猕猴桃DCL、RDR和AGO基因家族的鉴定与分析.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(9):1 3 9 4-1 4 0 3A c t a A g r i c u l t u r a e B o r e a l i-o c c i d e n t a l i s S i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 0 8h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 0 8猕猴桃D C L、R D R和A G O基因家族的鉴定与分析收稿日期:2 0 2 2-0 3-1 3 修回日期:2 0 2 2-0 9-1 8基金项目:贵州大学培育项目(贵大培育2 0 1 95 2号);贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑2 0 2 01 Y 1 3 1号);贵州省省级科技计划项目(黔科合基础-2 K2 0 2 2 一般0 7 1);贵州大学人才引进科研项目(贵大人基合字2 0 1 75 0号)。第一作者:方远鹏,男,硕士研究生,研究方向为植物抗病亚基因组演化与基因挖掘。E-m a i l:f y p 1 2 9 0 9 4 1 6 5 5y e a h.n e t通信作者:李云洲,男,副教授,硕士生导师,研究方向为植物抗病抗逆。E-m a i l:l i y u n z h o u 2 0 0 71 2 6.c o m方远鹏1,李云洲1,赵志博1,2,樊 荣1,2,龙友华1,2(1.贵州大学 农学院,贵阳 5 5 0 0 2 5;2.贵州大学 猕猴桃工程中心,贵阳 5 5 0 0 2 5)摘 要 为研究猕猴桃R NA i抗病毒机制相关基因D C L、R D R和A G O。本研究采用b l a s t p比对法和N P S、S i g n a l P-5.0及TMHMM 2.0等数据库对猕猴桃R NA i相关蛋白家族进行鉴定及其对应基础性质(如:亚细胞定位、二级结构等)的分析。结果在猕猴桃中共鉴定获得4个D C L、6个R D R和1 8个A G O基因,其中1 9个基因分布在1 3条染色体(即第3、6、9、1 2、1 3、1 6、1 7、1 8、1 9、2 3、2 6、2 7、2 9号染色体)上,另外9个基因未定位到染色体具体位置。A c A GO 1 d、A c AG O 2 a、A c AG O 2 b、A c A G O 2 d基因在1 9号染色体成簇存在。R D R基因和 AG O 2/7基因包含的内含子较少,其他的A G O和D C L基因包含的内含子较为丰富。这些猕猴桃基因均与番茄更近缘,它们编码的蛋白质含有不同比例的二级结构类型,无规则卷曲占5 0%左右,其次是-螺旋和-折叠。本研究完善了猕猴桃D C L、R D R和A G O编码基因的鉴定,后分析其对应的基础性质,以期为猕猴桃抗病毒研究奠定基础。关键词 R NA干扰(R NA i);A r g o n a u t e(A GO);D i c e r类蛋白(D C L);R NA依赖型R NA聚合酶(R D R);病毒;猕猴桃 中国是猕猴桃(A c t i n i d i a L i n d l.)的主产区及原产地,猕猴桃种质资源丰富,但其产量严重受各种生物病害与非生物病害影响1-2。自2 0 0 3年首例猕猴桃病毒病报道后,迄今共鉴定出3组(即特异性及非特异性猕猴桃病毒、致病性病毒)1 5种猕猴桃病毒及多种可能的猕猴桃病毒3-5。共计2 3 种猕猴桃病毒,根据其症状分为4类:第1类为导致叶片黄萎病、花叶病、环斑病和斑点症状的病毒。第2类病毒导致叶片乃至整株变黄和环斑。第3类仅导致轻微症状或没有症状的病毒。第4类病毒导致叶片坏死和环斑。另外,猕猴桃黄化病 毒 1(A c YV 1)和 猕 猴 桃 黄 化 病 毒 2(A c YV 2)侵染猕猴桃导致症状尚不明确6。其中,猕猴桃的多种病毒带毒率逐渐上升;例如,中国陕西省猕猴桃中柑橘叶斑驳病毒(C i t r u s l e a f m o t t l e v i r u s)、猕猴桃病毒A(A c t i n i d i a v i r u s A)和猕猴桃病毒B(A c t i n i d i a v i r u s B)均有广泛地分布和较高的带毒率,并且存在较大的分子变异7-8。同时,由于樱桃卷叶病毒(C h e r r y l e a f r o l l v i r u s)、天竺葵带状斑点病毒(P e l a r g o n i u m z o n-a t e s p o t v i r u s)等具备侵染范围大及交叉感染可能性高等原因。特别是近年来随着病毒病,如柑橘叶斑驳病毒在猕猴桃上不断的发现,防治猕猴桃病毒病成为保障猕猴桃安全生产的重要任务,但是因病毒危害症状与生理病害类似,且大多数病毒通过昆虫传毒7,预防与控制难度大,因此,从猕猴桃自身免疫方面提高植株对病毒的抗性显得尤为重要9。