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第二章 误差和分析数据处理
§2.1误差及其表示方法
一 ．误差的分类 如：测定方法不完善、仪器不准、试剂不纯、操作不正确等。系统误差对分析结果的影响比较固定，使测定结果系统偏高或系统偏低，当重复测定时重复出现。
3.分类
⑴.方法误差：是由于分析方法本身不够完善而引起的。
⑵.仪器误差：是由于所用仪器不够精确所引起的误差。
⑶.试剂误差：是由于测定时所用试剂或蒸馏水不纯所引起的误差。
⑷.操作误差：是由于分析操作人员所掌握的分析操作，与正确的分析操作有差别所引起的。
过失误差：由于过失或差错造成的误差。是可以避免的，是不允许存在的；没有规律性，常表现为离群数据；可用离群数据的统计检验方法将其剔除。 这是由于操作者责任心不强、粗心大意或违反操作规则等原因造成的。如：读错数据、加错试剂、记录出错、计算出错等。
因此没有列入误差之列
㈡.随机误差random error（偶然误差）
随机误差：是由某些无法控制和无法避免的偶然因素造成的。
1.性质 ⑴.操作过程中不可避免； ⑵.有大有小、有正有负。随机误差的分布存在一定规律。
2.减小方法 增加平行测定的次数取平均值。 不稳定的随机因素，如：温度、湿度、气压的微小变动、光线、气流、分析人员操作的微小差异以及仪器的不稳。
由于随机误差是由一些不确定的偶然因素造成的，其大小和正负都是不固定的，因此无法测定，也不可能加以校正。
（实践证明，对一个量进行多次的测量，测定结果都不同程度分散在其平均值两侧，小误差出现机会多，大误差出现机会少，正负误差出现的机会几乎相等，因此它们之间能相互抵消。）
⑴.绝对值相等的正、负误差出现的机会相等；
⑵.小误差出现的机会多，大误差出现的机会少，绝对值特别大的正、负误差出现的机会非常小。
㈠.准确度 accuracy 是测定值与真值之间相符的程度。用误差表示。
1.准确度的意义
反映测量系统或测定方法系统误差和随机误差的综合指标，决定着该测定结果的可靠性。
2.准确度的表示方法 ⑴.绝对误差：E=x-μ ⑵.相对误差：RE=E/μ×100%
二.准确度与精密度
相对误差能反映出误差在真实值中所占比例，这对于比较在各种情况下测定结果的准确度更为方便。绝对误差和相对误差都有正负。
㈡.精密度 precision 同一均匀试样多次平行测量值之间的彼此符合程度。用偏差表示。
1.精密度的意义 描述数据的离散程度，反映测量系统或分析方法存在随机误差的大小。
2.精密度的表示方法 ⑴.绝对偏差 ⑵.平均偏差 ⑶.相对平均偏差 ⑷.标准偏差 ⑸.相对标准偏差
计算标准偏差和相对标准偏差时把单次测定值的偏差平方后再求和，不仅能避免单次测定偏差相加时正负抵消，更重要的是大偏差能显著地反映出来。标准偏差和相对标准偏差能更好地反映出一组平行测定数据的精密度。
㈢.准确度和精密度的关系
准确度是反映分析方法或测量系统中系统误差和随机误差大小的综合指标。
精密度是反映随机误差大小的指标。
精密度是保证准确度的先决条件，但只有消除或减免系统误差后，精密度高，准确度才高。
所以，要想得到好的结果，首先应设法减小或消除系统误差。精密度高，准确度不一定高，只有在消除或减免系统误差之后，精密度高，准确度才高。

§2.2分析数据的处理
一.有效数字及其运算规则
㈠.有效数字
是在测量中所能得到的有实际意义的数字；
包括全部准确数字和最后一位不确定数字。
㈡.有效数字修约方法
修约规则为：“四舍六入五留双”。
㈢.有效数字的运算规则
1.加减运算；
2.乘除运算；
3.对数和反对数运算；
4.准确度或精密度；
5.用计算器运算。
记录数据和计算结果时，应保留几位有效数字，应根据测定方法及使用的仪器的准确程度来决定，其所保留的有效数字中，只有最后一位是可疑的数字。
数字“0”在其中有双重意义：
①.有效数字；（0.0300的后两个“0”）
②.定位作用。（0.0300的前两个“0”）
即：被修改的数字≤4，该数弃取；
被修改的数字≥6，进位；
被修改的数字=5，并且后面的数为0，当5前面为偶数，弃取；
被修改的数字=5，并且后面的数为0，当5前面为奇数，进位；
被修改的数字=5，并且后面的数还有不为0的任何数，都进位。
