牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精技术研究进展.pdf

遗传育种与繁殖972023.80 引言牦牛生活在青藏高原及其邻近的地区，是世界上唯一能在平均海拔3 km高海拔地区生存的牛种1。由于能显著地适应恶劣的高原环境，并为当地牧民提供丰富的生产和生活材料，使其在高原地区具有不可替代的社会、生态和经济作用2-4。与平原地区的普通牛相比，牦牛的性成熟较晚，发情率和繁殖力较低5-6。与体内胚胎相比，体外成熟后的牦牛卵母细胞在体外受精后卵裂率和囊胚率较低，这一缺陷限制现代育种技术在牦牛中的推广和应用7-8。牦牛卵母细胞是重要的生殖细胞，其成熟过程涉及许多基因转录的调控。在发育过程中积累的母体mRNA及其编码蛋白可以支持卵母细胞发育为受精卵，参与受精卵基因组的激活，并促进早期胚胎发育。本文围绕牦牛卵母细胞来源、采集、体外成熟、体外受收稿日期：2023-05-21基金项目：国家自然科学基金（32272852）；财政部和农业农村部现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项（CARS-37）；中国农业科学院科技创新工程牦牛资源与育种（25-LZIHPS-01）作者简介：张犇（1997-），男，陕西宝鸡人，硕士，研究方向：动物繁殖原理与技术。*通信作者简介：郭宪（1978-），男，甘肃庆阳人，研究员，博士生导师，研究方向：动物遗传育种、动物繁育原理与技术。张犇，郭宪牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精技术研究进展J现代畜牧科技，2023，99（8）：97-101doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.026ZHANG Ben，GUO XianAdvances in In Vitro Maturation and In Vitro Fertilization of Yak OocytesJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，99（8）：97-101牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精技术研究进展张犇，郭宪*（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室，甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，甘肃 兰州 730050）摘要：随着生物技术和胚胎工程的不断发展，在牦牛体外受精、胚胎生物技术等方面不断探索，为牦牛资源的育种、保护、基因改良提供有利条件。牦牛卵母细胞是这些技术最重要、最基础的资源和载体，其体外成熟和体外受精效果是体外胚胎生产的基础环节和关键。该文综述近年牦牛卵母细胞来源、体外培养、精子体外获能、体外受精及早期胚胎培养环节的研究进展，并对影响不同环节的主要因素进行概括，对牦牛卵母细胞体外成熟与体外受精在胚胎体外生产中的应用提出展望。关键词：牦牛；卵母细胞；体外成熟；体外受精中图分类号：S823.3文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.08.026Advances in In Vitro Maturation and In Vitro Fertilization of Yak OocytesZHANG Ben，GUO Xian*（Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Qinghai Tibet Plateau Livestock and Poultry Genetics and Breeding，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Key Laboratory of Gansu Yak Breeding Project，Lanzhou Gansu 730050，China）Abstract：With the development of biotechnology and