马泰勒虫棒状体颈部蛋白4基因的克隆与原核表达分析.pdf

第5 1卷 第9期2 0 2 3年9月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t.S c i.E d.)V o l.5 1 N o.9S e p.2 0 2 3网络出版时间:2 0 2 3-0 3-0 8 0 9:5 3 D O I:1 0.1 3 2 0 7/j.c n k i.j n w a f u.2 0 2 3.0 9.0 0 1网络出版地址:h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/6 1.1 3 9 0.S.2 0 2 3 0 3 0 6.1 7 2 1.0 0 1.h t m l马泰勒虫棒状体颈部蛋白4基因的克隆与原核表达分析 收稿日期 2 0 2 2-0 5-3 0 基金项目 新疆维吾尔自治区天山青年计划-优秀青年科技人才项目(2 0 2 0 Q 0 1 4);新疆农业大学博士后科研流动站资助项目 作者简介 芦 星(1 9 9 8-),女,陕西西安人,在读硕士,主要从事兽医寄生虫分子免疫学研究。E-m a i l:2 6 7 7 4 4 3 2 3 5q q.c o m 通信作者 张 伟(1 9 8 8-),男,山东烟台人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事兽医寄生虫分子免疫学研究。E-m a i l:z w 2 0 1 7 x j a u 1 6 3.c o m芦 星,范士龙,王水怡,王金明,李思媛,刘明明,刘雨桐,巴音查汗,刘丹丹,张 伟(新疆农业大学 动物医学学院,新疆 乌鲁木齐8 3 0 0 5 2)摘 要【目的】克隆马泰勒虫新疆株棒状体颈部蛋白4基因(R ON4)并原核表达R ON 4蛋白。【方法】参考美国马泰勒虫WA株基因组数据及其他顶复门原虫R ON4基因信息,设计特异性引物,以马泰勒虫新疆株D NA为模板克隆R ON4基因片段,构建p E T-3 2 a-R ON 4原核表达载体后进行原核表达与鉴定,并对R ON 4基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】获得马泰勒虫新疆株R ON4基因(N C B I登录号为:ON 2 5 4 2 1 2)。马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株亲缘关系最近,R ON4基因的核苷酸和氨基酸相似性分别为 9 9.4%和 9 9.0%;R ON4基因在种间高度保守,其氨基酸序列与其他顶复门原虫具有高度相似的保守区域。成功构建了R ON 4蛋白原核表达载体,诱导表达获得分子质量为5 0 k u的重组包涵体蛋白;重组蛋白可与马泰勒虫阳性马血清特异性反应。生物信息学分析表明,马泰勒虫新疆株R ON 4蛋白的亲水性、柔韧性以及表面可及性较弱,B细胞表面抗原表位区域较少,形成表面抗原表位的结构基础条件不足。【结论】克隆获得了马泰勒虫新疆株R ON4基因,并完成了原核表达及鉴定,该基因高度保守,在不同物种间可能具有相似的功能。关键词 马泰勒虫;R ON4基因;原核表达;B细胞抗原表位 中图分类号 S 8 5 8.2 1;S 8 5 2.7 文献标志码 A 文章编号 1 6 7 1-9 3 8 7(2 0 2 3)0 9-0 0 0 1-1 0C l o n i n g a n d p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n a l y s i s o f T h e i l e r i a e q u i r h o p t r y n e c k p r o t e i n 4 g e n eL U X i n g,F AN S h i l o n g,WAN G S h u i y i,WAN G J i n m i n g,L I S i y u a n,L I U M i n g m i n g,L I U Y u t o n g,B AY I N C h a h a n,L I U D a n d a n,Z HAN G W e i(C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,U r u m q i,X i n j i a n g 8 3 0 0 5 2,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】T h i s s t u d y a i m e d t o c l o n e t h e r h o p t r y n e c k p r o t e i n 4(R ON4)g e n e o f T h e i l e r i a e q u i X i n j i a n g s t r a i n a n d t o e x p r e s s R ON 4 p r o t e i n i n p r o k a r y o t e s.