DB50∕T 952-2019 动物组织中赭曲霉毒素A的测定 高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法.pdf

DB50/T 952-2019 I ICS 65.020.30 B 41 DB50 重庆市地方标准 DB50/T 9522019 动物组织中赭曲霉毒素A的测定 高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法 Determination of ochratoxin A in animal tissues HPLC and LC-MS/MS 重庆市市场监督管理局 发 布 2019-12-15 发布2020-03-15 实施DB50/T 952-2019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由重庆市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心、重庆市兽药饲料检测所。 本标准主要起草人员：侯亚莉、周莉、李玉平、朱英才、盛欣、胡健、张毅、丁平、范首君、何义刚等。DB50/T 952-2019 1 动物组织中赭曲霉毒素 A 的测定 高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法 1 范围 本标准规定了动物组织中赭曲霉毒素 A 的测定方法。 本标准适用于动物肾脏、肝脏、肌肉组织中赭曲霉毒素 A 的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文本的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文件。 GB/T 6628 分析实验室用水规格和试验方法 3 高效液相色谱法 3.1 方法原理 用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱结合荧光检测器测定赭曲霉毒素A的含量，外标法定量。 3.2 试剂和材料 3.2.1 水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 3.2.2 乙酸乙酯：分析纯。 3.2.3 磷酸：分析纯。 3.2.4 碳酸氢钠：分析纯。 3.2.5 乙酸铵：分析纯 3.2.6 甲 醇：色谱纯。 3.2.7 乙腈：色谱纯 3.2.8 1 mol/L 磷酸溶液：称取磷酸 115.3 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。 3.2.9 0.05 mol/L 碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠 21 g，用水溶解并稀释至 500 mL。 3.2.10 赭曲霉毒素 A 标准品：纯度大于 99。 3.2.11 赭曲霉毒素 A 标准储备溶液：精确称取标准品 0.0100 g（精确至 0.0001 g），置于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为 1mg/mL 的标准储备溶液。2 8 保质期 3 个月。 3.2.12 赭曲霉毒素 A 标准中间溶液：准确移取标准储备溶液 1 mL，置于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，标准品浓度为 0.1 mg/mL。2 8 保质期 1 周。 3.2.13 赭曲霉毒素 A 标准工作溶液：准确移取赭曲霉毒素 A 标准中间溶液适量，用乙腈水溶液（55+45，体积比） 配制成浓度为 0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL 和 10 ng/mL的标准工作溶液。现用现配。 3.2.14 淋洗缓冲液：称取 12.5 g 氯化钠、5 g 碳酸氢钠溶于水中，加入 0.1 mL 吐温-20，用水稀释至1000mL。 3.2.15 洗脱液：甲醇乙酸溶液（49+1），量取 490 mL 和 10 mL 的乙酸，混匀。 DB50/T 952-2019 2 3.2.16 微孔滤膜：0.22m，有机系。 3.2.17 赭曲霉毒素 A 免疫亲和柱：规格 3mL，柱容量100ng，或等效柱。 3.3 仪器和设备 3.3.1 分析天平：感量 0.1 mg，0.01mg。 3.3.2 液相色谱仪：配荧光检测器。 3.3.3 组织捣碎机。 3.3.4 旋涡混匀器。 3.3.5 氮吹仪。 3.3.6 振荡器。 3.3.7 离心机：转速不低于 5000 r/min 3.3.8 PH 计：精度为 0.01。 3.4 试样的制备与保存 取代表性样约100 g，用组织捣碎机捣碎，装入试样袋，密封并做好标识，于-20 下保存。 3.5 提取与净化 3.5.1 样品的提取 准确称取待测样品2 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心试管中，加0.6 mL磷酸溶液（3.2.8），涡旋混匀，放置15 min后，加入5ml乙酸乙酯提取，涡动3分钟，4000 rpm离心5分钟，将上清液转入另一个50 mL离心管中。重复提取3次，合并3次上清液。上清液加入5 mL的碳酸氢钠溶液（3.2.9）涡动3分钟，4000 rpm离心5分钟，收集碳酸氢钠溶液层，再提取2次，合并3次提取液，得到的提取液用磷酸溶液（3.2.8）调节其pH 7.48.4，备用。 