以数据中小数点后的位数最少的数据位数为准。
以数据中有效数字位数最少的为准。
对于第一位为8或9的数，乘除时可多计一位。
对数的尾数位数与真数的位数相同。
视情况为一位或两位有效数字。
对最后结果的有效数字的位数进行合理取舍。
二.可疑数据的取舍
可疑数据（离群值）：
是指一组数据中偏离较大的个别数据。
㈠.Q检验法
1.适用性
⑴.n=3～10的测定；⑵.只有一个可疑值的取舍。
2.方法
⑴.n个数据从小到大排列，找可疑值；
⑵.求舍弃商
⑶.查Q表；
若Q计算>Q表，则可疑值舍弃，否则保留。
可疑数据可能是由于测试条件改变、尚不明原因现象的突然出现、系统误差及偶然事故等因素造成。
它的取舍应慎重，首先应从各个方面检查，若能确定它纯属操作失误引起，则应弃取；若不能确定，则要借助于统计方法判定它是否是离群数据，若是则弃取，否则保留。
（置信度又称可信度、可信限、置信水平）
㈡.Grubbs检验法
1.适用性
n可大于10，可疑数据可以不止一个。
2.方法
⑴.只有一个可疑值
①.数据从小到大排列，找出可疑值；
②.求统计量
③.查T表；
若T计算>T表，可疑值舍弃，否则保留。
⑵.可疑值有两个或两个以上，并在同一侧
⑶.可疑值有两个或两个以上并分在平均值两侧
它可比前者更可靠（利用了全部数据），但不如前者简便、直观。
检验内侧；如保留，再检验外侧。
暂去一侧检验，之后再反过来检验。
三.分析数据的显著性检验
㈠.F检验法
1.适用
两组测定数据的精密度差异是否有显著性的检验。
2.方法：
⑴.计算S1、S2及S12、S22；
⑵.若S12>S22，计算F=S12/S22；
⑶.根据n1、n2及置信度（一般为95%），查F表；
若F计算＞F表，两组数据精密度之间的差异有显著性，反之差异没有显著性。
在定量分析中，当我们取得一系列数据以后，首先要考虑这些数据是否全部有效，如果有个别数据可疑，就需进行可疑值的取舍；其次还要判断是否存在系统误差，这就需要进行显著性检验。
通过显著性检验，如果存在显著性差异，则存在着系统误差；若无显著性差异，则误差只是由随机误差引起。
㈡.t检验法
1.适用：
测量平均值与标准值（或已知值）或两组测定平均值之间的差异是否有显著性的检验。
2.方法：
⑴.测量平均值与标准值的比较
①.计算t
②.查t表；
若t计算>t表，平均值与标准值之间的差异有显著性。
在定量分析中，当我们取得一系列数据以后，首先要考虑这些数据是否全部有效，如果有个别数据可疑，就需进行可疑值的取舍；其次还要判断是否存在系统误差，这就需要进行显著性检验。
通过显著性检验，如果存在显著性差异，则存在着系统误差；若无显著性差异，则误差只是由随机误差引起。
⑵.两组测定平均值的比较
①.对两组测定值进行F检验；
②.若F检验无显著性差异，计算t、S；
③.根据f=n1+n2-2及要求的置信度查t表；
若t计算 > t表，两组测定平均值之间差异有显著性。
在定量分析中，当我们取得一系列数据以后，首先要考虑这些数据是否全部有效，如果有个别数据可疑，就需进行可疑值的取舍；其次还要判断是否存在系统误差，这就需要进行显著性检验。
通过显著性检验，如果存在显著性差异，则存在着系统误差；若无显著性差异，则误差只是由随机误差引起。
四.平均值的置信区间
在选定的置信度下，总体平均值在以测定平均值为中心出现的范围。
有限次数平均值与总体平均值的关系：
平均值的可靠性是相对的，我们必须通过样本平均值来估计总体平均值即真值的存在范围。
s为标准偏差；n为测定次数；tα,n-1为显著性水平α、自由度f时的t值，可由表中查出。
一.卫生化学的内容与任务
二.分析方法的分类和分析结果的表示
第二章 误差和分析数据处理
§2.1误差及其表示方法
§2.2分析数据的处理
第一章 绪论
§3.1紫外可见分光光度法的基本原理
一.电磁辐射与电磁波谱
二.紫外可见吸收光谱
三.紫外可见吸收光谱与分子结构的关系
第三章 紫外可见分光光度法
作业:P46：1-3、5-7、补充。
随机误差的正态分布曲线
准确度与精密度的关系示意图
t 值表
补充题
一.名词解释
准确度、精密度、系统误差、随机误差。
二.问答
1.误差的分类?误差如何表示?
2.随机误差、系统误差的性质及减小方法?
3.系统误差的分类?
4.准确度和精密度的关系?
5.可疑数据如何取舍?