R NA干扰(R NA i n t e r f e r e n c e,R NA i)是植物抗病毒的重要机制1 0。参与R NA i机制的蛋白主要包含3类:D C L蛋白(D i c e r-l i k e,D C L)、R NA依赖型R NA聚合酶(R NA-d e p e n d-e n t R NA P o l y m e r a s e,R D R)和 AGO(A r g o-n a u t e,AGO)。首先,D C L负责将病毒衍生的双链R NA(d o u b l e s t r a n d R NA,d s R NA)剪切加工成 初级s i R NA;其后,R D R将 初级s i R NA 重新反转录重新合成d s R NA,新合成的d s R NA再次被D C L剪切加工形成更多的 次级s i R NA;最后,AGO与s i R NA形 成R NA沉 默 复 合 体(R I G C),R I S C通过碱基互补配对的方式剪切降解与s i R NA匹配的病毒序列 1 0-1 1。拟 南 芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)D C L 2与D C L 4都可以作为病毒s i R NA形成的关键因子,参与植物抗病毒防御1 2。拟南芥D C L 3、AGO 1和AGO 7、R D R 6也具备调控R NA i清除病毒的重要作用1 3。AGO、R D R、D C L蛋白促进甲基化的发生从而提升对多种R NA和D NA病毒(如黄瓜花叶病毒、萝卜皱缩病毒(T u r n i p c r i n c k l e v i-r u s,T C V)的抗病毒防御1 2-1 6。拟南芥AGO 2异常 会 导 致 马 铃 薯X病 毒(P o t a t o v i r u s X,P V X)易感表型的出现1 4。AGO 2和 AGO 3介导脱落 酸(A B A)诱 导 产 生 竹 花 叶 病 毒(B a m b o o m o s a i c v i r u s,B a MV)的抗病毒防御能力增强1 5。水稻(O r y z a s a t i v a)R D R 6可以对水稻条斑病毒(R i c e s t r e a k v i r u s,R S V)感染过程产生应答反应,从而抑制R S V的危害1 6。马铃薯纺锤纤块茎类病毒(P o t a t o s p i n d l e t u b e r v i r o i d,T S T V)可受寄主D C L 2和D C L 3的协同作用,以减轻病情1 7。番 茄(S o l a n u m l y c o p e r s i c u m)R D R 2、R D R 3 a、R D R 3 b、R D R 6、D C L 2(2 a、2 c、2 d)、D C L 3、AGO 1 a、AGO 4 b的表达均受番茄黄化曲叶病毒(T o m a t o y e l l o w l e a f c u r l v i r u s,T Y L-C V)的 诱 导1 8。辣 椒(C a p s i c u m a n n u u m)AGO 2、AGO 1 0 b、D C L 2和 D C L 4受黄瓜花叶病毒(C u c u m b e r m o s a i c v i r u s,CMV)、马铃薯病毒Y(P o t a t o v i r u s Y,P VY)和烟草花叶病毒(T o-b a c c o m o s a i c v i r u s,TMV)诱导表达上调1 9。准确鉴定猕猴桃基因组中R NA i相关蛋白家族成员是研究和利用猕猴桃抗病毒相关基因的重要前提,正确判断不同植物基因家族的变迁过程,将有助于深入理解和设计猕猴桃抗病毒育种。猕猴桃基因组国际合作组织最早在2 0 1 3年完成猕猴桃(A c t i n i d i a c h i n e n s i s)基因组的全基因组测序2 0。本研究通过对红阳猕猴桃(A.c h i n e n s i s)R NA i途径主要蛋白家族进行鉴定并分析其基本特性,旨在为猕猴桃抗病毒研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 R N A i相关蛋白家族基因的鉴定拟南芥和番茄序列信息取至拟南芥数据库(h t t p s:/www.a r a b i d o p s i s.o r g)和茄科数据库(h t t p s:/s o l g e n o m i c s.n e t/p r o j e c t s/v a r i t o m e/)。采用拟南芥和番茄的所有D C L、R D R、AGO蛋白序列对猕猴桃基因组数据库2 0进行b l a s t p检索,并 经S MA R T(h t t p:/s m a r t.e m b l-h e i d e l b e r g.d e/)2 1网站进行结构域的确认,手工合并去重。