驴Zfy基因干扰载体的构建及验证.pdf

第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.4Aug.2023收稿日期:2022-09-19 基金项目:山东省农业重大应用技术创新项目(SD2019XM008),新疆维吾尔自治区重点研发计划项目(2020B01002-2-1)作者简介:李梦雨(1996),女,硕士研究生,专业方向为动物遗传育种与繁殖研究。通信作者:贾斌(1965),男,教授,从事动物遗传育种与繁殖研究,e-mail:jiabin 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.2023.22.033文章编号:1007-7383(2023)04-0435-06 驴 Zfy 基因干扰载体的构建及验证李梦雨1,孙玉江2,李超程1,吕毅航1,范洪先3,郑新宝3,肖海霞3,贾斌1(1 石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832003;2 青岛农业大学生命科学学院,山东 青岛 266109;3 新疆畜牧科学院畜牧研究所,新疆 乌鲁木齐 830000)摘要:目的 探讨干扰驴 Zfy 基因的体内外干扰效果。方法 根据驴 Zfy 基因设计合成 4 段 shRNA,并由独立的 U6 启动子启动,每两个 shRNA 片段串联组合成干扰载体,体外培养生精细胞检测干扰载体的干扰效率,筛选最佳的干扰载体用于体内验证干扰效果。结果 结果显示:构建出 2 个驴 Zfy 基因双 shRNA 串联重组干扰载体 CV250-1、CV250-2,细胞水平验证结果表明 CV250-1 的干扰效率为 76.37%6.36%,差异极显著(P0.01);CV250-2 的干扰效率为 67.73%4.94%,差异显著(P0.05)。成功对 CV250-1 重组载体进行体内验证,经母体静脉血胎儿游离DNA 性别鉴定得到胎儿雌性率为 71.05%(P0.05)。结论 成功构建的驴 Zfy 基因重组载体 CV250-1,可抑制种公驴睾丸组织 Zfy 基因的表达,细胞水平干扰效率为 76.37%,体内试验胎儿雌性率为 71.05%,差异显著(P0.05)。关键词:驴;Zfy 基因;串联干扰载体;性别控制中图分类号:S822文献标志码:AConstruction and verification of Zfy gene interference vector in donkeyLI Mengyu1,SUN Yujiang2,LI Chaocheng1,LYU Yihang1,FAN Hongxian3,ZHENG Xinbao3,XIAO Haixia3,JIA Bin1(1 Shihezi University,College of Animal Science and Technology,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Qingdao Agricultural University,College of Life Science,Qingdao,Shandong 266109,China;3 Institute of Animal Science,Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinjiang 830000,China)Abstract:Objective To explore the effect of interfering Zfy gene in donkey in vitro and in vivo.Method Four segments of shRNA were designed and synthesized according to the donkey Zfy gene,and were initiated by an independent U6 promoter.Each 2 shRNA seg-ments were combined in series to form an interference vector.The spermatogenic cells were cultured in vitro to detect the interference efficiency of the tandem interference vector,and the best ones were screened.Tandem interference vectors were used to verify the inter-ference effect in vivo.Results The results showed that two donkey Zfy gene double shRNA tandem recombinant interference vectors CV250-1 and CV250-2 were constructed.The results of