embryo engineering，in vitro fertilization and embryo biotechnology of yak have been explored，providing favorable conditions for breeding，protection and gene improvement of yak resourcesYak oocyte is the most important and basic resource and carrier of these technologies，and its effect in vitro maturation and in vitro fertilization are the basic link and key of in vitro embryo productionIn this paper，the research progress of yak oocyte source，in vitro culture，in vitro capacitation of sperm，in vitro fertilization and early embryo culture in recent years was reviewed，and the main factors affecting different processes were summarized，and the application of in vitro maturation and in vitro fertilization of yak oocyte in vitro embryo production was put forwardKeywords：yak，oocyte，in vitro maturation，in vitro fertilization遗传育种与繁殖98 2023.8精及早期胚胎培养等操作技术进行总结，以期为现代繁殖技术在牦牛繁育中的应用和推广提供理论参考。1 牦牛卵母细胞体外成熟牦牛卵母细胞体外成熟指从母牦牛卵巢内采集未成熟的卵丘卵母细胞复合体（COCs），再经由抽吸法或切割法收集发育潜力强的卵母细胞，在体外条件下培育成具有支持受精和胚胎初始发育能力的成熟卵母细胞的过程。卵母细胞体外成熟是在生殖激素、卵泡微环境、旁分泌和自分泌等一系列复杂和精准调控下的结果，其成熟包括减数分裂的恢复和母体mRNA的合成、胚胎基因组激活及细胞器的有序排列9。1.1 牦牛卵母细胞的来源1.1.1 屠宰场获得卵母细胞屠宰母牦牛后，立即将卵巢置于3039 灭菌生理盐水中，并迅速送往实验室，以保持卵母细胞生物学活性。抽吸法和切割法是获取牦牛卵母细胞的主要方法，2种方法收集的卵泡液经过初步处理后，在体视显微镜下捡取牦牛COCs。研究表明，切割法可以更好地保存COCs的结构，而抽吸法可能会因过度机械压迫而导致卵丘层的完整性丧失10。郭宪等11先用抽吸法后用切割法采集白牦牛卵母细胞以研究采集方法对卵母细胞体外成熟的影响，结果发现，先抽吸卵泡，平均得到可用卵母细胞4.7枚/卵巢，再用切割法，得到可用卵母细胞数9.8枚/卵巢，此法可显著提高可用卵母细胞数。1.1.2 活体采卵活体采卵（OPU）是一种快速、微创的技术，可反复从母牦牛卵巢内获取卵母细胞。无论卵泡生长阶段如何，都会吸出所有可见来自28 mm优势卵泡和从属卵泡的卵母细胞。通常在所有体外成熟和体外受精卵母细胞中，只有20%40%的卵母细胞发育成可移植胚胎，多数培养的卵母细胞在体外胚胎生产中的某个时刻停止发育12，出现此现象的可能原因是在OPU时，卵巢上的卵泡处于不同的生长阶段。因此为确保获得均匀的卵泡库并改善卵母细胞质量，控制母牦牛卵巢上卵泡以同步卵泡波出现，在OPU前用外源促卵泡素（FSH）刺激卵巢，以获得最大的均匀卵泡库。在牛中，OPU前使用FSH仍有争议，一些研究表明，移植后回收的卵母细胞总数、活卵母细胞数量、产生的胚胎数量和妊娠率都有所增加13，但其他研究则认为FSH刺激会降低卵裂、囊胚和孵化率14。1.2 牦牛卵母细胞的选择 已证实体外成熟（IVM）的卵母细胞发育潜力低于体内成熟15，而众多体内外因素造成卵母细胞体内外发育潜力差异，如卵泡的大小、营养状况和体外培养条件等。