6.平均值的置信区间?
7.分析数据的显著性检验意义?方法?

紫外可见分光光度法
Ultraviolet-visible spectrophtometry；
UV-Vis，又称紫外可见吸收光谱法。
光谱分析法spectroscopic analysis
是利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立起来的定性、定量及结构分析方法。按物质粒子的类型分为原子光谱法和分子光谱法；
按光谱产生的机制分为吸收光谱和发射光谱；
按辐射波长不同分为γ射线光谱法、X射线光谱法、紫外可见光谱法、红外光谱法等。
第三章 紫外可见分光光度法
是目前应用最广、发展最早的一类光谱分析法。
是卫生分析中常用的分析方法。
紫外可见分光光度法的主要特点：
1.灵敏度高；2.选择性高；3.准确度较高；
4.仪器设备较简单，操作易掌握；
5.不仅可用于定量分析，还可用于定性分析。
紫外可见分光光度法：
是根据溶液中的物质的分子对200～760nm光谱区辐射能的吸收来进行定性、定量分析的方法。
第三章 紫外可见分光光度法
1.灵敏度高：在最佳测定条件下，其最低检测浓度可达10-7g·ml-1。
2.选择性好：在适当条件下，可在其它组分存在时，不需化学分离等手段而进行测定。
3.准确度较高：在仪器设备和其它测量条件比较好的情况下，其相对误差可减小到1～2%。虽然相对误差比重量法和滴定法要大，但对于微量组分的测定已经能够满足要求。
4.仪器设备较简单，操作易掌握：如用过的721、722等，它的分析速度也比较快，几分钟就可以得出测定结果。
5.不仅可用于定量分析，还可用于定性分析。
所以首先测定样品应配成溶液。是分子吸收。
那么什么是200～760nm光谱区辐射能？物质溶液如何对其吸收？其吸收与物质有什么关系？如何测定？这是我们这一章的重点。首先解决第一个问题。
一.电磁辐射与电磁波谱
㈠.电磁辐射electromagnetic radiation
电磁辐射：
是高速通过空间而不需要任何物质作为传播媒介的光量子流，也可简称为光。
它具有波粒二象性。
3.1紫外可见分光光度法的基本原理
它具有波粒二象性。
波动性：
表现在光的传播、反射、折射、衍射、干涉、散射等现象，可以用速度、频率、波长等参数来表征。c =λν，λ=1/σ
粒子性：
表现在光电效应等现象，如光照射到物质上可引起物质内部能量的变化，产生能级跃迁，即光的吸收、发射等现象。其可用每个光子具有的能量来表征。 E = hν = hc/λ
它具有波粒二象性。
物质对辐射能的吸收和发射是不连续的，量子化的。
当物质内的分子或原子发生能级跃迁时，若以辐射能的形式传递能量，则辐射能一定等于物质的能级变化： △E=E=hν= h c /λ
㈡.电磁波谱electromagnetic spectrum
电磁波谱： 是指按电磁辐射波长顺序排列的波谱。
1.单色光：指只有一个波长或频率的光。
2.复色光：经分光可以得到两种或两种以上的单色光的平行光为复色光或白光。
3.互补色光：以适当比例混合可以组成白光的两种单色光互称为互补色光。
实验证明：对于可见光区中各色光有一定的关系。
其中每种颜色的光都有一定的波长范围，λ界限不十分清楚。
二.紫外可见吸收光谱
㈠.物质对光的选择性吸收
物质对光的选择性吸收：
只有当入射光的能量恰好与物质的基态与激发态能量差相等时，物质对光可产生吸收的性质。 △E=E2-E1=hν
由于不同的物质内部结构不同，基态与各激发态能量差不同，即基态与各激发态能级跃迁所需能量不同；
所以物质只能吸收某一特定波长的光。物质对光的选择性吸收最常见的现象：不同的物质呈现不同的颜色。如果物质选择吸收白光中一种颜色的光，则物质将呈现出此光的互补色光颜色。若要对CuSO4溶液进行紫外-可见光谱分析，应选择什么颜色的光作为入射光？
㈡.吸收光谱absorption spectrum
（又称吸收曲线 absorption ）
吸收曲线：
让各种波长的单色光依次通过一定浓度的某吸光物质溶液，测定该溶液对各种单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到的曲线。紫外-可见吸收光谱的形状。同一物质不同浓度的溶液吸收曲线比较。
吸收曲线意义：
了解该物质对不同波长单色光的吸收程度；
了解λmax以有利于分析中最佳条件的选择；