spermatogenic cell level verification showed that the interference efficiency of CV250-1 was 76.376.36%,and the difference was extremely significant(P0.01);the interference efficiency of CV250-2 was 67.734.94%,and the difference was significant(P0.05).The CV250-1 recombinant vector was successfully verified in vivo,and the fetal female rate was 71.05%(P0.05)through the identification of fetal cell-free DNA in maternal venous blood.Conclusion The constructed donkey Zfy gene recombinant vector CV250-1 can inhibit the expression of Zfy gene in the testis tissue of male donkeys.The interference efficiency at the cellular level is 76.37%,and the fetal female rate in the in vivo test is 71.05%,with significant differences(P0.05).Key words:donkey;Zfy gene;tandem interference vector;sex control阿胶和驴乳产业的飞速发展,使驴皮和驴乳出现供不应求的现状,驴繁殖力低成为制约驴产业发展最直接的问题1。因此,研究驴的性控技术,扩大繁殖母驴数量,实现高效快速扩繁种群,定向培育母畜群体势在必行。睾丸决定因子 TDF(testis-determining factor)的436 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷发现,使胚胎阶段的性别分化成为研究热点。研究发现在 Y 染色体短臂上存在可以调控精细胞转化为精子的基因2,分别是睾丸决定因子 SRY、精原细胞增殖因子 Eif2s3y3和影响精子成熟的转录因子Zfy24。多种研究表明,Zfy 基因是 C2H2 锌指蛋白转录因子(ZNFs)的家族成员之一,当敲除 Zfy 的双等位基因发现细胞生长和增殖出现缺陷5。随后研究发现,Zfy 基因通过“锌指”结构域来调控其他基因的表达,影响精子的发生过程6。RNAi 技术作为疾病靶向基因治疗的新手段,已被用于各种疾病的治疗。应用 RNAi 技术沉默 Zfy 基因表达,使精子在生精阶段相关基因表达量变化,从而影响 Y 精子活力、畸形率等,Y 精子与卵子结合的几率降低,而 X 精子不受影响,从而达到精子发生阶段控制性别的目的。本研究应用 RNAi 技术针对驴 Zfy 基因编码区设计 RNA 干扰片段,构建 shRNA 串联载体,通过睾丸注射技术,干扰 Zfy 基因表达,使精子在发生阶段Zfy 基因表达下降,从而影响 Y 精子的发育,降低受精几率,最终实现多产母驴的目标。为快速扩繁种群提供理论依据。1 材料与方法1.1试验试剂及仪器无内毒素质粒大提试剂盒、血液基因组 DNA 提取试剂盒(北京天根生化有限公司);胎牛血 清、DMEM/F12(美国 Gibco 公司);胰岛素、FSH、睾酮、视黄酸、转铁蛋白、胶原酶、透明质酸酶、维生素A、C、E(美国杰华科技有限公司);丙酮酸、胰蛋白酶、DNase(北京索莱宝科技有限公司);脂质体 2000(invitrogen);TBGreen PremixExTaqTM(TaKaRa);QI Aamp DNA Mini and Blood Mini Hand book(凯杰生物工程有限公司)。核酸蛋白检测仪(德国 Thermo 公司);荧光定量 PCR 仪(美国 Bio-Rad 公司)。1.2试验动物驴睾丸组织采自新疆石河子九昌驴业有限公司屠宰的青年健康新疆驴新鲜睾丸。种公驴、空怀母驴由新疆喀什泽普县金胡杨牧业有限公司提供,6 头 46 岁青年健康德州公驴,若干头经产健康新疆母驴。经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准,伦理批准号分别为2020-051-01、2019-061-01,自觉遵守试验动物福利伦理原则,保障动物福利及安全。1.3主要试验方法1.3.1设计 shRNA 序列根据 NCBI 提供 的驴 Zfy 基 因 与 Zfx 基 因 的CDS 区序列,选择两者碱基差异较大区域设计 4 段siRNA。分别添加 loop(颈环)、靶点反义序列及终止密码子合成 shRNA 干扰片段,为每段 shRNA 添加 U6 启动子。将设计好的序列交由上海吉凯生物技术有限公司合成。siRNA 序列信息如表 1 所示。