1.2 保守性及染色体定位分析基因结构图、保守基序和染色体定位图使用G S D S 2.0(h t t p:/g s d s.c b i.p k u.e d u.c n/)、MEME(R D R和AGO蛋白一起进行基序的搜索,参数设置为基序数量3 0,显著性限制为0.0 5;D C L蛋白单独进行基序的搜索,参数设置为基序数量5,显著性限制为0.0 5)和T B t o o l s2 2软件 1.0版本进行预测或绘制。1.3 基因基础信息的预测使用E X P A S y的P r o t-P a r a m t o o l在线程序(h t t p:/w e b.e x p a s y.o r g/c g i-b i n/p r o t p a r a m/p r o t p a r a m)2 3预测蛋白等电点和分子质量;蛋白亚细胞 定位利用S o f t b e r r y(h t t p:/www.s o f t-b e r r y.c o m/)预 测。采 用S i g n a l P-5.0(h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/S i g n a l P/)及TM-HMM 2.0网站(h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v-i c e s/TMHMM/)进行信号肽和跨膜结构的检查。蛋白的二级使用N P S(h t t p s:/n p s a-p r a b i.i b-c p.f r/c g i-b i n/)。1.4 系统进化树构建采用ME GA 7.0分别对猕猴桃D C L、R D R、AGO蛋白家族和猕猴桃、拟南芥、番茄AGO、D C L、R D R蛋白序列分别进行建树分析。对齐算法采用C l u s t a l W方法,建树时采用b o o t s t r a p=1 0 0 0,建树方法采用N e i g h b o r-J o i n i n g法。2 结果与分析2.1 基因家族的鉴定明确基因家族的成员的分布特点有助于对其演化、功能进行初步推测。为此,笔者观察到,这些猕猴桃R NA i相关蛋白编码基因的分布情况呈现出以下特征。在第6、1 3和1 8号染色体上各分布有1个D C L基因;在第1 3、2 6和2 7号染色体上各分布有1个R D R基因;A G O基因在第3、9、1 2、1 3、1 6、1 7、2 9号染色体上各分布有1个,在第2 3号染色体上分布有2个,在第1 9号染色体上分布有4个。部分基因未定位在染色体上,包括 A c A G O 1 e、A c A G O 4 a、A c A G O 4 d、A c R D R 1 c、A c AGO 2 c、A c AGO 5 a、A c D C L 1 a、A c R D R 1 a、A c R D R 6 a。其 中 A c AGO 1 d、A c AGO 2 a、A c AGO 2 b、A c AGO 2 d基因在较短区域内成簇存在。59319期方远鹏等:猕猴桃D C L、R D R和A G O基因家族的鉴定与分析此外,大部分的基因定位区域均为基因密度较高的区域内,只有少部分处于低基因密度的区域,例 如 A c AGO 7、A c AGO 1 d、A c AGO 2 a、A c AGO 2 b、A c AGO 2 d等基因。同时笔者检查这些猕猴桃R NA i相关蛋白的氨基酸长度均大于5 5 0 a a,最短和最长的蛋白分子为A c AGO 6和A c D C L 4的5 7 5 a a和2 3 0 8 a a(表1、图1-A)。表1 猕猴桃D C L、A G O 和R D R基因的鉴定T a b l e 1 I d e n t i f i c a t i o n o f D C L,A G O a n d R D R g e n e s i n k i w i f r u i t基因名称G e n e n a m e登陆号A c c e s s i o n n u m b e r染色体编号C h r n u m b e r染色体位置C h r l o c a t i o n编码区/b pC D S蛋白质/a aP r o t e i n A c A GO 1 aA c h n 1 6 6 9 4 12 36 2 2 5 7 5 66 2 4 3 4 3 14 2 2 71 4 0 8 A c A GO 1 bA c h n 0 3 0 4 4 131 7 4 5 9 3 5 31 7 4 7 9 1 4 22 9 0 19 6 6 A c A GO 1 cA c h n 0 3 5 7 8 11 63 1 2 6 9 6 63 1 3 9 3 7 93 2 4 31 0 8 0 A c A GO 1 dA c h n 2 0 9 7 5 11 95 7 4 0 8 7 65 7 4 8 9 5 12 9 9 49 9 7 A c A GO 1 eA c h n 3 4 5 9 6 1U n k n o w9 4 2 0 0 1 1 99 4 