3.5.2 样品的净化 将免疫亲和柱置在室温下预先平衡，加入提取液，调节流速不超过1.0 mL/min，使其缓慢通过免疫亲和柱。待柱内液体流干后，加入10.0 mL淋洗缓冲液进行淋洗，弃去全部流出液。把柱内残余液体抽干，加入3.0 mL洗脱液，收集洗脱液于玻璃刻度试管中，氮气50下吹干。准确加入1.0 mL乙腈水溶液（55+45，体积比）溶解，过滤膜后，采用高效液相色谱法测定。 3.6 测定 3.6.1 高效液相色谱条件 色谱柱：C 18柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 m，或等效柱。 流动相：乙腈水（55+45，体积比）。 流速：1.0 mL/min。 柱温：25 进样量：10 L 激发波长：333 nm 发射波长：460 nm 3.6.2 液相色谱测定 DB50/T 952-2019 3 按3.6.1液相色谱测定条件对标准工作溶液及试样溶液等体积进样测定， 样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超过标准曲线范围，应进行适当稀释后测定，稀释倍数为D。在该条件下赭曲霉毒素A的标准物质色谱图参见附录A中图A.1，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。 3.7 结果计算和表述 按公式（1）计算试样中赭曲霉毒素A的含量X，以微克/千克（g/kg）表示。 X=mDVC.(1) 式中： C 由标准曲线得到的样液中赭曲霉毒素A的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 样品定容体积，单位为毫升（mL)； m 试样质量，单位为克(g)； D 稀释倍数； 以平行样的算术平均值作为测定结果，保留至小数点后两位。 3.8 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过其算术平均值的10%。 3.9 其他 动物组织中赭曲霉毒素A检测限为0.03g/kg，定量限为0.1g/kg 4 液相色谱-串联质谱法 4.1 方法原理 用磷酸溶液酸化动物组织，乙酸乙酯提取动物组织中赭曲霉毒素A，提取液用碱性碳酸氢钠反提，调节提取液的pH后，通过免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。 4.2 试剂和材料 4.2.1 水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2.2 乙酸乙酯：分析纯。 4.2.3 磷酸：分析纯。 4.2.4 碳酸氢钠：分析纯。 4.2.5 乙酸铵：分析纯 4.2.6 甲醇：色谱纯。 4.2.7 乙腈：色谱纯 4.2.8 1 mol/L 磷酸溶液：称取磷酸 115.3 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。 4.2.9 0.05 mol/L 碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠 21g，用水溶解并稀释至 500 mL。 4.2.10 赭曲霉毒素 A 标准品：纯度大于 99。 4.2.11 赭曲霉毒素 A 标准储备溶液：精确称取标准品 0.0100 g（精确至 0.0001 g），置于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为 1mg/mL 的标准储备溶液。2 8 保质期 3 个月。 DB50/T 952-2019 4 4.2.12 赭曲霉毒素 A 标准中间溶液：准确移取标准储备溶液 1 mL，置于 10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，标准品浓度为 0.1 mg/mL。2 8 保质期 1 周。 4.2.13 淋洗缓冲液：称取 12.5 g 氯化钠、5 g 碳酸氢钠溶于水中，加入 0.1 mL 吐温-20，用水稀释至1000mL。 4.2.14 洗脱液：甲醇乙酸溶液（49+1） ，量取 490 mL 和 10 mL 的乙酸，混匀。 4.2.15 0.01%甲酸溶液：量取 1.0 mL 甲酸于 1000 mL 水中，混匀。 4.2.16 5 mmol/L 乙酸铵 0.01%甲酸溶液：称取 0.385g 乙酸铵，用 0.01%甲酸溶液定容到 1000mL，混匀。 4.2.17 微孔滤膜：0.22m，有机系。 4.2.18 赭曲霉毒素 A 免疫亲和柱：规格 3mL，柱容量100ng，或等效柱。 4.3 仪器和设备 4.3.1 分析天平：感量 0.1 mg。 4.3.2 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源。 4.3.3 组织捣碎机。 4.3.4 旋涡混匀器。 4.3.5 氮吹仪。 4.3.6 振荡器。 4.3.7 离心机：转速不低于 5000 r/min 4.4 试样的制备与保存 取代表性试样约 100g，用组织捣碎机捣碎，装入试样袋，密封并做好标识，于-20下保存。 4.5 提取与净化 4.5.1 样品的提取 准确称取待测样品2 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心试管中，加0.6 mL磷酸溶液（4.2.8），涡旋混匀，放置15 min后，加入5ml乙酸乙酯提取，涡动3分钟，4000 rpm离心5分钟，将上清液转入另一个50 mL离心管中。