【M e t h o d】S p e c i f i c p r i m e r s w e r e d e s i g n e d b y r e f e r r i n g t o t h e g e n o m e d a t a o f T.e q u i WA s t r a i n f r o m t h e U n i t e d S t a t e s a s w e l l a s t h e R ON4 g e n e f r o m o t h e r a p i c o m p l e x a p a r a s i t e s.T h e t a r g e t g e n e f r a g m e n t o f R ON4 w a s c l o n e d f r o m T.e q u i X i n j i a n g s t r a i n a n d u s e d a s D NA t e m p l a t e,a n d t h e p E T-3 2 a-R ON 4 e x p r e s s i o n v e c t o r w a s c o n s t r u c t e d.T h e p r o t e i n w a s e x p r e s s e d w i t h p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n s y s t e m a n d i d e n t i f i e d b y S D S-P AG E a n d W e s t e r n B l o t.F i n a l l y,t h e a m i n o a c i d s o f R ON4 g e n e w e r e a n a l y z e d b y b i o i n f o r m a t i c s i n f o r m a t i c s.【R e s u l t】T h e R ON4 g e n e o f T.e q u i X i n j i a n g s t r a i n w a s s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d w i t h N C B I a c c e s s i o n n u m b e r o f ON 2 5 4 2 1 2.G e n e t i c e v o-l u t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e T.e q u i X i n j i a n g s t r a i n a n d t h e WA s t r a i n w e r e l o c a t e d i n t h e s a m e b r a n c h.T h e n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d s i m i l a r i t i e s o f R ON4 g e n e b e t w e e n t h e t w o s t r a i n s w e r e 9 9.4%a n d 9 9.0%,r e s p e c t i v e l y.T h e R ON4 g e n e w a s h i g h l y c o n s e r v e d,a n d i t s a m i n o a c i d s e q u e n c e w a s h i g h l y s i m i l a r t o t h a t o f o t h e r a p i c o m p l e x a p a r a s i t e s.T h e R ON 4 p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r w a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c-t e d,a n d t h e r e c o m b i n a n t i n c l u s i o n b o d y p r o t e i n w i t h m o l e c u l a r w e i g h t o f 5 0 k u w a s o b t a i n e d.T h e r e c o m b i-n a n t p r o t e i n w a s s p e c i f i c a l l y r e a c t e d w i t h t h e p o s i t i v e h o r s e s e r u m.B i o i n f o r m-a t i c s a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e h y d r o p h i l i c i t y,f l e x i b i l i t y a n d s u r f a c e a c c e s s i b i l i t y o f t h e T e R ON 4 p r o t e i n w e r e w e a k,t h e e p i t o p e r e-g i o n s f o r m e d o f B c e l l e p i t o p e s w e r e f e w,t h e s t r u c t u r a l b a s i s c o n d i t i o n s f o r t h e f o r m a t i o n o f e p i t o p e s w e r e i n s u f f i c i e n t,a n d t h e a n t i g e n i c i t y w a s p o o r.