如果在IVM培养之前正确地估计其发育能力，可以只选择那些能够发育成囊胚的卵母细胞或者为具有不同形态的卵母细胞开发合适的培养系统16。孙永刚等17根据牦牛卵母细胞周围卵丘细胞变化将卵母细胞分为A、B、C 3级分别进行体外成熟培养，结果发现，A级卵母细胞受精后囊胚发育率显著高于B级和C级。但有学者认为凭借卵丘细胞形态变化来评价卵母细胞发育程度的方法存在主观性。有学者通过亮甲酚蓝染色选择更有能力的卵母细胞，与完全发育的卵母细胞相比，发育中的卵母细胞体内产生更高水平的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，通过亮甲酚蓝染色选择的卵母细胞可产生更多的囊胚，质量更好18。但由于染色程序不同，在将亮甲酚蓝染色视为评估卵母细胞发育能力的鉴别方法之前，需要对该技术进行充分验证。1.3 体外成熟培养系统目前，IVM的效率相对较低，主要是由于有腔卵泡中物理去除COCs并进行培养后，卵母细胞自发减数分裂恢复19。在这种过程中，卵母细胞内环磷酸腺苷（cAMP）浓度降低，由于卵泡中抑制因子的耗尽，卵母细胞恢复减数分裂，这通常会导致细胞质和细胞核成熟之间的不同步，降低卵母细胞的发育能力20。研究发现，在IVM前保持相对较高的cAMP浓度可以提高卵母细胞的能力，而卵母细胞cAMP浓度的增加可以通过腺苷酸环化酶（AC）、AC活性刺激物、磷酸二酯酶抑制剂和cAMP类似物等不同途径实现21。根据cAMP在卵母细胞发育过程中的特殊作用，形成以下4种卵母细胞体外成熟培养系统。1.3.1 标准体外成熟标准体外成熟指从有腔卵泡中分离出未成熟的COCs，然后在不含cAMP调节剂的培养基中使其成熟，该方法是根据卵母细胞减数分裂自发成熟的原理而设计的。标准IVM系统通常含有FSH或其他添加剂，如表皮生长因子（EGF）和促黄体素（LH）或人绒毛膜促性腺激素（hCG）。FSH导致COCs中cAMP瞬时升高22。但COCs收集处理缓慢或IVM中省略FSH，则cAMP水平迅速下降，导致自发恢复减数分裂。由于该系统中可使cAMP水解，卵母细胞内cAMP水平降低，导致蛋白激酶A失活并表现为生发泡破裂（GVBD）23。但标准IVM侧重于促进细胞核成熟，它不能实现细胞核和细胞质成熟的同步。1.3.2 双相体外成熟通过模拟卵母细胞体内发育的微环境，建立一种双相系统。IVM前期，抑制卵母细胞自发减数分裂恢复，维持卵母细胞卵丘细胞间隙连接通讯，并促进卵母细胞获得发育能力；IVM期，诱导卵母细胞减数分裂恢复和成熟。双相IVM前期使用相对高浓度的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、C型利钠肽（CNP）、西洛他胺（Cilostamide）、米力农（Milrinone）等磷酸二酯酶遗传育种与繁殖992023.8（PDE）抑制剂24。而在以上众多PDE抑制剂中，需要特别强调卵母细胞天然成熟抑制剂CNP的作用，CNP由卵泡壁颗粒细胞分泌，其结合卵丘细胞表面的利钠肽受体2（NPR2），并诱导环磷酸鸟苷（cGMP）的表达，cGMP通过细胞间隙连接进入卵母细胞，并通过抑制磷酸二酯酶的激活来维持cAMP的浓度。通过这种方式，CNP在卵泡中维持卵母细胞减数分裂阻滞25。在CNP存在下，双相IVM可提高卵母细胞的发育能力，这已在小鼠、山羊、猪和牛的研究中得到证实26。在CNP介导的双相IVM中，细胞核和细胞质同步成熟。因此来自CNP介导的双相IVM的成熟卵母细胞将比标准IVM具有更好的发育能力。1.3.3 中浓度cAMP诱导体外成熟在生发泡（GV）期阻滞的卵母细胞中，使用FSH、EGF等外源减数分裂刺激物可以容易诱导减数分裂。卵母细胞成熟是“诱导”的，因为在缺乏此类减数分裂刺激物的情况下，减数分裂成熟受到抑制。这些刺激物的作用由卵丘细胞介导，因为其在体外完整的移植卵泡或COCs中诱导GVBD，但在体外的机械裸卵中则不诱导GVBD27。因此，诱导IVM系统通常包括同时应用减数分裂抑制剂和减数分裂诱导物质。GVBD而后进入M中期，此过程发生在COCs内中浓度cAMP水平及减数分裂抑制剂的存在下。1.3.4 高浓度cAMP诱导体外成熟该培养系统的显著特点是增加COCs内cAMP水平或诱导COCs中大量cAMP的合成。Funahashi H27等用cAMP类似物二丁酰环腺苷酸（dbcAMP）处理猪COCs，提高随后的囊胚产量。