表 1siRNA 序列信息片段名称序列siRNA-AGAGGATGACTTGGGTGGTAsiRNA-BTAGATATCGTGGAGAGTGAsiRNA-CGGATACAGAGTTGGAAATTsiRNA-DGATGGTTCGTCTGGAATGA1.3.2构建 shRNA 串联干扰载体选择 4.7 kb 质粒载体 CV250,将合成好的 shR-NA 片段与载体重组,构建 CV250-2shRNA 串联干扰载体,并分别命名为 CV250-1、CV250-2。shRNA序列和串联载体构建如图 1 所示。图 1shRNA 序列和 CV250-2shRNA 串联载体构建第 4 期李梦雨,等:驴 Zfy 基因干扰载体的构建及验证437 1.3.3细胞水平验证串联干扰载体采集成熟驴睾丸组织,采用两步酶消化法分离出睾丸支持细胞和生精细胞,并放入完全培养液7中在 35 、5%CO2、湿度为 95%的条件下培养 24 h,用脂质体 2 000 作为转染试剂将 1.3.2 中保存的载体转染到生精细胞中,每组重复 3 次。转染 58 h后提取生精细胞的总 RNA,设计 qRT-PCR 引物,以驴 GAPDH 基因为内参基因,以重组载体转染的细胞为试验组,未进行转染的细胞为对照组,检测重组串联干扰载体转染生精细胞后,Zfy 基因的相对表达量,计算重组串联干扰载体的干扰效率,选择高效重组串联干扰载体。试验所用引物如表 2 所示。表 2Zfy、Zfx、GAPDH 引物设计序列引物名称序列片段长度/bp退火温度/扩增长度/bpZfyF:CCTGTGGAGCAGCAAGATGACAAA24R:CATGGTCATTCCAGACGAACCATCC2560105ZfxF:GATGCAACAGGAGCTGATGCTACA24R:CTGAGTCTGGGTCATCAGGAACAAAG2660136GAPDHF:GCGATGCTGGTGCTGAATATGTTG24R:GCAGAAGGAGCAGAGATGATGACC24601151.3.4体内验证串联干扰载体将 1.3.3 中经细胞水平筛选的高效重组载体CV250-1 用于动物体内干扰试验。根据驴睾丸体积使用睾丸注射法将质粒注射进入驴睾丸组织中,共注射 3 针,每隔 10 天注射 1 次,每头驴每侧睾丸每次注射 3 mg 质粒,第 3 针结束后间隔 6 天进行人工授精。因驴的妊娠期时间约 365 d,妊娠周期较长。因此,为加快试验进程,参照前人的研究7,选择 18 周孕驴外周静脉血血浆进行胎儿游离 DNA 性别鉴定,统计后代性别,得到重组干扰载体干扰后代的雌性率。设计牙釉蛋白引物,以对照组(阳性对照:种公驴 DNA;阴性对照:空怀母驴 DNA)和试验组(怀孕母驴)的胎儿游离 DNA 为模板,进行 PCR 扩增及电泳检测。牙釉蛋白引物见表 3。表 3AMEL 引物序列信息基因名称引物序列退火温度/阴性对照/bp阳性对照/bpAMELF:AGTTCCTGGCCAACACTCR:GCTGGCCAAGCTTCCAGA582372372221.4数据处理与统计分析本试验采用 Excel 整理初始数据,qRT-RCR 数据采用 2-CT进行计算,采用 SPSS 26.0 软件对数据进行单因素方差分析(AVONA),统计结果以平均数标准误(MeanSD)表示,“”表示(P0.05)差异显著,“”表示(P0.01)差异极显著。2 结果与分析2.1shRNA 串联干扰载体的构建菌液 PCR 电泳结果如图 2 所示,得到重组载体CV250-1 质粒经菌液 PCR 扩增出 1 101 bp 阳性克隆转化子,CV250-2 质粒扩增出 1 110 bp 阳性克隆转化子,测序结果与菌液 PCR 结果一致,表明干扰载体构建成功。2.2干扰载体在生精细胞中的功能验证体外共培养生精细胞和支持细胞,在显微镜下观察到贴壁生长的支持细胞和附着于支持细胞上的生精细胞,生精细胞多呈圆形,中间可明显观察到黑色细胞核。用 2 个重组干扰载体和 1 个空白组转染生精细胞 24 h 后,观察到转染干扰载体组有绿色荧光,表明干扰载体成功转染进入细胞,在转染组荧光表达量达到最高 58 h 时,使用荧光显微镜激发绿色荧光,结果如图 3 所示。1:ddH2O;2:空载自连组;3:GAPDH;M:Marker;5-10:1-6 号阳性克隆菌。图 2菌液 PCR 电泳结果图438 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷A:刚分离出来的生精细胞;B:转染 58 h 生精细胞(20 倍);C:转染 58 h 生精细胞(40 倍);D:转染 58 h 生精细胞荧光观察。图 3驴生精细胞转染串联干扰载体荧光图以未转染细胞为对照组、转染干扰载体的细胞为试验组,将提取的 mRNA 反转录成 cDNA,qRT-PCR 检测结果如图 4 所示,与对照组细胞 mRNA 的相对表达量 103.0411.68%相比,CV250-1 干扰组的相对表达量下调了 76.37 6.36%,差异极显著(P0.01);CV250-2 干扰组的相对表达量下调了67.734.94%,差异显著(P0.05)。