【C o n c l u s i o n】T h e R ON4 g e n e o f T.e q u i X i n j i a n g s t r a i n w a s s u c c e s s f u l l y o b t a i n e d a n d i t s p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n w e r e c o n s t r u c t e d.T h e g e n e w a s h i g h l y c o n s e r v e d a n d m i g h t h a v e s i m i l a r f u n c t i o n s a m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s.K e y w o r d s:T h e i l e r i a e q u i;R ON4 g e n e;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;B c e l l e p i t o p e s 马泰勒虫(T h e i l e r i a e q u i)主要寄生于马属动物的红细胞及网状内皮细胞内,属顶复门血液原虫,经硬蜱传播,在热带、亚热带及部分温带地区分布广泛1-2。马泰勒虫病的临床症状有稽留热、贫血、黄疸等,最主要的临床特点为急性溶血性贫血3-4,马、驴、骡等马属动物均可感染该病,感染此病的母畜大多数会早产或流产,严重者甚至死亡,这对畜牧业的发展造成严重影响3。目前,世界动物卫生组织(WOAH)已将该病列入动物疫病名录,属法定报告疫病,我国将该病列为二类动物疫病5。目前,对于马泰勒虫病的防治还没有十分有效的药物和疫苗,因此开展马泰勒虫入侵宿主细胞关键蛋白及疫苗候选抗原研究,对于该病的防治具有重要意义。据相关文献报道,顶复门原虫在入侵宿主细胞时,大都依赖于一个保守的特殊结构移动连接复合体(m o v i n g j u n c t i o n,M J),M J结构主要由顶膜抗原1和棒状体颈部蛋白组成6-7。根据在棒状体内的分泌位置,顶复门原虫棒状体蛋白可分为棒状体基部蛋白(R O P s)和棒状体颈部蛋白(R ON s)。棒状体颈部蛋白4(r h o p t r y n e c k p r o t e i n 4,R ON 4)是R ON s蛋白家族中的一员,于 1 9 8 0年首次在疟原虫(P l a s m o d i u m)中被发现,随后又在弓形虫(T o x o-p l a s m a)中被发现8-9。对于顶复门原虫 R ON 4蛋白的研究,人们主要关注其与其他入侵相关蛋白相互结合形成M J的关系1 0。A l e x a n d e r等1 1在恶性疟原虫的M J结构中定位到了R ON 4蛋白,表明R ON 4蛋白参与了疟原虫对宿主细胞的入侵过程。免疫试验证实,弓形虫R ON 4蛋白与M J形成相关,在虫体黏附宿主细胞时发挥着重要作用1 2-1 3。另外,研究 人 员 通 过 对 弓 形 虫T g R ON4同 源 基 因T g R ON4L1的研究发现,当R ON 4蛋白分泌减少时,T g R ON 4 L 1蛋 白 的 分 泌 就 会 增 加,以 替 代R ON 4蛋白参与M J移动连接体的形成1 4。此外研究者还发现,R ON 4蛋白除了参与形成M J之外,在虫体入侵宿主细胞初期,还能与宿主细胞骨架蛋白微管蛋白相互作用,协 助虫体对宿 主细胞的定位1 5。然而,有关马泰勒虫R ON 4蛋白的研究至今未见报道。为了探究马泰勒虫中是否存在R ON 4蛋白,以及马泰勒虫R ON 4蛋白的特性,本研究以马泰勒虫新疆株为材料,对R ON4基因进行了克隆分析,并对 R ON 4蛋白进行诱导表达鉴定和生物信息学分析,旨在进一步探究马泰勒虫R ON 4蛋白与R ON s蛋白家族的互作关系,进而为解析马泰勒虫入侵宿主的机制奠定基础。1 材料与方法1.1 样品与试剂马泰勒虫阳性抗凝马全血,采集自新疆塔城地区。