重复提取3次，合并3次上清液。上清液加入5 mL的碳酸氢钠溶液（4.2.9）涡动3分钟，4000rpm离心5分钟，收集碳酸氢钠溶液层，再提取2次，合并3次提取液，得到的提取液用磷酸溶液（4.2.8）调节其pH 7.48.4，备用。 4.5.2 样品的净化 将免疫亲和柱置在室温下预先平衡，加入提取液，调节流速不超过1.0 mL/min，使其缓慢通过免疫亲和柱。待柱内液体流干后，加入10.0 mL淋洗缓冲液进行淋洗，弃去全部流出液。把柱内残余液体抽干，加入3.0 mL洗脱液，收集洗脱液于玻璃刻度试管中，氮气50下吹干。准确加入1.0 mL乙腈：5mM醋酸铵0.01%甲酸溶液（30+70，体积比）溶解，过过0.22 m的微孔滤膜后，采用液相色谱-串联质谱测定。 4.6 基质匹配标准曲线 称取 6 个空白组织样品，按 4.5.14.5.2 步骤进行样品前处理后制得多个 1mL 空白基质样品溶液，混合均匀。准确移取赭曲霉毒素 A 标准中间溶液适量，氮气吹干，用 1mL 空白基质样品溶液溶解，配DB50/T 952-2019 5 制成浓度为 0.1 ng/mL 、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL 和 10 ng/mL 的基质匹配标准溶液，过 0.22 m 的微孔滤膜上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配的标准曲线。 4.7 测定 4.7.1 液相色谱条件 色谱柱：Intersil ODS ，柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径3.5 m，或等效色谱柱。 流动相：A相为乙腈，B相为含5 mM 醋酸铵0.01 %甲酸的水溶液，梯度洗脱程序见表1。 流速：0.35 mL/min。 柱温：20 。 进样量：10 L。 表 1. 流动相梯度洗脱程序 时间/min 流动相 A/% 流动相 B/% 0 30 70 2 80 20 6 80 20 6.5 30 70 12 30 70 4.7.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测 MRM。 电离电压：3.5 kV 源温度：80 。 雾化气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气,使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。 多反应监测参数参考值见表2。 表 2 多反应监测参数 名称 母离子/（m/z） 子离子/（m/z） 采集时间/ms 碰撞能量/eV 赭曲霉毒素 A 404 292 a 200 24 358 200 14 注：a 为定量离子 DB50/T 952-2019 6 4.7.3 定性测定 选择1个母离子和2个特征离子， 在相同试验条件下， 样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在2.5 %之内，且样品中定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应待测物。 表 3 定性确认时相对离子丰度的最大允许偏差 单位（%） 相对离子丰度 50 2050 1020 10 允许的最大偏差 20 25 30 50 4.7.4 定量测定 在仪器最佳工作条件下，对基质匹配标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线， 样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内， 如果含量超过标准曲线范围，应进行适当稀释后测定，稀释倍数为D。上述色谱和质谱条件下，基质匹配标准溶液特征离子色谱图见附录A中图A.2。 4.8 结果计算 按公式（2）计算试样中赭曲霉毒素A含量X，以微克/千克（g/kg）表示。 X=mDVC.（2） 式中： C 由基质匹配标准曲线得到的试样中赭曲霉毒素A浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V 样品的总稀释体积，单位为毫升（mL)； m 试样质量，单位为克 (g)； D 稀释倍数； 以平行样的算术平均值作为测定结果，保留至小数点后两位。 4.9 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过其算术平均值的15%。 4.10 其他 动物组织中赭曲霉毒素A检测限为0.03g/kg，定量限为为0.1g/kg。 DB50/T 952-2019 7 附录A (资料性附录) 标准样品色谱图 A.1 赭曲霉毒素A标准溶液的高效液相色谱荧光法色谱图 图A.1 高效液相色谱法中赭曲霉毒素A标准品色谱图 A.2 赭曲霉毒素A标准溶液超高液相质谱联用法色谱图 图A.2 液相色谱-串联质谱法中赭曲霉毒素A标准品色谱图 EU-1.000.001.002.003.004.005.006.007.00分钟0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.0018.0019.0020.00_