CV250-1 和CV250-2 经细胞水平筛选,皆可有效干扰细胞内Zfy 基因表达,可用于驴体内试验。由于 CV250-1具有更好的干扰效果,后续选择 CV250-1 用于动物体内试验。肩注表示差异显著(P0.05),同行肩注 表达差异极显著(P0.01);下同。图 4驴对照组、试验组生精细胞 Zfy 基因 mRNA相对表达量2.3串联干扰载体的体内检测效果评估性控精液(睾丸注射 Zfy 基因串联干扰载体)、非性控精液(空白处理组)人工授精后 B 超检查受胎结果如表 4 所示,性控组的受胎率为 61.72%,非性控组的受胎率为 67.4%。表 4性控精液与非性控精液受胎率统计表配种头次怀孕头数情期受胎率/%性控组815261.72非性控组1359167.4使用阳性对照(种公驴)、阴性对照(空怀母驴)血液 DNA、性控组怀孕母驴血浆提取的胎儿游离DNA 为模板,PCR 扩增 AMEL 基因,结果如图 5 所示。1 号泳道公驴阳性对照扩增出 2 条带,2 号泳道为空怀母驴阴性对照扩增出 1 条带,符合预期,3 号泳道为无酶水空白对照扩增结果无条带。从性控组结果可明显看出泳道 5、8 与公畜阳性对照相同,确定子代为雄性;泳道 4、6、7、9、10、11 与母畜阴性对照相同,确定子代为雌性。M:Maker;1:阳性对照;2:阴性对照;3:空白对照;5、8:公;4、6、7、9、10、11:母。图 5试验组胎儿游离 DNA PCR 产物电泳图统计胎儿性别鉴定结果,并分析后代性别比例,结果如表 5 所示:CV250-1 干扰载体性控组子代雌性率为 71.05%(P0.05)。表 5性控与非性控子一代性别数据统计年份雌性/头雄性/头雌性率/%2021-2022(性控)271171.052019-2021(非性控)12513148.833 讨论锌指蛋白转录因子 Zfy 基因曾作为睾丸决定因子的候选基因而备受关注8。在随后的研究中发现有两个 Y 染色体的基因足以使生殖细胞在辅助受精中起作用并产生活的后代9,即睾丸决定因子 SRY 和精原增殖因子 Eif2s3y。随着 SRY 基因的功能被不断挖掘,Zfy 基因被逐渐的遗忘了,花了 20 多年时间才重新出现,扮演新的生精角色。Yamauchi10的研究表明,小鼠的 Y 染色体上 Zfy2 促进精子形态发生,提高圆形精子细胞注射(ROSI)的成功,并且是形成精子的必要条件,能够在卵母细胞胞质内注射后产生活的后代。Zfy2 基因的存在使圆形精子第 4 期李梦雨,等:驴 Zfy 基因干扰载体的构建及验证439 细胞能够启动和经历头部形态发生和完整的尾部发育。通过研究发现添加 Zfy2 基因到雄性 Y 染色体缺陷的个体中,发现圆形精子细胞阶段减数分裂后停滞,证明了 Zfy2 在辅助受精中负责精子功能的形成4。在本研究中,当干扰 Zfy 基因后,发现子一代的性别相比于对照组发生明显偏移,影响了圆形精子细胞的正常发育,使 Y 精子的受精几率降低,X精子不受影响,与理论相符。但在后续的研究中还需验证注射干扰载体后,对下游基因表达产生的影响。在驴中,Y 染色体上只有一个单一的 Zfy 基因,没有 Zfy 突变的描述,因此,关于 Zfy 基因在精子发生中的生物学功能可能引发研究员们对性控研究的重新评估。汪存利11的研究表明,体外培养生精细胞会随着支持细胞功能的衰落而退化,要想稳定的培养生精细胞还需探寻与支持细胞功能相近的存活时间长的饲养层细胞。本试验培养驴的生精细胞,在这些研究的基础上进行改进,在支持细胞贴壁后即进行转染试验,以防止生精细胞退化影响试验结果。但无法进行生精细胞的生长传代,在后续的研究中还需要探索生精细胞的生长及传代的方法。睾丸注射是将外源基因整合到雄性生殖系细胞中,从 而 获 得 转 基 因 精 子 的 方 法12-13。Amaral等14在研究中发现,使用睾丸注射法生产转基因小鼠,会导致小鼠生殖器官损坏,生精细胞的数量降低,曲细精管的功能损坏。李福兵15的研究认为睾丸间质注射是注射过程中影响了曲细精管完整性,侵染质粒通过缺口进入生精细胞,或者是通过睾丸组织体内的体液循环和渗透作用进入生精细胞完成侵染。Bichun 等16将 pEGFP-N1 质粒注入鸡睾丸,从 30 个受精卵中随机筛选出 23 只雏鸡,成功地得到 13 只转基因鸡(检出率 56.5%)。He 等人17成功获得了转基因羊应用睾丸注射转基因技术(阳性率 2.0%)。在本研究中发现,睾丸间质注射法对睾丸组织产生了一定影响,引起睾丸肿胀,严重会引起睾丸组织出血等状况,需要精密的技术支持。在本研究中,注射干扰载体对驴睾丸组织产生可恢复性损伤,在注射干扰载体 8 个月后,对种公驴进行精液品质检测,结果发现,精液活力降低、睾丸肿胀及精液中带血等问题皆已恢复,精子活力及身体状况恢复正常水平。4 结论研究结果表明,成功构建出驴 Zfy 基因重组载体 CV250-1、CV250-2,CV250-1 能更好的抑制种公驴睾丸组织 Zfy 基因的表达,细胞水平干扰效率为 76.37%,体内试验子一代雌性率为 71.05%,可显著影响子代雌性率。参考文献(References)1 王旭.我国驴产业蕴含巨大潜力J.