为定性分析依据。它是描述物质对不同波长光的吸收能力的谱图。它决定于物质本身的结构，即激发态与基态能量差。其形状应为线状光谱，但实际上曲线的形状为带状光谱（即产生的是吸收带）。那么为什么吸收曲线为带状光谱？这应从分子吸收光谱如何产生来了解。
㈢.分子吸收光谱的产生
物质分子内部的三种运动形式：
1.电子绕原子核运动
能级相应为电子能级；能级差约为20～1ev，相当于60～1250nm波长的光，在紫外可见区。
2.原子在其平衡位置附近的振动
能级相应为振动能级；能级差约为1～0.05ev，相当于1.25～25μm波长的光，在红外区；
3.分子本身绕其重心的转动
能级相应为转动能级；能级差约为0.05～0.005ev，相当于25μm～250cm的光，在远红外区。
紫外可见吸收光谱的产生：
是由电子能级跃迁所产生，即此吸收光谱为电子光谱。
由于△E电＞△E振＞△E转，所以在物质吸收能量发生电子能级跃迁的同时，不可避免地会伴随发生振动能级及转动能级跃迁，但一般情况下分辨不出，观察到的只是这些谱线密集在一起合并而成的较宽的吸收带；因此分子的电子光谱为带状光谱。
只不过是不同的分子，电子跃迁所需能量不同，吸收光谱不同。
三.紫外可见吸收光谱与分子结构的关系
㈠.有机化合物的紫外可见吸收光谱
1.有机化合物的电子跃迁
有机化合物中的价电子：形成单键的σ电子；形成不饱和键的π电子；氧、氮、硫、卤素等杂原子上未成键的n电子。
有机化合物的电子跃迁类型:
跃迁的相对能量大小：
σ→σ* ＞n→σ* ＞π→π* ＞n→π* 。
有机化合物的紫外可见吸收光谱取决于分子中外层电子的性质，即由外层电子跃迁产生吸收光谱。
⑴.σ→σ*跃迁：
是一切饱和有机化合物都可产生的电子跃迁类型。需要的辐射能很大，处于远紫外区。如CH4的λmax为125nm，C2H6的λmax为135nm。
⑵.n→σ*跃迁：
是所有含有杂原子的饱和烃衍生物都可发生的电子跃迁类型。
所需要能量小于σ→σ* ，但大多数吸收峰仍出现在低于200nm的区域内。
⑶.π→π*跃迁：
发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，εmax很大，吸收峰随溶剂的极性增加而产生红移。π→π*跃迁的能量随着π-π共轭程度的增大而减少，产生的吸收峰长移，吸收程度增大。
⑷.n→π*跃迁：
发生在含有杂原子的不饱和化合物中，εmax比较小，吸收峰随溶剂的极性增加而产生短移。
→π*、n→π*跃迁的重要差别是：
摩尔吸光系数不同：前者大，约104数量级，后者小，一般在10～100范围内；
溶剂的极性对吸收峰波长影响不同：在极性溶剂中前者吸收峰长移（红移），后者吸收峰短移（紫移或蓝移）。
生色团chromophore：
是指能提供π电子的不饱和基团。如＞C=C＜、＞C=O、-N=N-、-NO2、＞C=S等。
助色团auxochrome：
是指能使生色团的吸收峰长移的杂原子基团。如-OH、-NH2、-OR、-SH、-Cl、-Br、-I等。
2.有机化合物的吸收带absorption band
⑴.R吸收带：
由n→π*跃迁产生。
εmax≈100，有时被较强的吸收带掩盖；
在极性溶剂中，吸收带发生短移（紫移或蓝移）。
⑵.K吸收带：
由π→π*跃迁产生。εmax＞104；共轭程度大吸收峰长移，ε增大；在极性溶剂中，吸收带发生长移（红移）。
⑶.B吸收带（精细结构吸收带）：
由π→π*跃迁和苯环的振动重叠产生。在230～270nm（256nm）之间，为一系列较弱的吸收峰（称精细结构吸收带），εmax≈200。是芳香族化合物的特征吸收带，在较强的溶剂中会失去其精细结构现象。
⑷.E吸收带：
由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的π→π*跃迁产生。可分为E1（185nm、ε≈47000）；E2（204nm、ε≈7900）。也是芳香族化合物的特征吸收带。
㈡.无机化合物的紫外可见吸收光谱
1.f电子跃迁吸收光谱3.电荷迁移光谱
基于一个电子从配位体轨道跃迁到中心离子轨道产生（金属配合物）。
强度很大。基于内层f电子跃迁产生。（对于镧系或锕系元素的离子）
由一些狭窄的特征吸收峰组成，不受金属离子所处的配位环境影响。
基于d电子能级间跃迁产生。对于过渡金属离子）吸收带较宽，强度不大，吸收峰强烈地受配位环境影响。
1.温度2.溶剂
溶剂效应：