p MD 1 9-T载体、p E T-3 2 a载体、大肠杆菌(E.c o-l i)D H 5 和 B L 2 1(D E 3)、T 4 D N A连接酶、E c oR、X h o、2 T a q P C R M i x、A g a r o s e G e l D NA E x t r a c-t i o n K i t、D NA M a r k e r、蛋白质M a r k e r等,购自宝生物 工 程(大 连)有 限 公 司;T I AN a m p G e n o m i c D NA K i t血液/组织 D NA 提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;D A B显色试剂盒,购自康为世纪生物科技有限公司;D NA片段纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒,购自OME GA生物试剂公司;H i s标签小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HR P)标记的羊抗鼠和兔抗马I g G,购自北京博奥森生物技术有限公司。2西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷1.2 引物的设计与合成利用G e n B a n k中公布的顶复门原虫R ON4基因序列保守区作为参考,通过分析B L A S T T h e i l e-r i a e q u i s t r a i n WA XM_0 0 4 8 2 8 5 4 8、T h e i l e r i a o r i-e n t a l i s C P O 5 6 0 6 8、B a b e s i a o v a t a XM_0 2 9 0 1 1 4 6 9基因组数据,预测马泰勒虫R ON4基因片段。以预测获得的马泰勒虫R ON4基因序列为模板,使用P r i m e r P r e m i e r 5.0软件设计特异性引物(F:5 -C C G GAAT T C AT G C T C T AT A C C T C AA C G C AA-T A C-3,R:5 -C C G C T C GAG T T C G T T C T T G T C-T AG T T G T T C T T C-3,F和R引物下划线部分分别为E c oR和X h o酶切位点),送生工生物工程(上海)股份有限公司合成,预期产物长度为9 1 5 b p。1.3 马泰勒虫R ON4基因的克隆用天根生化科技(北京)有限公司的T I AN a m p G e n o m i c D NA K i t D NA提取试剂盒提取马泰勒虫基因组D NA。以基因组D NA为模板P C R扩增R ON4基因,P C R反 应 体 系(2 5 L)为:2T a q P C R M i x 1 2.5 L,正、反向引物各1 L,模板D NA 2 L,无菌双蒸水8.5 L。扩增程序:9 5 预变性5 m i n;9 5 变性3 0 s,5 5 退火3 0 s,7 2 延伸1 m i n,循环3 5次;7 2 延伸1 0 m i n。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测并回收,回收产物经E c oR和X h o双酶切纯化处理后,与克隆载体p MD 1 9-T连接,构建载体p MD 1 9-T-R ON 4,将p MD 1 9-T-R ON 4转化至大肠杆菌DH 5 感受态细胞,接种到含有氨苄抗性(1 0 0 g/m L)的固体L B培养基中,3 7 过夜培养后,挑取单菌落接种于1 m L含有氨苄抗性(1 0 0 g/m L)的液体L B培养基,3 7、1 8 0 r/m i n条件下培养6 h,对培养好的菌落菌液进行P C R鉴定,将P C R鉴定为阳性的转化子送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.4 马泰勒虫R ON4基因的遗传进化分析使用ME GA 7.0软件构建M a x i m u m P a r s i m a-n y(MP)系统发生树,以R ON4基因为标记分析马泰勒虫新疆株与其他顶复门原虫的遗传进化关系。运用D NA S T A R L a s e r g e n e v 7.1中M e g a l i g n软件的C l u s t a l W算法,对顶复门原虫R ON4基因的核苷酸和氨基酸序列进行相似性分析。用J a l v i e w在线软件对顶复门原虫R ON4基因氨基酸序列进行多序列比对,分析R ON 4氨基酸序列的保守区域。1.5 原核表达载体p E T-3 2 a-R ON 4的构建提取 重 组 菌p MD 1 9-T-R ON 4 D NA,将 其 和p E T-3 2 a质粒分别用E c oR和X h o进行双酶切,酶切产物经纯化后使用T 4 D NA连接酶进行连接,将连接产物转化到大肠杆菌B L 2 1(D E 3)感受态细胞内,培养后提取质粒D NA,进行P C R和E c oR、X h o双酶切鉴定。