利用两样本孟德尔随机化方法探究茶摄入量与膀胱癌发病风险的因果关系.pdf

（编校：谈静）3450柴红强，等利用两样本孟德尔随机化方法探究茶摄人量与膀胱癌发病风险的因果关系sis of readmissions data among frail and non-frail patients presen-ting for acoustic neuromaJ.J Clin Neurosci,2022,99:82-88.4RYKACZEWSKI B,ZABEK M.A meta-analysis of treatment ofvestibular schwannoma using Gamma Knife radiosurgery J.Cont-emp Oncol(Pozn),2014,18(1):60-66.5TUCKER DW,GOGIA AS,DONOHO DA,et al.Long-term tumorcontrol rates following Gamma Knife radiosurgery for acoustic neu-romaJ.World Neurosurg,2019,122:366-371.6TULEASCA C,GEORGE M,SCHIAPPACASSE L,et al.GammaKnife radiosurgery for intravestibular and intracochlear schwanno-masJ.Acta Neurochir(Wien),2019,161(1):63-67.7CEVIK M,ALEMAN D,LEE Y,et al.Simultaneous optimization ofisocenter locations and sector duration in radiosurgery J.PhysMed Biol,2019,64(2):025010.8MENDEL JT,SCHROEDER S,PLITT A,et al.Expanded radiosur-gery capabilities utilizing Gamma Knife Icon JJ.Cureus,2021,13(3):e13998.9PADDICK I.A simple scoring ratio to index the conformity of radio-surgical treatment 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一），男，山西运城人，硕士研究生，研究方向：泌尿系肿瘤。E-mail：c h a i 1998 33 s i n a.c o m【通信作者】邵晋凯（196 3一），男，山西太原人，主任医师，研究方向：泌尿系肿瘤。E-mail：s h a o j i n k a i 2 0 0 8 s i n a.c o m3451MODERNONCOL31,No.18第31卷第18 期2023年0 9 月现代肿瘤医学【关键词】孟德尔随机化；膀胱癌；因果推断；全基因组关联研究【中图分类号】R737.14【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.18.022【文章编号】16 7 2-4992-（2 0 2 3)18-3450-0 5Using two sample Mendelian randomization method to explore the causal relationshipbetween tea intake and the risk of bladder cancerCHAI Hongqiang,PANG Lei2,WU Ming,LI Fei,SHAO Jinkai?1 The Fifth Clinical Medical College of Shanxi Medical University,Shanxi Taiyuan 030012,China;Department of Urology,Shanxi Pro-vincial Peoples Hospital,Shanxi Taiyuan 030012,China.Abstract】O b j e c t i v e:T o a s s e s s t h e c a u s a l e f f e c t o f t e a i n t a k e o n b l a d d e r c a n c e r u s i n g t h e t w o -s a mp l e M e n d e l i a nrandomization(2-sample-MR,2SMR)method.Methods:Based on the data from a large-scale tea intake genome-wide association study(GWAS)and the GWAS of bladder cancer,we investigated the causality between tea intakeand bladder cancer using an inverse variance weighted(IVW)method,MR-Egger analysis and weighted medianmethod.Finally,sensitivity analysis is conducted to evaluate the stability and reliability of the results.Results:Inversevariance weighted method(0R=0.999,95%CI:0.995 1.000,P=0.465 20),MR-Egger analysis(OR=1.000,95%CI:0.984 1.017,P=0.945 25),and weighted median method(0R=0.998,95%CI:0.993 