是指溶剂极性对溶质吸收峰位置、强度及形状的影响。
⑴.溶剂极性越强，对R吸收带短移；⑵.溶剂极性越强，对K吸收带长移；⑶.极性溶剂中，B吸收带的精细结构消失。另外应注意溶剂的纯度。
3.pH值
㈢.影响紫外可见吸收光谱的因素
室温下，温度影响不大。
因此，在溶液溶解度允许的范围内，应选择极性较小的溶剂。
由于很多化合物具有酸性或碱性可解离基团，所以在不同pH值溶液中，分子的解离形式可能会发生变化，从而其吸收光谱的形状、最大吸收波长及吸收强度也会不一样。
§3.1紫外可见分光光度法的基本原理
一.电磁辐射与电磁波谱二.紫外可见吸收光谱三.紫外可见吸收光谱与分子结构的关系
第三章 紫外可见分光光度法
§3.1紫外可见分光光度法的基本原理
四.Lamber-Beer定律
§3.2紫外可见分光光度计
第三章 紫外可见分光光度法
作业:P68：1-2、补充 。
电磁波谱
可见光区中各色光的关系
其每个电子能级含有若干个振动能级；每个振动能级含有若干个转动能级；
这些能级都是量子化的，即是不连续的。
E = hν = hc/λ E：光子能量，ev或J（1ev=1.602×10-19J）；
h：普朗克常数（plank），值为6.626×10-34J·s；
ν：频率，Hz即s-1；
c：光速，2.998×1010cm/s；
σ：波数，cm-1；
λ：波长;根据电磁波的不同区域，可分别用m、cm、mm、μm、nm、pm表示。
（1m=102cm=103mm=106μm=109nm=1012pm）
高锰酸钾的吸收光谱
1.浓度不同，吸光度在同一波长下不同，即吸光度与溶液浓度有关；
2.浓度不同，λmax相同，图形相似。
因此吸收曲线取决于物质本身的结构，而不在于浓度。
吸收曲线中有极大值的部分称为吸收峰，最大吸光度所对应的波长为最大吸收波长λmax。（峰、谷、肩峰、末端吸收）
特征是形状（峰、谷、肩峰、末端吸收）、最大摩尔吸光系数、最大吸收波长。
分子中价电子能级跃迁示意图λ/nm (环己烷溶剂)
一.名词解释
电磁辐射、电磁波谱、生色团、助色团。
二.问答
1.什么是吸收曲线？制作吸收曲线有何实际意义？
2.什么是溶剂效应？溶剂的极性对R吸收带、K吸收带、B吸收带有何影响？
3.为什么常用饱和烷烃作为紫外-可见光谱法中的溶剂？
4.对高锰酸钾溶液进行分析，应选择什么颜色的入射光？为什么？
5.分子吸收光谱是如何产生的？其光谱为何为带状光谱？
二.计算
波长为200nm、400nm、760nm的光的能量（ev）。

第三章 紫外可见分光光度法
§3.1紫外可见分光光度法的基本原理
㈡.定律
Lambert定律为：
一种适当波长的单色光照射到一定浓度C的溶液时：A与b成正比。
Beer定律为：
一种适当波长的单色光照射到某一溶液时，若b不变，则：A与C成正比。A=KbC
简称为Beer定律。
它是均匀、非散射介质对光吸收的基本定律。是分光光度法进行定量分析的基础。
㈢.吸光系数
1.表示方法
⑴.吸光系数a：
浓度为1g/L，液层厚度1cm时，溶液的吸光度。
单位：L/(g·cm)
⑵.比吸光系数或百分吸光系数 ：
浓度为1g/100ml，液层厚度1cm时，溶液的吸光度。单位：100mL/(g·cm)
⑶.摩尔吸光系数ε，
浓度为1mol/L，液层厚度1cm时，溶液的吸光度。单位：L/(mol·cm)
三者关系： ε= Ma =10a
2.影响ε的因素 ⑴.物质本性；⑵.溶剂性质；⑶.光的波长；⑷.单色光的纯度。
3.增大ε的方法 ⑴.使待测物质转变为ε大的物质测定；⑵.选择λmax测定。
溶剂:单色光纯度:
㈣.偏离Beer定律的因素
1.与试样溶液有关的因素 溶液浓度的影响 体系(介质)不均匀的影响 化学因素的影响
2.与仪器有关的因素 非单色光的影响 杂散光的影响 散射光和反射光的影响 非平行光的影响
§3.2紫外可见分光光度计
一.分光光度计的主要部件
㈠.光源light source
作用：发出一定强度、一定波长范围的、良好稳定性的连续光谱。
常用的光源：1.钨灯 发出的连续光谱波长范围为350～2500nm。
2.氢灯或氘灯 发出的连续光谱波长范围为150～400nm。
氢灯和氘灯的区别在于氘灯比氢灯的光强。
㈡.单色器monochromator
作用：从波长范围较宽的光线中分出单色光。
入光狭缝的作用是限制杂散光进入。
准直元件的作用是把来自狭缝的光束转化为平行光。