将鉴定为阳性的菌液样品命名为p E T-3 2 a-R ON 4,送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.6 R ON 4重组蛋白的诱导表达与可溶性分析取p E T-3 2 a-R ON 4重组菌液1 0 0 L接种到2 0 m L 含有氨苄抗性(1 0 0 g/m L)的L B培养基内,在3 7、1 8 0 r/m i n条件下培养,待菌液在6 0 0 n m波长下的吸光度值(O D6 0 0)达到0.6时,加入I P T G使其浓度为0(未诱导),0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mm o l/L并诱导表达6 h,取诱导表达产物1 2 0 0 0 r/m i n离心1 m i n,收集菌体,加入2 0 L的4 l o a-d i n g B u f f e r制样,1 0 0 煮沸1 0 m i n,1 2 0 0 0 r/m i n离心2 m i n后吸取上清进行S D S-P AG E电泳分析,确定I P T G最佳诱导浓度。取p E T-3 2 a-R ON 4重组菌液,加最优浓度的I P T G于3 7 下诱导表达,分别在诱导0(未诱导),1,2,3,4,5,6 h取1 m L菌液样品,1 2 0 0 0 r/m i n离心1 m i n,收集菌体,加入2 0 L的4l o a d i n g B u f f e r制样,1 0 0 煮沸1 0 m i n,1 2 0 0 0 r/m i n离心2 m i n后吸取上清,进行S D S-P AG E电泳分析,确定I P T G最佳诱导时间。在最优条件下对p E T-3 2 a-R ON 4重组菌液进行诱导表达,表达产物经1 2 0 0 0 r/m i n离心1 m i n后收集菌体,超声(功率3 0 0 W,开2 s关4 s)破碎5 m i n、1 2 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n后分别收集上清与沉淀,产物分别加入2 0 L的4 l o a d i n g B u f f e r制样,1 0 0 煮沸 1 0 m i n,1 2 0 0 0 r/m i n离心2 m i n后吸取上清进行S D S-P AG E验证,分析其可溶性。1.7 R ON 4重组蛋白的W e s t e r n B l o t分析取上述在最优条件下诱导表达的样品,离心、超声破碎、离心后收集沉淀,加4 l o a d i n g B u f f e r制样后吸取上清(具体方法同上)。向蛋白胶孔内每孔加入8 L重组蛋白样品,进行S D S-P AG E电泳后,湿转于P V D F上,用含T w e e n-2 0(3 L/m L)的P B S稀释脱脂乳至终质量浓度为5 0 g/L作为封闭液,4 过夜封闭,分别使用H i s标签鼠单抗和马泰勒虫阳性血清作为一抗(11 0 0),以辣根过氧化物酶(HR P)标记的羊抗鼠和兔抗马I g G为二抗(用5 0 g/L脱脂乳15 0 0 0稀释)进行反应,使用D A B显色液避光孵育1 m i n,观察结果。1.8 马泰勒虫R ON 4蛋白的生物信息学分析使用D NA S T A R软件的P r o t e a n分析马泰勒3第9期芦 星,等:马泰勒虫棒状体颈部蛋白4基因的克隆与原核表达分析虫R ON 4蛋白的亲疏水性、柔韧性和表面可及性,使用在线软件I E D B(h t t p:/www.i e d b.o r g)分析其B细胞抗原表位。2 结果与分析2.1 马泰勒虫R ON4基因的克隆与鉴定以马泰勒虫基因组D NA为模板,经P C R扩增获得长度约为9 1 5 b p的R ON4目的片段(图1-A)。以p MD 1 9-T-R ON 4重组菌液为模板,P C R鉴定获得了长度约为9 1 5 b p的片段(图1-B),与预期结果一致。对p MD 1 9-T-R O N 4重组菌液进行测序分析,结果显示本序列(N C B I登录号为:O N 2 5 4 2 1 2)与G e n-B a n k收录的马泰勒虫W A株(美国)相似性最高。A.R ON4基因P C R扩增结果;B.p MD 1 9-T-R ON 4重组菌液P C R鉴定结果。M.2 0 0 0 b p 分子量标准;1,2.R ON4基因P C R样品;3,4.p MD 1 9-T-R ON 4重组菌液A.P C R a m p l i f i c a t i o n o f R ON4 g e n e;B.P C R i d e n t i f i c a t i o n o f p MD 1 9-T-R ON 4 r e c o m b i n a n t b a c t e r i a l s o l u t i o n.M.2 0 0 0 b p D NA M a r k e r;1,2.R ON4 g e n e P C R s a m p l e s;3,4.p MD 1 9-T-R ON 4 r e c o m b i n a n t b a c t e r i a l s o l u t i o n图1 马泰勒虫R ON4基因的克隆与鉴定F i g.1 C l o n i n g a n d i d e n t i f i c a t i o n o f R ON4 g e n e i n T h e i l e r i a e q u i2.2 R ON4基因遗传进化分析及多序列比对基于R ON4基因的1 5种顶复门原虫进化分析结果(图2)符合物种分类,其中马泰勒虫新疆株被归类到泰勒虫属,马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株(美国)位于同一分支上。