送是细菌培养成功的最重要的关键，但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成，所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处，由此引发的最主要后果是阳性率下降，这也是临床医生最不能接受的问题，为此建议来一次革命，用输送培养基代替传统的标本的容器。血液及骨髓标本采集运送的规范条例1、采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎除外。2、采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血注入厌氧瓶。儿童：采血量是总血量的1。(儿童败血症含菌量是成人的10-100倍)体重Kg抽血量ml套（需氧+厌氧）20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%，可推测是标本中的优势菌。第三部分分离培养规范草案有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病菌分离成功。痰培养1、培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、加MRSA显色琼脂。2、培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂置5-7%CO235环境培养、其他培养置35空气培养。3、结核培养：罗世鸡蛋斜面，每一标本种2支，37度空气培养尿标本1、培养基：5%羊血琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、CP3尿致病菌分离显色琼脂。2、接种量：用加样器或定量接种环取样本200ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平皿，此日作菌落计数。3、培养环境：35空气环境培养便培养1、培养基：中国兰或伊红美兰，沙门氏志贺氏琼脂（SS）或加沙门菌分离琼脂。2、培养环境：35空气环境培养3、疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面、梭状芽孢杆菌分离琼脂（CCFA）。5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面置35度空气环境培养。CCFA置35度厌氧环境培养。4、其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。脑脊液培养1、培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂2、培养环境：置5-7%CO235环境培养。分泌物培养1、培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤2、培养环境：置5-7%CO2 35环境培养胆汁或胸水或腹水1、培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本量有限，可接种5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤2、培养环境：置5-7%CO2 35环境培养第四部分细菌鉴定规范草案但分离到细菌后进行鉴定分类是十分必要的，由于各级医院所具有的技术水平、设备条件差异，但对菌株的鉴定应包括以下基本步骤：涂片染色涂片染色应具备最基本的两种染色技术，即革兰染色和抗酸染色1、革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，是葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。2、抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可以抗酸杆菌三种结果，报告中应加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议在送标本。趋向性鉴定试验革兰阳性球菌：触酶试验、凝固酶试验革兰阴性杆菌：氧化酶试验生化试验应包括临床常见分离致病菌的生物特征；有条件的实验室建议购买商品鉴定系统，根据标本量选择手工操作的API系统或半自动的ATB系统或全自动的VITEK-2COMPACT，或PHENIX-100等，无条件的实验室可自行配制生化试剂，但应有质量控制记录保证试剂的实效性。血清学试验肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清学试剂。血清学鉴定1、志贺氏菌多价和单价凝集血清2、沙门氏菌多价和单价凝集血清3、致病性大肠杆菌多价和单价凝集血清4、耶尔森氏菌凝集血清真菌检测1、每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别曲菌或毛霉菌2、开展真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基3、真菌鉴定应区别是白色念珠菌或非白色念珠菌；是曲菌或毛霉菌，可用显色培养基或传统手工鉴定厚膜孢子的方法，对丝状真菌用小培养观察生长过程初步鉴定真菌种并区别曲菌或毛霉菌。有条件的实验室也可用自动化设备或分子生物学方法作鉴定。4、有条件的单位可开展真菌药敏试验（应用稀释法报告MIC结果），真菌耐药监测为临床用药提供参考。第五部分药物敏感试验规范基层细菌室应开展K-B纸片扩散法药敏试验，应用WHONET软件开展本单位的耐药监测为临床用药提供参考药敏标准1、用CLS指南推荐的K-B药敏标准进行常规药敏试验判断2、根据CLSI更新及时替换应用的标准3、根据CLSI推荐的方法，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。药敏方法1.K-B纸片扩散药敏方法作为常规药敏方法。2.CLSI没有设定标准的抗生素应用稀释法报告MIC结果。药敏试验的质量控制1. 初始质量控制应换CLSI要求连续30天直到失控小于3次为止。2. 常规药敏质量控制应保持一周一次。3. 发生失控后应按CLSI程序纠控，选择对失控抗生素的标准菌株，做纸片扩散药敏，同一药敏贴5张纸片，连续测试5天，寻找原因，纠正错误。如第一天已找到合理的原因，可提前恢复常规药敏质控。第六部分临床微生物实验室的质量控制质量控制是保证实验室检测结果正确的重要措施，质量指控包括室内和室间质量控制。参加室间质量控制有利于发现实验室的系统误差，是对室内质量控制的评价，因此二级或以下医院细菌室应参加本省或本市的临床细菌室的定期的质量控制活动。. 实验室的质量控制和方法标准化是一对相互制约的矛盾，实验室只有建立标准化方法学才能进行质量控制才能获得好的结果。而连续的质量控制可维护方法学的稳定性和正确性，随时发现问题，解决问题。临床细菌学质量控制的内容应包括工作人员的专业水平；实验室各种仪器、试剂、培养基和染色液等。质量控制资料保留三年。质量控制内容1. 药敏敏感试验的质量控制：应包括30天的初始质量稳定测试；每周一次的常规质量控制；5天的纠控程序v。2. 鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量控制。3. 染色液质量控制：应包括染色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量控制。染色液内不长细菌，可长真菌。4. 分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养菌的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进行测试，判断其分离能力。5. 培养箱的质量控制：每天第一个开箱和最后离开实验室均应对培养箱的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。6、冰箱温度记录：按每一次冰箱存放的物品不同设置不同的指控范围，特别对低温冰箱；每天记录一次。7、自动化设备：试剂质控要求同鉴定试剂；但在设备软件升级或修改版本时均应进行质量控制程序。向厂家要SOP文件。第七部分临床细菌室报告制度的规范细菌实验室应对不同的细菌检验报告时间和内容应有相应的规定，并告诉临床各科，依此可防止不明原因的报告延迟1、危重感染报告：2、常规报告：涂片报告1. 革兰染色：危重报告30分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。2. 抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。常规报告24小时，危重报告1小时。血液和无菌体液培养的报告制度实行三级报告制度：第一级：培养液直接涂片结果；第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果。直接将阳性瓶内含菌培养基密涂直接做药敏第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。便培养1、48小时可发出初始报告；2、72小时应报告药敏试验结果；3、根据检测范围报告检测结果，如未检测出沙门菌、志贺菌。4、错误报告：未见到致病菌尿培养可在24小时报告初始结果，包括菌落计数和可能细菌种类，如氧化酶阴性的革兰阴性杆菌；金黄色葡萄球菌等。痰培养24小时初始报告，报告内容包括痰标本是否合格、优势细菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等特征明显细菌的鉴定结果分泌物报告24小时初始报告：有无细菌生长；革兰阳性或革兰阴性或特征明显的细菌名称；根据涂片结果推测致病菌9