色散元件的作用是将复色光分解为单色光。
聚焦元件的作用是将来自于色散元件的平行光束聚焦于出光狭缝上。
出光狭缝的作用是将额定波长范围的光射出单色器。
1.棱镜prism 是根据不同波长的光有不同的折射率而使连续光谱色散的光学元件。
⑴.玻璃棱镜:透射范围为340～1000nm。 ⑵.石英棱镜:透射范围为185～3500nm。
2.光栅grating 是根据光的衍射原理使光色散的光学元件。
特点: 分辨率高，即单色光纯； 应用的波长范围广，为几nm～几百μm。
实际应用时狭缝的选择也影响着测定的灵敏度。棱镜与光栅不同在于: 光栅的分辨本领高；
使用波长范围宽； 色散近乎线性。
表示狭缝的宽度有两种方法：
⑴.狭缝的实际宽度，0～2mm。⑵.通过出射狭缝的谱带宽度，nm，它可直接了解光的单色性的好坏。
㈢.吸收池absorptiom cell
又称比色皿、比色杯、液槽等。 作用：盛放样品液。 1.玻璃比色皿 2.石英比色皿
比色皿的使用: 注意透光性并保证光程不变。
㈣.检测器detector
作用：把光信号转变为电信号。
㈤.显示系统display system
作用：将检测器输出的信号经处理转换成透光度和吸光度，再显示出来。
显示方式有表头显示、数字显示等。
二.分光光度计的类型
㈠.单波长单光束分光光度计
目前国产的721型、722型和751型、752型分光光度计都属于此种类型。
特点：
㈡.单波长双光束分光光度计
特点： 1.可自动消除电源电压波动的影响； 2.可自动扫描出吸收曲线； 3.构造比较复杂。
㈢.双波长分光光度计
特点：可以在有背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下对某组分进行定量测定。
补充题
一.问答
1.偏离Beer定律的因素？
2.紫外-可见分光光度计框图、各部件及作用？
3.紫外-可见分光光度计类型的框图及分析过程？
二.计算
1.浓度为0.51μg/mL的Cu2+溶液，用环己酮草酰二腙显色后，于600nm处，用2cm吸收池测量，测得T=50.5%，求：吸收系数、摩尔吸收系数、百分吸收系数。（MCu=63.54）

第三章 紫外可见分光光度法
§3.3分析条件的选择
一.溶剂的选择 二.显色反应条件的选择
显色反应: 能使化合物的溶液在紫外可见区有吸收的反应。
显色反应目的： 使一些在紫外可见光区无吸收或吸收很小的物质生成在紫外可见光区有吸收或吸收较大的物质。 显色反应在紫外可见分光光度法中应用比较多。
㈠.显色反应的要求：
1.生成物必须在紫外可见区有较强的吸收能力; 2.待测组分应定量地转变成有色化合物;
3.反应应有较高的选择性; 4.生成物组成应恒定、稳定，符合一定化学式；
5.生成物的颜色与试剂颜色应有明显的差别。
常见的显色反应:
配位反应、氧化还原反应以及增加生色团的衍生化反应等。
因此我们要想减小其测定误差就应想法满足上述要求，而满足上述要求的关键在于选择合适的显色反应和显色反应条件。
㈡.显色反应条件的选择
1.显色剂developer的用量 Me + R MeR
显色剂的加入量必须过量、适量、定量。 最佳显色剂用量应由实验来确定。
2.酸度 最适宜的酸度范围应通过实验来确定。
3.显色时间和温度 显色反应温度也应由实验确定，并且同一物质测定应在相同温度下进行。
三.测量条件的选择
㈠.吸光度读数范围的选择
㈡.测量波长的选择 最大吸收原则。 但尖锐时选择次吸收峰。
㈢.狭缝宽度的选择 精密仪器狭缝可调。
原则： 以减小狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。 一般狭缝宽度约是试样吸收峰半宽度的1/10。
㈣.参比溶液reference solution的选择
参比溶液也称空白溶液blank solution
作用： 调节仪器吸光度零点； 以抵消吸收池和溶剂对入射光的影响；还可抵消试剂或样品基底在测定波长处由吸光度所引起的干扰。
实际测量时： 要先用参比溶液调节透光率为100%； 以消除溶液中其他成分以及吸收池和溶剂对光的吸收所带来的误差。
1.溶剂参比 作用：抵消溶剂、比色皿等因素的影响。
2.试样参比 作用：可抵消样品基底在测定波长处产生的干扰。
3.试剂参比 作用：抵消显色剂等其它试剂所产生的干扰。
4.平行操作参比 作用：可抵消样品基底在测定波长处的干扰。