2 1 2 1 0 82 9 6 79 8 8 A c A GO 2 aA c h n 2 0 9 7 9 11 95 6 5 0 7 1 15 6 6 0 6 9 72 7 8 49 2 7 A c A GO 2 bA c h n 2 1 0 3 9 11 95 6 6 8 6 9 85 6 7 2 9 7 02 6 5 88 8 5 A c A GO 2 cA c h n 3 2 6 8 1 1U n k n o w7 5 5 5 7 3 2 87 5 5 7 0 6 1 12 7 8 19 2 6 A c A GO 2 dA c h n 2 1 0 4 1 11 95 6 8 0 3 2 65 6 8 6 8 3 32 9 3 19 7 6 A c A GO 2 eA c h n 3 5 6 2 1 12 96 7 5 6 1 5 46 7 6 0 6 9 92 8 1 79 3 8 A c A GO 4 aA c h n 2 6 4 2 9 1U n k n o w6 7 2 5 8 1 4 66 7 2 6 4 4 0 42 7 3 99 1 2 A c A GO 4 bA c h n 2 1 5 7 7 198 5 2 1 5 9 48 5 5 0 4 1 45 3 5 21 7 8 3 A c A GO 4 cA c h n 3 4 7 3 3 12 31 3 5 8 5 3 0 91 3 6 0 3 1 3 32 9 7 99 9 2 A c A GO 4 dA c h n 2 8 9 7 6 1U n k n o w6 0 2 2 1 3 6 16 0 2 3 5 7 6 53 4 5 01 1 4 9 A c A GO 5 aA c h n 1 2 9 0 5 1U n k n o w3 9 2 8 1 6 8 03 9 2 9 1 5 3 62 6 8 58 9 4 A c A GO 5 bA c h n 1 2 6 7 7 11 21 0 4 2 0 9 6 61 0 4 3 3 5 0 12 7 1 29 0 3 A c A GO 6A c h n 2 2 7 8 1 11 79 7 9 4 4 2 19 7 9 8 1 0 31 7 2 85 7 5 A c A GO 7A c h n 1 4 3 6 5 11 31 6 2 0 9 2 4 91 6 2 1 3 0 2 72 8 3 29 4 3 A c D C L 1 aA c h n 3 6 9 6 1 1U n k n o w1 0 2 2 5 8 8 7 51 0 2 2 6 7 9 8 83 9 1 51 3 0 4 A c D C L 2 aA c h n 0 0 3 2 6 11 82 0 9 1 3 3 42 0 9 8 0 9 32 3 0 17 6 6 A c D C L 3A c h n 2 7 6 3 7 161 1 9 2 3 9 0 51 1 9 4 2 8 1 23 5 8 51 1 9 4 A c D C L 4A c h n 3 5 8 8 8 11 31 0 8 9 3 7 5 91 0 9 4 0 7 7 66 9 2 72 3 0 8 A c R D R 1 aA c h n 3 4 0 0 1 1U n k n o w8 8 1 8 7 4 3 88 8 1 9 5 9 8 53 0 8 41 0 2 7 A c R D R 1 bA c h n 2 3 0 6 5 12 73 7 4 8 0 4 0-3 7 5 7 8 4 23 0 0 09 9 9 A c R D R 1 cA c h n 1 7 3 4 4 1U n k n o w4 3 7 1 8 5 3 5-4 3 7 2 8 5 0 02 6 1 38 7 0 A c R D R 2 aA c h n 2 0 2 0 1 12 69 0 8 4 5 3 69 0 9 3 4 6 03 3 5 41 1 1 7 A c R D R 6 aA c h n 0 6 5 7 0 1U n k o w2 6 2 5 1 1 8 52 6 2 5 5 5 2 63 5 9 41 1 9 7 A c R D R 6 bA c h n 2 2 9 6 5 11 32 7 5 4 3 92 7 7 4 1 81 9 8 06 5 92.2 基因结构及保守基序分析如 图1-A所 示,本 研 究 鉴 定 的A c D C L、A c R D R和A cA G O基因家族分布于猕猴桃不同的 染 色 体 上,但 是 A c AGO 1 e、A c AGO 2 c、A c AGO 4 a、A c AGO 4 d、A c AGO 5 a,A c D C L 1 a和 A c R D R 1 a、A c R D R 1 c、A c R D R 6 a在染色体上的分布还不清楚。在保守基序方面,A c D C L间的保守性相对较差,但仍具备D C L 3、4、5个保守基序,独特的是,除A c D C L 2 a以外均具备D C L-1基序;除A c D C L 3以外均具备D C L-2基序。