中国畜牧业,2022,603(12):18-24.WANG X.Chinas donkey industry contains huge poten-tialJ.China Animal Husbandry,2022,603(12):18-24.2 YOHEI M,TOMOKO K,KENICHI K,et al.TALEN-mediated gene disruption on Y chromosome reveals criti-cal role of EIF2S3Y in mouse spermatogenesisJ.Stem Cells and Development,2015,24(10):1164-1170.3 LIU W,LI N,ZHANG M,et al.Eif2s3y regulates the proliferation of spermatogonial stem cells via Wnt6/-catenin signaling pathwayJ.Bba-Molecular Cell Re-search,2020,1867(10):118790.4 YAMAUCHI Y,RIEL J M,RUTHIG V,et al.Mouse Y-encoded transcription factor Zfy2 is essential for sperm formation and function in assisted fertilizationJ.Plos Genetics,2015,11(12):e1005476.5 NI W,PEREZ A A,SCHREINER S,et al.Character-ization of the ZFX family of transcription factors that bind downstream of the start site of CpG island promotersJ.Nucleic Acids Research,2020,48(11):5986-6000.6 VERNET N,MAHADEVAIAH S K,YAMAUCHI Y,et al.Mouse Y-linked Zfy1 and Zfy2 are expressed during the male-specific interphase between meiosis I and meio-sis II and promote the 2nd meiotic division.J.Plos Genetics,2014,10(6):e1004444.7 李超程.马鹿 Zfy 基因干扰载体筛选及性控效果的研究D.石河子:石河子大学,2017.8 MARDON G,PAGE D C.The sex-determining region of the mouse Y chromosome encodes a protein with a highly acidic domain and 13 zinc fingers.J.Cell,1989,56(5):765-770.9 YAMAUCHI Y,RIEL J M,STOYTCHEVA Z,et al.Two Y genes can replace the entire Y chromosome for assisted reproduction in the mouseJ.Science,2014,343(6166):69-72.10YASUHIRO Y,TAKAFUMI M,JACKSON B,et al.Loss of mouse Y chromosome gene Zfy1 and Zfy2 leads to spermatogenesis impairment,sperm defects,and in-fertilityJ.Biology of Reproduction,2022,106(6):1312-1326.11汪存利,姜宏,孙静波.曲细精管片段培养法和混合440 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷细胞共培养法对小鼠生精细胞的增殖分化效应J.东南国防医药,2014,16(6):569-571,596.WANG C L,JIANG H,SUN J B.Effect of segmental-tube culture and mixed cell Co-culture on the prolifera-tion and differentiation of mouse spermatogenic cellsJ.Southeast National Defense Medicine,2014,16(6):569-571,596.12WALL R.New gene transfer methodsJ.Theriogenol-ogy,2002,57(1):189-201.13赵永聚.精子因素对精子载体法制备转基因山羊影响的研究D.重庆:第三军医大学,2005.14AMARAL M 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