事实证明，dbcAMP的使用非常成功，目前已广泛用于猪IVM胚胎生产系统28。用于该方法的其他cAMP提升剂包括AC和毛喉素（forskolin）。尤其是forskolin，其导致整个COCs和卵母细胞内cAMP快速大幅增加，达到接近体内响应LH时的COCs中cAMP峰值的水平。1.4 体外成熟标志卵母细胞体外成熟是伴随核成熟及细胞质、卵丘细胞、透明带、蛋白质和转录物变化的复杂生物学过程，在形态上体现为生发泡破裂，染色体凝集，纺锤体形成，极体排出，透明带软化，细胞器重组等显微结构变化9。牦牛COCs体外培养成熟后，第一极体的排出标志着卵母细胞达到成熟，而牦牛卵母细胞胞质较暗，因而要准确判断卵母细胞成熟率，须进行染色观察，如果只发现极体排出和M期染色体团，才可确定卵母细胞达到体外成熟29。2 牦牛卵母细胞体外受精牦牛卵母细胞体外受精指经体外培养成熟的卵母细胞在体外条件下，与获能精子共培养，完成受精的过程。精子制备、获能、受精通常在BO液或TALP溶液中进行。卵母细胞体外受精是形成早期胚胎的关键步骤。2.1 精子分选用于精子分选的精液来源可以是鲜精或冻精，也可以是性控精液30。精子分选的主要目的是去除精液中精浆和死精子及冻精中乙二醇、二甲基亚砜等冷冻介质并选择更具活力的精子，便于在随后的顶体反应中顺利穿过放射冠与透明带与卵子结合9。目前牦牛精子分选中主要采用浮游法和Percoll密度梯度离心法。Liu B等31研究发现，浮游法和percoll梯度离心法可有效从冷冻解冻的牦牛精液中回收活精子，浮游法分离的精子具有较高的活力、较高的质膜和顶体完整性，其分裂率较高。但以上2种传统精子分离方法依赖于离心，离心会导致氧化应激，损害精子细胞。随着科技的发展，相继出现微流体分离法、磁活化细胞分选法等新兴精子分选技术，但以上技术在牦牛中鲜有报道。2.1.1 浮游法该法依据精子运动上游的特性，将高活力精子与死精、弱精和其他精浆成分分开。该法与percoll密度梯度离心法相比，操作简单、可分离得到较高活力及完整质膜和顶体的精子，受精后卵裂率更高，而且在分离过程中可减少活性氧（ROS）产生，得到的染色体缺陷精子比例降低；但是该方法回收精子数量减少，精子利用率低，当样本中活动精子的百分比较低时，可使用该方法31。2.1.2 Percoll密度梯度离心法该法依据形态正常的精子密度高于异常精子密度特点，离心后将受精力强的正常精子聚集在高密度percoll区域。此法操作复杂，ROS产生量高，精子体外受精效果受percoll质量的影响，但可分离出大量运动和形态正常的精子细胞。另外精子表面去能因子的丢失对受精的成功至关重要。Hopper R M等32研究表明，浮游法不能去除活性氧和去能因子。相比之下，密度梯度离心技术已被广泛用于将活动精子与不活动精子和其他细胞分离，并消除去能因子、前列腺素和ROS。有学者对比浮游法与percoll密度梯度离心法对牦牛精子质量和体外胚胎发育的影响，研究发现，2种处理方法后的精子染色质完整的百分比和囊胚中的细胞数量没有差异31。2.2 精子获能雄性牦牛睾丸中刚刚生成的精子是没有受精能力的，必须在母牦牛子宫或输卵管内停留一段时间发生超活化运动、质膜稳定性改变、Ca2+进入细胞和细胞内cAMP浓度的增加等形态上和生理上的一系列变化才能获得穿透卵子的能力。精子获能的实质是去除精子头部的去能因子或使去能因子失活的过程，但凡能导致精子表面膜蛋白消除、质膜稳定性降低与通透性增加及Ca2+进入胞内的方法，均能导致精子获能。遗传育种与繁殖100 2023.82.2.1 氨基多糖处理法氨基多糖处理法是目前应用最普遍的精子获能方法。添加到获能培养基中的主要获能剂是肝素，肝素结合牛精浆蛋白会使精子质膜发生变化，导致牛精浆蛋白、胆固醇和磷脂的损失，还会增加pH值和细胞内Ca2+，最终导致精子蛋白酪氨酸磷酸化，这是精子获能的标志之一33。2.2.2 Ca2+载体法Ca2+载体A23187可直接诱导Ca2+进入精子，提高精子内Ca2+水平，激活顶体酶，诱发精子获能。因此Ca2+载体A23187普遍用于精子体外获能。2.3 受精成熟卵母细胞与获能精子体外受精的方法主要有微滴法和四孔板法2类。除以上2大受精方法外，也相继出现胞质内精子注射法、透明带打孔法等辅助受精技术。3 早期胚胎培养精卵结合形成早期胚胎后，需在体外条件下成熟培养至桑葚期或囊胚期进行胚胎移植。