而在A c R D R蛋 白 中,均 具 备M o t i f 6、M o t i f 1 7、M o-t i f 1 9、M o t i f 2 6,这些保守基序存在于R d R P结构域中。在A c AGO蛋白中,具备丰富的保守基序,M o t i f 1、M o t i f 3、M o t i f 7、M o t i f 9、M o t i f 1 1、M o-t i f 1 2、M o t i f 1 4、M o t i f 1 7、M o t i f 1 8、M o t i f 1 9、M o-t i f 2 2、M o t i f 2 4为均具备的基序,其次还具备丰富6931西 北 农 业 学 报3 2卷的其他基序(图1-B、1-C)。在基因结构方面,猕猴桃A c R D R基因内含子数小于5,A c D C L基因均内含子数大于5,A c A G O基因大部分为内含子数大于5,而 A c AGO 2/7基因的内含子数小于5(图1-D)。红色、黄色、蓝色分别为A GO、D C L、R D R基因;A.猕猴桃A GO、D C L、R D R基因的染色体定位;B.猕猴桃A GO、D C L、R D R蛋白的进化树;C.猕猴桃A GO、D C L、R D R蛋白基序;D.猕猴桃AGO、D C L、R D R蛋白基因结构R e d,y e l l o w a n d b l u e w e r e AGO,D C L a n d R D R g e n e s,r e s p e c t i v e l y;A.c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o n o f A GO,D C L a n d R D R g e n e s i n k i w i f r u i t;B.p h y l o g e n e t i c t r e e o f AGO,D C L,R D R p r o t e i n s i n k i w i f r u i t;C.m o t i f o f A GO,D C L,R D R p r o t e i n s i n k i w i f r u i t;D.g e n e s t r u c t u r e o f A GO,D C L,R D R p r o t e i n s i n k i w i f r u i t图1 猕猴桃D C L、R D R和A G O蛋白家族的分布及结构F i g.1 D i s t r i b u t i o n a n d s t r u c t u r e o f D C L,A G O a n d R D R p r o t e i n i n A c t i n i d i a c h i n e n s i s2.3 基于蛋白保守结构域的鉴定与进化树的构建D C L蛋 白 家 族 可 以 分 为 明 显 的4类,即D C L 1、D C L 2、D C L 3、D C L 4。其中猕猴桃A c D C L蛋白与番茄D C L(S l D C L)亲缘关系最近,其次是拟南芥D C L(A t D C L);猕猴桃A c D C L与拟南芥A t D C L间均具备唯一的直系同源蛋白,但是通过图2可以确认D C L家族蛋白存在多个保守结构域(图2-A)。R D R蛋 白 家 族 表 现 出 明 显 的4类,即R D R 1、R D R 2、R D R 3/4/5、R D R 6。猕 猴 桃A c R D R、番茄R D R(S l R D R)、拟南芥(A t R D R)间的亲缘关系与其对应的D C L亲缘关系保持一致,首先是番茄S l R D R,其次是拟南芥A t R D R。猕猴桃A c R D R具备3个R D R 1蛋白、1个R D R 2、2个R D R 6蛋白,但是并不具备R D R 3/4/5。R D R家族表现出只有R d R P保守结构域,且该结构域长度可变,但 A c R D R 1 c除基础的R d R P保守域外还具备一段短的R RM_1保守结构(图2-B)。AGO蛋白家族可以分为4类,即AGO 1/1 0、AGO 2/3/7、AGO 4/6/8/9/1 5、AGO 5,但是区别79319期方远鹏等:猕猴桃D C L、R D R和A G O基因家族的鉴定与分析并不明显。亲缘距离表现出番茄S l AGO和猕猴桃A c AGO亲缘关系最近,其次是拟南芥A t A-GO。猕猴桃A c AGO蛋白包括A c AGO 1、A c A-GO 2、A c AGO 4、A c AGO 5、A c AGO 6、A c AGO 7的同源蛋白分别为5、5、4、2、1、1个,而并未发现A c AGO 3、A c AGO 1 0、A c AGO 1 5等的同源蛋白。所有AGO家族蛋白包含有丰富的保守结构域,包括基本保守结构域P i w i和P A Z,还包括A r-g o L 1、A r g o L 2、A r g o M i d、A r g o N和G l y-r i c h_A g o 1等9个保守域(图2-C)。