1.003,P=0.497 28)showed no causal relationship between tea intake and bladder cancer(P 0.05).Conclusion:This resultof two-sample Mendelian randomization analysis reveals no casual effect between tea intake and bladder cancer.Key words)Mendelian randomization,bladder cancer,causal inference,genome-wide association study(GWAS)Modern Oncology 2023,31(18):3450-3454膀胱癌是起源于膀胱的恶性肿瘤，它是泌尿系统常见的肿瘤之一,其中尿路上皮癌是最常见的组织学亚型 。膀胱癌的发生是外界环境与内在遗传因素共同作用的结果。目前关于膀胱癌的病因暂不明确，但是已经有证据证明吸烟、感染以及工业化学物质等因素参与了膀胱癌的发生2 。膀胱癌的发病率在过去几十年中一直保持稳定或下降，这可能与吸烟人数的减少、水果蔬菜摄人量的增加以及血吸虫病的有效防治有关3。然而目前尚无切实有效的预防膀胱癌的措施。因此，为了有效预防膀胱癌，我们必须进一步明确有关膀胱癌发病的危险因素。茶是由茶树的叶子通过特殊工艺制成的，是世界范围内除水以外消费最广泛的饮料4。关于茶可能对健康有益的研究可以追溯到几十年前。茶的潜在健康益处作用主要归因于茶多酚，茶多酚已被证明具有抗氧化、抗炎和预防癌症的特性5。茶叶中的其他生物活性成分,包括茶素和咖啡因等也被认为具有潜在的抗癌作用6 。因此，饮茶被认为是预防心血管疾病和癌症的健康生活习惯。多项动物研究证明茶或茶的成分茶多酚在各种组织中具有预防或抑制癌症的作用。然而，关于饮茶与膀胱癌的因果关联的流行病学研究的结果却并不一致。一项meta分析结果显示，在西方国家，每天饮用一杯茶可降低膀胱癌的发病风险7 。而另一项meta分析则表明，经常吸烟的人茶摄入量增多则会增加患膀胱癌的风险。而经常饮用红茶的女性可能会降低膀胱癌的发病风险8 。最近的一项关于前瞻性队列研究的meta分析也没有证据证明茶摄人量与癌症的发病风险之间具有相关性1。因此,茶摄入量与膀胱癌发病风险之间的关系仍存在争议。孟德尔随机化（Mendelianrandomization，M R）利用单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphisms,SNPs）作为工具变量（instrumentalvariables,IVs）来推断暴露与结局之间的因果关联。由于遗传变异在配子形成过程中是随机分配的，并且大多不受环境或生活方式因素的影响，因此MR可以克服混杂因素和反向因果关联对因果推断的影响。本研究采用两样本孟德尔随机化方法，基于公开的大样本全基因组关联研究（genomew i d e a s s o c i a t i o n s t u d y，G W A S）数据库探索茶摄人量与膀胱癌发病风险的因果关系。1资料与方法1.1数据来源与SNP选择茶和膀胱癌的GWAS均来自于https：/g w a s.m r c i e u.a c.uk/网站，该数据具体信息详见表1。孟德尔随机化要求选定的SNP与茶摄人量强相关。为了保证选定的SNPs与膀胱癌风险的强相关性，避免弱工具变量产生偏倚，我们将F10定义为无弱工具偏倚。计算公式为:F=N-K-1，K1-R?0其中N为暴露数据库中的样本量,K为样本量,R为暴露数据库中由SNPs解释的变异所占的比例9。R的计算公式为：R=2（1-M A F）M A F（/SD）,其中MAF为次要等位基因频率，为等位基因效应值,SD为标准。表1两样本MR研究中CWAS数据库的简要信息Tab.1Summary of the GWAS included in this two-sample MR studyGWAS IDTraitConsortiumSample sizeNumber of SNPsPopulationTea cancerukb-b-6066Tea intakeMRC-IEU4474859851867EuropeanBladder cancerukb-b-8193Bladder cancerMRC-IEU4629339851867European3452利用两样本孟德尔随机化方法探究茶摄入量与膀胱癌发病风险的因果关系柴红强，等1.2MR分析本研究使用双样本MR方法评估茶摄人量与膀胱癌风险之间的因果关系。MR研究建立在三个主要假设的基础上10 :(1)SNP与暴露（茶摄人量）强相关。（2)SNP与混杂因素之间没有关联。（3）SNP只能通过暴露（茶摄人量）影响结局（膀胱癌），即不存在基因多效性。本研究主要采用逆方差加权（IVW）作为此次分析的主要方法。IVW法具有较强的因果检测能力，但是IVW法特别要求遗传变异仅通过研究中的暴露影响结局。尽管此研究尽可能排除了已知的与混杂相关的SNP,然而仍有许多未知的混杂因素可能会对结果产生偏倚。因此,我们还采用了MREg g e r 回归、加权中位数（WME)2种方法来进行MR分析。如果以上3种不同的MR方法对因果推断都得出了相似的结果，我们则认为这个结果是可靠的。1.3敏感性分析我们采用CochransQ评估SNP间的异质性1。如果没有观察到显著的异质性（P0.05）,则使用固定效应模型；否则，使用随机效应模型。对于多效性的评价我们采用了多种方法：（1)我们使用MR-Egger截距作为评价方向多效性的指标12 。（2)使用“留一法（leaveo n e o u t)对结果进行敏感性分析,从而判断单个SNP对因果关系的影响程度。(3）采用离群值（MR-PRESSO）方法作为评估和校正水平多效性的指标13所有的统计分析方法均是在R4.2.1软件中用“Mende-lian Randomization”（0.4.3版）和Two Sample MR”（0.5.6版）的R包完成的。