研究表明胚胎培养虽有所改善，但最多只有30%35%的未成熟牛COCs发育到囊胚阶段，体内情况仍然无法充分模拟15。经过胚胎生物技术的发展和对母牛输卵管生理环境的充分了解，相继形成常规培养系统、序贯培养系统、细胞共培养系统及微流体芯片培养系统。这些新兴培养系统的更替也是为最大程度模仿早期胚胎体内发育环境，期望生产出理想体外胚胎。3.1 常规培养系统单独将早期胚胎放置培养液中培养的方法称为常规培养。该方法分为微滴法与四孔板培养法。微滴法适合胚胎较少的培养，四孔板培养适合胚胎较多的培养。常规培养因其具有操作简单效率高等优点已经成为牦牛体外早期胚胎培养的主要方法。3.2 序贯培养系统体外胚胎是处于基本静止的条件下，在培养皿中培养的。在大多数时间里，体内植入前胚胎都会经历动态的微环境，而根据早期胚胎发育代谢和雌性生殖道中各种物质的特点而设计的一种动态培养称为序贯培养系统34。但因序贯培养操作复杂，限制其广泛应用。3.3 细胞共培养系统为克服牦牛早期胚胎在8-16细胞阶段的发育阻滞，产生将早期胚胎与单层体细胞的共培养系统。用于牛胚胎成功共培养的细胞类型包括来自输卵管（牛或猪）、小鼠输卵管壶腹、卵丘、颗粒和子宫的原代细胞32。3.4 微流体芯片培养系统体外胚胎生产中的每一步都可以在微流体芯片上进行，包括精子选择、体外成熟、体外受精和许多其他方面。有学者将微流体和体内输卵管相结合建立起输卵管微流体培养模型来优化胚胎的培养条件，提高辅助生殖的临床效果，其研究发现，这种新型输卵管模型可降低细胞内ROS水平，这可能作为现有稳定胚胎培养系统的一种有效替代方案35。此外，微流体系统还可以提高胚胎受精和胚泡形成率。但此项技术发展不是很成熟，其对辅助生殖的影响仍未明确。相信随着科学技术的发展，各种影响体外胚胎生产的因素将得到优化，未来利用微流体芯片进行胚胎培养的质量将会提高。4 存在问题与展望随着生物技术的发展和组学技术的应用，牦牛体外胚胎生产技术已经逐渐运用到生产实践中，但也存在如卵母细胞体外成熟率受精率低于体内、卵母细胞多精受精、早期胚胎在8-16细胞阶段的阻滞、卵母细胞成熟调控机制仍未清楚阐明等问题。随着基因组时代的到来，体外胚胎生产领域也受到转录组学和表观遗传学工具的影响，这些新兴技术必将推动牦牛胚胎体外生产体系的建立，有助于牦牛特色资源的保种和利用。参考文献1Qiu Q，Zhang G J，Ma T，et alThe yak genome and adaptation to life at high altitudeJNature Genetics，2012，44（8）：946-9492Miao F，Guo Z，Xue R，et alEffects of Grazing and Precipitation on Herbage Biomass，Herbage Nutritive Value，and Yak Performance in an Alpine Meadow on the Qinghai-Tibetan PlateauJPloS One，2015，10（6）：e0 127 2753Fu M，Chen Y B，Xiong X R，et alEstablishment of mammary gland model in vitro：culture and evaluation of a yak mammary epithelial cell lineJPloS One，2014，9（12）：e113 6694Rivero U M，Santamara O A，Rodrguez-Palmero S MThe importance of functional ingredients in pediatric milk formulas and cerealsJNutricion Hospitalaria，2005，20（2）：135-1465Lan D L，Xiong X R，Wei Y L，et alRNA-Seq analysis of yak ovary：improving yak gene structure information and mining reproduction-related genesJScience 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