橙色星形、红色三角、蓝色圆圈分别为番茄、拟南芥、猕猴桃基因;S l.番茄,A t.拟南芥,A c.猕猴桃;拟南芥、番茄、猕猴桃D C L(A)、R D R(B)、A GO(C)蛋白的进化树与结构域分布O r a n g e s t a r,r e d t r i a n g l e a n d b l u e c i r c l e a r e g e n e s o f t o m a t o,a r a b i d o p s i s a n d k i w i f r u i t,r e s p e c t i v e l y;S l.S o l a n u m l y c o p e r s i c u m,A t.A r a b i d o p s i s t h a l i a n a,A c.A c t i n i d i a c h i n e n s i s.P h y l o g e n e t i c t r e e a n d d o m a i n o f D C L(A),R D R(B),A GO(C)p r o t e i n s i n k i w i f r u i t,t o-m a t o a n d a r a b i d o p s i s图2 R N A i蛋白的进化树及结构域F i g.2 R N A i p r o t e i n e v o l u t i o n t r e e a n d d o m a i n d i s t r i b u t i o n2.4 D C L、R D R和A G O家族蛋白的理化性质 分析2.4.1 D C L家族蛋白的理化性质分析 D C L家族蛋白亚细胞定位预测均在核内,A c D C L 4是具有信号肽的跨膜蛋白,其他A c D C L蛋白均不具备跨膜结构。其蛋白理化性质体现出酸碱性氨基酸的数量相似,等电点为5.8 87.5 8,脂溶系数较大在8 89 5,除A c D C L 2 a、A c D C L 3外均较稳定,均具亲水性,值为-0.2 50(表2)。2.4.2 R D R家族蛋白的理化性质分析 R D R家族蛋白亚细胞定位均为细胞外(分泌),均不具备跨膜结构。其蛋白理化性质表现为酸碱性氨基酸的数量相似,等电点为5.8 98.6 2,脂溶系数较D C L家族成员小,处于7 89 0,除A c R D R 1 a、A c R D R 1 b外均 较 稳 定,均 具 亲 水 性 较 强 处 于 -0.3 5-0.2 0(表3)。8931西 北 农 业 学 报3 2卷表2 猕猴桃D C L蛋白基础理化性质和跨膜结构T a b l e 2 B a s i c p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f D C L p r o t e i n i n k i w i f r u i t蛋白名称P r o t e i n n a m e分子质量/k u M o l e c u l a r m a s s酸碱氨基酸A c i d-b a s e a m i n o a c i dA s p+G l u A r g+L y s等电点p I不稳定系数I n s t a b i l i t y i n d e x脂肪族(氨基酸)系数A l i p h a t i ci n d e x亲水指数H y d r o p a t h y i n d e x跨膜结构T r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nA c D C L 1 a1 4 4.7 7 7 0 21 6 81 4 95.8 73 6.3 28 8.3 7-0.2 4 6无 N o n核内N u c l e a rA c D C L 2 a8 7.5 2 7 6 09 68 36.2 34 5.0 39 4.7 9-0.2 2 1无 N o n核内N u c l e a rA c D C L 31 3 4.3 3 5 6 71 4 41 3 16.3 14 4.0 29 0.7 1-0.2 0 0无 N o n核内N u c l e a rA c D C L 42 5 6.4 4 8 0 52 5 12 2 86.23 8.1 29 2.8 4-0.0 8 4有 Y e s核内N u c l e a r表3 猕猴桃R D R蛋白基础理化性质和跨膜结构T a b l e 3 B a s i c p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f R D R p r o t e i n i n k i w i f r u i t蛋白名称P r o t e i n n a m e分子质量/k u M o l e c u l a r m a s s酸碱氨基酸A c i d-b a s e a m i n o a c i dA s