两侧P0.05被认为差异有统计学意义。2结果2.1IVs的选择结果去除存在连锁不平衡的IVs后，本研究共纳人2 4个SNP（P 510-8,R0.01）,并通过检索PhenoScanner数据库来判断 SNP与潜在混杂因素的联系。最终7 个 SNP因与膀胱癌潜在危险因素具有相关性而被排除,其中rs4410790、rs17685、r s 2 47 2 2 97 因与咖啡摄人量相关而被排除，rs713598因与饮酒相关而被排除，rs1453548因与吸烟相关而被排除，rs9937354、r s 930 2 42 8 因与肥胖相关而被排除。rs2783129因同方向纠正而被排除。剩下的16 个SNP被选为茶摄人量的工具变量（表2）。所有SNPs与膀胱癌发病风险强相关,其F值=2 0.538 56,大于常规值10，表明其不存在弱工具变量对结果产生偏倚。2.2MR分析结果IVW方法显示没有证据支持茶摄入量与膀胱癌之间存在因果关系（SE=0.00182,P=0.46520；表3，图1A，图2B）。M R-Eg g e r 分析显示茶摄入量与膀胱癌之间没有因果关系（SE=0.00833,P=0.94525；表3，图1A图2 B）。加权中位数方法也没有发现茶摄入量与膀胱癌之间存在因果关系的证据（SE=0.00252,P=0.49728；表3,图1A,图2 B）。使用IVW、M R-Eg g e r 和加权中位数三种方法确定的MR值是一致的。因此,MR分析结果证明茶摄人量与膀胱癌之间不存在因果关联。2.3敏感性分析IVW(P=0.38297)和MR-Egger回归(P=0.45222)的CochransQ检验均表明SNPs不存在异质性（表3），故本研究选用固定效应模型。MR-Egger回归截距几乎等于0（b=0.00058,P=0.94525，图1A），表明并不存在方向多效性。“留一法”分析结果显示依次剔除各SNP后，剩余的15个SNPs的IVW分析结果与纳入全部SNPs的分析结果相似,未发现对因果关联影响较大的SNPs（图1B）。M R-PRESSO分析结果显示，本研究所纳人的SNPs并无显著的异常值。漏斗图（图2 A）也显示因果关联受到潜在偏倚的影响较小。3讨论本研究采用公共数据库里的GWAS数据，使用两样本孟德尔随机化方法分析了茶摄入量与膀胱癌发病风险之间的因果联系，结果表明茶摄入量与患膀胱癌风险之间没有直接的因果关系。表2 与茶摄入量有关的16 个SNPsTab.2A total of 16 SNPs associated with tea intakeSNPsPOSCHREAOAEAFSEPrs115874441.51E+081GA0.393460.0140330.002171.00E-10rs11164870935521871GC0.60457-0.011960.002184.20E-08rs561888621.74E+081CT0.38745-0.015760.002174.30E-13rs2117137895255053GA0.405150.0129950.002161.70E09rs34619604653655AG0.430910.0117120.002144.30E-08rs77571021.37E+086GA0.55543-0.01180.002133.10E-08rs9648476392930337AG0.622950.0125010.002191.10E-08rs107649901.29E+0810AG0.60716-0.012190.002171.90E-08rs107522691269290210AG0.50608-0.012870.002121.30E09rs23511878685061610AG0.318940.0129020.002281.60E-08rs107416941628618311CT0.627920.0150040.002197.90E12rs68291.12E+0813TC0.59616-0.011920.002173.70E-08rs22798444081980917AG0.37934-0.011990.002184.00E-08rs48081931941062219CT0.335320.0151150.002251.70E-11rs48175053434382821CT0.389980.0150680.002174.20E-12rs96244702482026822AG0.580050.0252070.002151.30E-31注：CHR：染色体;EA：效应等位基因;OA：非效应等位基因;：等位基因效应值;SE:的标准误。Note:CHR:Chromosome,EA:Effector allele,OA:Non-effector allele,:Allelic effect value,SE:Standard error of.MODERNONC.31,No.183453.2023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学表3IVW，M R-Eg g e r 回归和WME的OR估计值及其95%CIsTab.3The OR values of IVW,MR-Egger regression and WME and their 95%CIsExposureMethodOutcomeSEPOR(95%CI)Cochrans Q(P)IVW0.001820.465200.999(0.995 1.000)14.98889(0.38297)Tea intakeMR-EggerBladder cancer0.008330.945251.000(0.984 1.017)14.92980(0.45222)WME0.002520.497280.998(0.993 1.003)注：OR：比值比；CI：置信区间SE：标准误。