图2 基于马泰勒虫R ON4基因序列的1 5种顶复门原虫的遗传进化分析F i g.2 G e n e t i c e v o l u t i o n a n a l y s i s o f 1 5 a p i c o m p l e x a p a r a s i t e s b a s e d o n R ON4 g e n e s e q u e n c e o f T h e i l e r i a e q u i 将马泰勒虫R ON4基因序列与其他1 4种顶复门原虫的R ON4基因序列进行相似性比对,结果4西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷(表1)显示,马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株(美国)相 似 度 最 高,核 苷 酸、氨 基 酸 相 似 性 分 别 为9 9.4%和9 9.0%;与刚地弓形虫核苷酸相似度最低,为3 3.5%;与新孢子虫氨基酸相似度最低,为1 6.6%。在1 5种顶复门原虫中,新孢子虫和刚地弓形虫的R ON 4蛋白氨基酸序列不完整,因此与其他虫株差异性较大,影响比对结果,故选取其他1 3种虫株的R ON 4蛋白氨基酸进行多序列对比,结果(图3)显示,马泰勒虫与其他顶复门原虫R ON 4蛋白氨基酸序列C端保守性较高,含有丰富的半胱氨酸,共有6组,并且在物种间高度相似。在对比的1 3种顶复门原虫中,每种虫体都至少含有6组高度相似的半胱氨酸,该区域可能是R ON 4蛋白的重要功能区。表1 1 5种顶复门原虫R ON4基因序列的相似性分析T a b l e 1 S i m i l a r i t y a n a l y s i s o f R ON4 g e n e s e q u e n c e s o f 1 5 a p i c o m p l e x a p a r a s i t e s虫株 S t r a i n1234567891 01 11 21 31 41 519 9.45 7.2 5 8.2 5 5.6 5 3.6 5 1.2 4 9.4 5 2.9 4 8.0 4 0.5 4 5.0 3 3.5 3 5.3 4 4.629 9.04 6.8 4 6.7 4 5.6 4 0.2 3 7.9 3 5.7 3 9.1 3 6.7 3 3.33 9.4 2 8.1 2 8.63 9.635 4.54 2.76 1.96 2.7 4 2.64 4.14 3.0 4 1.4 3 6.9 3 1.5 3 7.3 2 8.4 2 8.5 3 7.745 4.03 8.56 2.37 6.6 4 1.9 3 8.1 3 7.0 3 9.4 3 5.5 3 3.9 3 8.9 2 7.9 2 7.9 3 9.855 3.73 8.56 2.18 0.54 2.6 3 8.0 3 7.1 4 1.0 3 5.8 3 3.3 3 7.9 2 7.8 2 7.2 3 8.564 7.63 0.32 9.62 7.22 8.25 5.15 3.9 6 0.1 3 9.3 3 3.9 3 9.4 2 8.6 2 8.1 3 8.674 6.62 9.12 9.02 5.62 5.75 1.48 1.7 5 1.5 3 6.4 3 3.0 3 5.6 2 8.6 2 7.2 3 5.684 6.32 8.92 8.52 6.12 6.05 1.58 0.25 1.4 3 5.7 3 2.13 3.6 2 8.32 7.3 3 3.394 5.72 9.12 8.62 6.32 6.55 2.04 6.74 6.53 6.8 3 2.2 3 8.9 2 7.3 2 6.8 3 8.01 03 5.91 8.01 9.21 6.41 6.31 7.71 6.61 6.81 7.53 2.3 3 6.6 2 8.8 2 6.5 3 5.91 12 2.31 5.81 7.91 6.51 7.21 6.21 6.21 6.41 5.31 6.05 3.1 2 8.9 2 9.1 5 2.51 22 3.21 5.41 6.51 7.51 7.51 6.01 4.01 3.81 5.71 4.54 1.53 4.3 3 1.4 9 3.51 31 9.01 2.01 2.81 2.21 1.91 1.81 1.51 2.51 2.21 0.91 3.31 0.84 3.5 3 3.51 41 6.61 1.41 2.21 0.81 0.41 1.01 2.51 2.31 1.01 0.51 3.41 0.66 0.03 1.41 52 1.91 5.71 7.81 6.61 6.81 5.81 4.51 3.81 5.31 5.84 2.38 6.51 0.91 0.2 注:右上三角为核苷酸序列相似性,左下三角为氨基酸序列相似性。1.马泰勒虫新疆株;2.马泰勒虫WA株(XM 0 0 4 8 2 8 5 4 8.1);3.东方泰勒虫(C P 0 5 6 0 6 8.1);4.