p+G l u A r g+L y s等电点p I不稳定系数I n s t a b i l i t y i n d e x脂肪族(氨基酸)系数A l i p h a t i ci n d e x亲水指数H y d r o p a t h y i n d e x跨膜结构T r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nA c R D R 1 a1 1 7.4 1 7 1 71 4 31 2 85.8 94 2.0 18 3.7 1-0.3 4 4无 N o n胞外E x t r a c e l l u l a rA c R D R 1 b1 1 3.7 2 7 8 91 3 31 2 36.1 34 0.7 98 0.8 8-0.3 3 1无 N o n胞外E x t r a c e l l u l a rA c R D R 1 c9 9.5 6 3 9 29 91 0 88.5 43 9.4 48 4.4 5-0.2 0 9无 N o n胞外E x t r a c e l l u l a rA c R D R 2 a1 2 6.6 5 4 7 61 4 01 3 87.0 13 6.8 48 9.7 7-0.2 1 2无 N o n胞外E x t r a c e l l u l a rA c R D R 6 a1 3 6.5 6 7 5 71 4 91 4 76.9 73 8.9 68 3.4 8-0.3 1 1无 N o n胞外E x t r a c e l l u l a rA c R D R 6 b7 5.0 9 6 2 27 68 48.6 23 7.5 38 3.4 1-0.2 3 8无 N o n胞外E x t r a c e l l u l a r2.4.3 AGO家族蛋白的理化性质分析 AGO家族蛋白亚细胞定位广泛分布于核内、细胞质和细胞外(分泌),均不具备跨膜结构。其蛋白理化性质表现为碱性氨基酸数量一般大于酸性氨基酸数量,等电点为6.4 69.5 0,脂溶系数较D C L家族成员 小,处 于7 4.8 88 9.9 6,除A c R D R 1 a、A c R D R 1 b外 均 不 稳 定,亲 水 性 均 较 强 处 于 -0.4 8 3-0.1 9 3(表4)。2.5 蛋白二级结构分析猕猴桃R NA i相关蛋白二级结构分析显示,不同蛋 白 类 型 的 二 级 结 构 存 在 较 大 差 异。在D C L中,4种D C L蛋白二级结构的分布差异巨大,但大体保持着3 8%-螺旋、1 5%-折叠、4 7%无规则卷曲的结构组成,其中A c D C L 4相对特殊,无规则卷曲区域更大,二级结构由2 8%-螺旋、2 0%-折叠、5 2%无规则卷曲组成。在R D R中,6个R D R蛋白的二级结构也存在差异,-螺旋区域占比为2 5%3 4%、-折叠区域占比为1 5%2 1%。在AGO中,相同蛋白类的AGO蛋白二级结构分布较相似,另外AGO蛋白大体上具备-螺旋、-折叠、无规则卷曲区域占比分别为2 5%3 0%、1 7%2 3%、5 0%5 8%(图3)。3 讨论与结论在植物与病毒互作不断发展的过程中,植物逐渐形成一系列抗病毒机制,其中R NA i是最重要的抗病毒机制。R NA i机制参与调控植物多种生物及非生物胁迫、生长繁殖、细胞周期、遗传稳定等过程2 4。R NA i相关蛋白家族不同成员的功能存在差异。拟南芥中研究发现,D C L家族的D C L 2和D C L 4是R NA i抗病毒过程中的核心蛋白,而D C L 1、D C L 3与m i R NA和s i R NA的形成至关重要1 2,2 5。R D R 2和R D R 6是R NA i的信号放大最为相关2 6-2 7。不同植物的AGO成员的抗病毒活性不同,具备抗病毒活性的AGO蛋白主要 分 布 于AGO 1、AGO 2、AGO 3、AGO 4、AGO 5、AGO 7、AGO 1 0、AGO 1 81 7,2 8-2 9。而猕猴桃是我国重要的经济果树,随着猕猴桃病毒不断报道,鉴定和研究猕猴桃抗病毒相关基因D C L、R D R和A G O基因家族显得尤为重要,本研究鉴定了红阳猕猴桃基因组上2 9个R NA i相关蛋白同源基因家族 A c D C L、A c R D R和 A c AGO,通过同源 序列分析其 中具潜在抗 病毒活性的 同源基 因 有2 3个,分 别 是4个D C L基 因(D C L 1 a、99319期方远鹏等:猕猴桃D C L、R D R和A G O基因家族的鉴定与分析表4 猕猴桃A G O蛋白基础理化性质和跨膜结构T a b l e 4 B a s i c p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f A G O p r o t e i n i n k i w i f r u i t蛋白名称P r o t e i n n a m e分子质量/k u M o l e c u l a r m a s s酸碱氨基酸A c