用于溶液中只有待测物在测定波长处有吸收；其它成分（包括试剂、样品基底等）均无吸收。
用于样品基底有吸收，而显色剂无吸收，并且不与样品基底显色的情况。
一.定性分析 定性分析依据:吸收曲线 定性分析方法:对照法
二.定量分析 定量分析依据： Lambert-Beer定律 A=εbC
定量方法：
§3.4定性及定量分析
㈠.标准曲线法
方法：配制一系列不同浓度的标准溶液；在相同条件下测定吸光度值；以A为纵坐标，C为横坐标作图；在相同的条件下，测未知液的吸光度值；标准曲线上找出该吸光度值所对应的浓度。
注意：
⑴.至少应做五个点；⑵.最低点和最高点的浓度约差一个数量级；⑶.测定应在同条件下进行。
㈡.标准对照法（又称直接比较法） 被测物质应严格符合Lambert-Beer定律。
方法： 配制某一浓度CS的标准溶液； 在相同条件下测CS及Cx的吸光度AS和Ax；
根据公式求出Cx：
注意：⑴.CS尽可能与Cx相近； ⑵.测Ax、AS的条件应完全一致。
㈢.联立方程组法
紫外可见分光光度法在预防医学中的应用
一.生活饮用水中铅的测定
弱碱性溶液中，二硫腙三氯甲烷溶液与铅离子反应，生成红色二硫腙铅螯合物。
二.苯酚的分光光度法测定
苯酚与4-氨基安替比林在碱性(pH=8～10)介质中与氧化剂铁氰化钾作用，生成红色安替比林染料。
三.空气中二氧化硫的测定 四.水中亚硝酸根的测定
补充题
一.问答
1.仪器测量条件如何选择？
2.显色反应及条件如何选择？
3.参比溶液作用？如何选择？
4.单组分定量方法？多组分定量依据?方法?

第四章分子荧光分析法
§4.1基本原理
特点： 1.灵敏度高；2.选择性强； 3.样品用量少、操作简便、重现性好； 4.应用范围不够广泛。 若物质吸收光能后的激发态以电磁辐射形式释放能量回到基态，称为光致发光。
常见的光致发光有荧光和磷光。
一.分子荧光的产生
㈠.分子的电子能级
单重态:电子自旋配对的电子能态，S表示。
三重态:电子自旋方向相同的电子能态，T表示。
激发单重态:受激电子的自旋仍保持相反的电子能态。
激发三重态:受激电子的自旋反转为相互平行的电子能态。
激发单重态比激发三重态的平均寿命短；
基态单重态到激发三重态的跃迁为禁阻跃迁；
激发三重态的能量比激发单重态的能量低。
根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。
㈡.荧光的产生
1.激发过程：
当分子吸收光能量后，处于基态最低振动能级的分子跃迁到第一电子激发态以至更高激发态的各个不同振动能级，成为激发单重态分子的过程。
2.去激发过程：
处于激发态的分子不稳定，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放多余能量返回至基态的过程。
荧光：
荧光物质在激发光作用下，吸收光从基态跃迁到激发态，
激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，返回到第一电子激发态的最低振动能级，
然后以辐射跃迁的形式释放能量，返回到基态的各个振动能级所发出的光。
荧光的滞留时间为10-8秒。
荧光的特点：
⑴.荧光与物质分子被激发到哪一个能级无关； ⑵.发射出的荧光能量小于或等于吸收光的能量，即发射的荧光波长要大于或等于吸收光波长；⑶.光源除去，荧光即刻熄灭。
二.激发光谱与荧光光谱
㈠.激发光谱
是固定荧光波长，改变激发光波长; 测定不同波长的激发光激发所得到的荧光强度;然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图得到的光谱。荧光物质的最大激发光波长λex :是定性分析的依据;是定量分析的最灵敏条件。
实质上是荧光物质的吸收光谱，只不过是以荧光强度F代替了吸光度A。
㈡.荧光光谱
是固定激发光的波长和强度，让物质发射的荧光通过单色器分光;测定不同荧光波长下的荧光强度；然后以荧光波长为横坐标，荧光强度F为纵坐标作图所得到的光谱。荧光物质的最大荧光波长λem :是定性分析的依据；是定量分析的最灵敏条件。
㈢.激发光谱和荧光光谱的形状及相互关系
激发光谱与物质的吸收光谱形状相似；激发光谱可能有多个谱带；荧光光谱只能有一个谱带；荧光波长比激发光波长稍长；激发光谱与荧光光谱呈镜像对称关系。
三.荧光强度与分子结构的关系
㈠.物质产生荧光的必要条件：
1.物质分子必须具有能够吸收紫外可见光的结构；