小泰勒虫(AA G K 0 1 0 0 0 0 0 2.1);5.环形泰勒虫(XM 9 4 7 5 6 0.1);6.羊巴贝斯虫未定种(XM 0 2 9 0 1 5 5 0 3.1);7.卵形巴贝斯虫(XM 0 2 9 0 1 1 4 6 9.1);8.莫 氏 巴 贝 斯 虫(XM 0 1 2 9 1 0 5 1 1.1);9.牛 巴 贝 斯 虫(XM 0 0 1 6 1 2 1 6 2.1);1 0.田 鼠 巴 贝 斯 虫(XM 0 2 1 4 8 2 8 5 5.1);1 1.间日疟原虫(K X 5 1 3 8 1 7.1);1 2.约氏疟原虫(L K 9 3 4 6 3 7.1);1 3:刚地弓形虫(XM 0 0 2 3 6 7 8 1 4.2);1 4.新孢子虫(L N 7 1 4 4 8 3.1);1 5.伯氏疟原虫(L T 6 0 8 2 7 3.1)。N o t e:T h e u p p e r r i g h t t r i a n g l e r e p r e s e n t s t h e s i m i l a r i t y o f n u c l e o t i d e s e q u e n c e a c i d,a n d t h e l o w e r l e f t t r i a n g l e r e p r e s e n t s a m i n o s e q u e n c e s i m i l a r i t y.1.T h e i l e r i a e q u i s t r a i n X i n j i a n g;2.T h e i l e r i a e q u i s t r a i n WA(XM 0 0 4 8 2 8 5 4 8.1);3.T h e i l e r i a o r i e n t a l i s(C P 0 5 6 0 6 8.1);4.T h e i l e r i a p a r v a(AA G K 0 1 0 0 0 0 0 2.1);5.T h e i l e r i a a n n u l a t a(XM 9 4 7 5 6 0.1);6.B a b e s i a s p.X i n j i a n g(XM 0 2 9 0 1 5 5 0 3.1);7.B a b e-s i a o v a t a(XM 0 2 9 0 1 1 4 6 9.1);8.B a b e s i a b i g e m i n a(XM 0 1 2 9 1 0 5 1 1.1);9.B a b e s i a b o v i s(XM 0 0 1 6 1 2 1 6 2.1);1 0.B a b e s i a m i c r o t i(XM 0 2 1 4 8 2 8 5 5.1);1 1.P l a s m o d i u m v i v a x(K X 5 1 3 8 1 7.1);1 2.P l a s m o d i u m y o e l i i(L K 9 3 4 6 3 7.1);1 3.T o x o p l a s m a g o n d i i(XM 0 0 2 3 6 7 8 1 4.2);1 4.N e o s p o r a c a n i n u m(L N 7 1 4 4 8 3.1);1 5.P l a s m o d i u m b e r g h e i(L T 6 0 8 2 7 3.1).黑色框内展示的是半胱氨酸B l a c k b o x e s s h o w c y s t e i n e图3 顶复门原虫R ON 4氨基酸的多序列比对F i g.3 M u l t i p l e c o m p a r i s o n o f R ON 4 a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f a p i c o m p l e x a p a r a s i t e s5第9期芦 星,等:马泰勒虫棒状体颈部蛋白4基因的克隆与原核表达分析 黑色框内展示的是半胱氨酸B l a c k b o x e s s h o w c y s t e i n e图3 顶复门原虫R ON 4氨基酸的多序列比对(续)F i g.3 M u l t i p l e c o m p a r i s o n o f R ON 4 a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f a p i c o m p l e x a p a r a s i t e s(C o n t i n u e d)2.3 原核表达载体p E T-3 2 a-R ON 4的鉴定p E T-3 2 a-R ON 4经P C R鉴定获得了9 1 5 b p的片段(图4-A),E c oR和X h o双酶切鉴定获得约5 9 0 0和9 1 5 b p的目的片段(图4-B),均与预期结果一致,表明目的基因片段成功插入原核表达载体。2.4 重组蛋白的诱导表达与可溶性分析重组菌经不同浓度I P T G诱导表达6 h,表达产物的S D S-P AG E 分析结果显示,I P T G终浓度