Note:OR:Ratio ratio,CI:Confidence interval,SE:Standard error.MRTestAtiverse variance.weightedWeightedmedianBrs10752269MREBEcrWeightedmoders34619Simplemoders23511872e-04rs9624470rs2117137rs48175051e-04-rs10741694rs10764990rs77571020e+00rs11164870rs2279844-1e-04.rs9648476rs6829rs11587444-2e-04.rs4808193rs56188862-3e-04.A1l0.0100.0150.0200.025-0.006-0.004-0.0020.0000.002SNPeffectonTeaintakellMRleave-one-outsensitivityid:ukb-b-6066analysis for图1两样本MR分析结果散点图（A）和留一法敏感性分析结果（B）Fig.1Scatter plot(A)of the two-sample MR analysis and result of leave-one-outsensitivity analysis(B)AMRMethodBInversevarianceweightedIMREggerrs6829250rs4808193rs56188862rs11587444rs9648476rs2279844rs11164870200rs7757102NaS/Irs10764990rs10741694rs9624470rs4817505150rs2117137rs2351187rs10752269rs34619All-MREgger-0.010.00All-InversevarianceweightedBiv图2两样本MR分析结果漏斗图（A)和森林图（B)Fig.2Funnel plot(A)and forest plot(B)of the two-sample MR analysis先前的多项研究报告了茶摄人量对膀胱癌的保护作用2.4-15。儿茶素是茶叶中的主要活性成分。儿茶素主要包括6 种成分，分别为表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC），其中ECCG最为重要16 。人们普遍认为绿茶的许多化学预防作用可能是由ECCG介导的15。ECCG在许多动物试验中已被证实对多种肿瘤的发生发展具有很好的抑制作用，尤其是肺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等6.17-19。其作用机制可能包括：（1)诱导细胞调亡。据报道,EGCG可以上调Fas和Ba基因并下调Bcl-2蛋白表达水平,通过死亡受体途径和线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡2 0-2 3。（2)抑制肿瘤细胞转移和逃逸。ECCG通过调控MMP酶活性来抑制肿瘤细胞转移,同时抑制肿瘤微环境中的免疫抑制细胞来阻止肿瘤免疫逃逸2 。（3)抑制血管生成来阻止肿瘤的生长2 4。O(4)抗氧化作用。EGCG是一种抗氧化剂,能够消灭活性氧（RO S),促进DNA氧化损伤,从而产生抗癌作用2 5-2 7 。虽然饮茶降低膀胱癌发病风险的生物学途径已被提出，但其因果关系尚不清楚。MR分析最大限度地减少了由于残余混杂或反向因果关系而导致观察性研究固有偏倚的可能性。我们的MR研究是第一个全面评估茶摄人量与膀胱癌发病风险之间因果关系的研究。我们使用了CWAS数据集确定16 个SNP,并使用三个不同的模型来确定其因果关系。然而,MR分析的结果易受多效性的影响2 8 。因此,为了消除多效性，我们采用了加权中位数分析，即使有50%的SNPs不是有效的工具变量，它也提供了有效的MR分析结果，并（编校：谈静）3454利用两样本孟德尔随机化方法探究茶摄入量与膀胱癌发病风险的因果关系柴红强，等且我们还使用MR-Egger回归来评估不平衡多效性的检验和暴露对结果的因果效应2 9。如截距P值所示,MR-Egger方法未显示不平衡多效性的证据。我们的数据不支持茶摄人量和膀胱癌发病风险之间的因果关系。先前报道的茶摄人量与膀胱癌发病风险之间的关联可能是观察性研究中可能有偏倚或混杂因素的影响。本研究存在一定的局限性。首先,所有的CWAS数据均来源于欧洲人群，我们所得出的结果是否适用于其他人群还有待进一步研究，其次，我们的研究中是将茶摄人量作为一个整体纳人，没有针对茶的类型、制备及其冲泡方法进行分类分析，这也需要我们在未来进行更广泛的研究。综上所述，我们采用两样本孟德尔随机化方法来综合评估饮茶是否会降低患膀胱癌的风险，结果表明茶摄入量并不会影响膀胱癌的发病率。【参考文献】1ZHAO LG,LIZY,FENG GS,et al Tea drinking and risk of cancer inci-dence:a meta-analysis of prospective cohort studies and evidence e-valuation J.Advances in Nutrition,2021,12(2):402-412.2HALASEH SA,HALASEH S,ALALI Y,et al.A review of the etiol-ogy and epidemiology of bladder cancer:all you need to know J.Cureus,2022,14(7):e27330.3XU C,ZENG XT,LIU TZ,et al.Fruits and vegetables intake andrisk of bladder cancer:a PRISMA-compliant systematic reviewand dose-response meta-analysis of prospective cohort 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