2.物质分子在吸收了特征频率的辐射能之后，必须具有较高的荧光效率。
㈡.荧光与分子结构
1.跃迁类型 π→π*跃迁的ε大， 由此能发出较强的荧光，φF大 。
2.共轭π键结构 分子共轭程度越大，ε越大，φF越大，发出的荧光越强，荧光光谱长移。
3.刚性平面结构 共平面性越强。φF越大。
4.取代基的类型
给电子基团能增加分子的π电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。OH、-NH2、-NHR、-NR2、-OR、-CN等。
吸电子基团能减弱分子的π电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。-COOH、 -X、-NO2、-NO、 -SH、 -C=O、 -SH、等。
取代基对π电子共轭体系作用较小的基团，对荧光影响不明显。-R、 -SO3H、-NH3+等。
四.荧光强度与荧光物质浓度的关系
五.影响荧光强度的外部因素
㈠.温度 随着温度降低，荧光效率和荧光强度将增加。
㈡.溶剂
1.极性 荧光波长随溶剂极性增大而红移，荧光强度增强；
2.粘度 荧光强度可随溶剂粘度的减小而减小；
3.纯度 原因： 温度升高时，介质粘度减小，分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，增加了分子的无辐射跃迁，降低了荧光效率。
另外有些荧光物质在较高温度下会发生光分解，导致荧光效率降低。
㈢.散射光scattering light
1.种类
⑴.瑞利散射光 光子与物质分子碰撞时，未发生能量改变，仅光子运动方向改变的散射光。
主要由溶剂、胶体及容器壁散射等引起。
⑵.拉曼散射光 光子与物质分子碰撞时，不仅发生运动方向的改变，而且还发生了能量改变的散射光。主要由溶剂产生。
2.消除方法
⑴.选择适宜的激发光波长
因为用不同波长激发光照射荧光物质时，所产生的荧光峰波长是相同的，但产生拉曼峰波长不同。
⑵.选择合适的溶剂
因为拉曼光主要来源于溶剂，对于同一激发光在不同溶剂下，所产生的拉曼峰不同。
㈣.酸度
1.影响荧光物质的存在形式 2.影响荧光配合物的组成 应通过实验来确定最佳pH值范围。
㈤.猝灭剂 荧光猝灭：是指荧光物质与共存物质发生作用使F显著下降的现象。荧光熄灭剂：能引起荧光物质荧光熄灭的物质。
常见的荧光熄灭剂：X-、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羰基化合物等。

不同波长激发下主要溶剂的拉曼光波长
(a)硫酸奎宁，320nm激发；(b)0.05mol/LH2SO4，320nm激发；
补充作业
概念
荧光、辐射跃迁、无辐射跃迁、荧光效率、瑞利散射光、拉曼散射光。
问答
1.何为激发光谱？荧光光谱？二者有什么关系？其在工作中意义？
2.物质能产生荧光必须具备的条件是什么？
3.为什么荧光物质的荧光波长比其吸收的激发光波长长？
4.为什么说激发光谱是该物质的表观吸收光谱？
5.在什么条件下，荧光强度与浓度成正比？
6.影响荧光强度的因素有哪些？

§4.2荧光分光光度计
由激发光源发出连续光谱，经过激发光单色器，得到所需要的激发光波长；照射到样品池中的荧光物质，产生荧光；让与光源方向垂直的荧光经过发射光单色器，滤去激发光所产生的反射光、溶剂的散射光和溶液中杂质荧光，只让被测组分一定波长的荧光通过；然后由检测器检测，经放大后显示荧光强度。
一.光源 要求：稳定、强度大、适用波长范围宽。
二.单色器（光栅）
㈠.第一单色器（激发单色器）
作用：滤去非特征波长的激发光，让所选择的激发光透过并照射于被测试样上。
㈡.第二单色器（发射单色器）
作用：滤去由容器产生的反射光、溶剂的散射光及溶液中杂质所产生的荧光，只让样品溶液所产生的荧光通过并照射在检测器上。
三.液槽 由石英材料制成，形状为散射光较小的方形。
四.检测器 常用的检测器为光电倍增管。 检测后，经放大输入记录仪，得出相应的F。
§4.3定性和定量分析
一.定性分析
定性分析依据：激发光谱和荧光光谱。 定性分析方法：对照法。
二.定量分析
定量分析依据：F=KC （一定条件下，A≤0.05）
定量分析方法：标准曲线法和标准对照法。
测定时：常用一个稳定的荧光物质的标准溶液作为对照品溶液； 调节荧光强度读数为100%或50%来校正仪器。 要求对照品溶液荧光峰与试样的荧