苦荞转录因子基因FtbHLH3的克隆、亚细胞定位及表达分析.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):194-203收稿日期：2023-01-16基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK2021重点 035），国家自然科学基金项目（31701494，32260461），国家燕麦荞麦现代农业产业技术体系专项资金（CARS-07-A5）作者简介：吕秋谕，女，硕士，研究方向：植物分子生物学；E-mail:通讯作者：李洪有，男，博士，教授，研究方向：植物分子生物学；E-mail:苦荞转录因子基因 FtbHLH3 的克隆、亚细胞定位及 表达分析吕秋谕 孙培媛 冉彬 王佳蕊 陈庆富 李洪有（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵阳 550001）摘 要：bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子在植物黄酮化合物生物合成中具有重要的调控作用。为探究苦荞Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn中 bHLH 转录因子在黄酮化合物生物合成中的功能和分子调控机制，利用 RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）技术从苦荞中克隆了一个 bHLH 转录因子基因 FtbHLH3，并对其进行生物信息学、亚细胞定位、转录激活活性、基因表达、基因共表达和基因表达量与总黄酮含量相关性分析。结果表明，FtbHLH3 全长 CDS 序列为 783 bp，编码 260个氨基酸。保守结构域和系统进化分析表明，FtbHLH3 是一个非 IIIf 亚家族 bHLH 转录因子成员。亚细胞定位和转录激活活性分析显示，FtbHLH3 定位于细胞核，不具有转录激活活性。基因共表达分析表明，FtbHLH3 与苦荞中拟南芥 TT8 同源基因 FtTT8 和 12个黄酮化合物生物合成结构基因共表达。不同组织部位中基因表达量与总黄酮含量间相关性分析表明，FtbHLH3 的表达量与总黄酮含量间具有较高的正相关性。本研究结果表明，FtbHLH3 是一个定位于细胞核，不具有转录激活活性的非 IIIf 亚家族 bHLH 转录因子，可能通过与其他转录因子互作来调控苦荞黄酮化合物的生物合成。关键词：苦荞；FtbHLH3；bHLH 转录因子；基因克隆；亚细胞定位；转录激活；黄酮DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0034Cloning,Subcellular Localization and Expression Analysis of the Transcription Factor Gene FtbHLH3 in Fagopyrum tataricumLYU Qiu-yu SUN Pei-yuan RAN Bin WANG Jia-rui CHEN Qing-fu LI Hong-you（Research Center of Buckwheat Industry Technology,Guizhou Normal University,Guiyang 550001）Abstract:bHLH（basic helix-loop-helix）transcription factors play crucial roles in the biosynthesis of flavonoids in plants.In order to explore the function and molecular regulation mechanism of bHLH transcription factor in flavonoid biosynthesis in tartary buckwheat,RT-PCR was used to clone the FtbHLH3,one bHLH transcription factor.Then the bioinformatics subcellular localization,transcriptional activation activity,gene expression,gene co-expression,and the correlation between gene expression level and total flavonoid content of it were conducted.As results,the CDS length of FtbHLH3 was total 783 bp and it encoded total 260 amino acids.Conserved domain and phylogenetic analysis showed that FtbHLH3 was a member of non-IIIf subfamily of bHLH transcription factor family.Subcellular localization and transcriptional activation assay suggested that FtbHLH3 was located in the nucleus and had no transcriptional activation activity.Gene co-expression analysis revealed that FtbHLH3 was co-expressed with the Arabidopsis TT8 homologous gene FtTT8 and 12 structural genes of flavonoid biosynthesis in the tartary buckwheat.The correlation analysis between gene expression level and total flavonoids content in different tissues indicated that there was a highly positive correlation between the expressions of FtbHLH3 and the contents of total flavonoids.All these results suggest that FtbHLH3 2023,39(8)195吕秋谕等：苦荞转录因子基因 FtbHLH3 的克隆、亚细胞定位及表达分析苦荞（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn）是一种起源于我国西南地区的重要药食同源小杂粮作物，其种子含有较为丰富的生物活性黄酮类化合物（1%-3%），具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多种保健功能1-2。类黄酮作为苦荞中最主要的保健和品质成分，其含量直接影响着苦荞的品质。因此，发掘苦荞类黄酮生物合成调控基因，解析其分子调控机制对高黄酮苦荞新品种培育具有重要意义。大量研究表明，植物 MYB（v-myb avian myelo-blastosis viral oncogene homolog）和 bHLH 转录因子在类黄酮生物合成中具有重要调控作用3-4。bHLH转录因子是植物中第二大转录因子家族，其中最早被功能鉴定调控类黄酮生物合成的是玉米（Zea mays）的 ZmB 和 ZmR，它们通过正调控类黄酮生物合成结构基因 ZmA1（DRF）和 ZmBz1（UFGT）的表达来调控花青素的生物合成5。继玉米 ZmB 和ZmR 被鉴定后，迄今调控类黄酮生物合成的 bHLH转录因子已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）（TT8、GL3 和 EGL3）等 30 余种植物中被鉴定6-15。在所有鉴定的 bHLH 转录因子中，除羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel）LcbHLH92 可 能 通 过 调 控LcTT8 基因的表达来负调控原花青素和花青素的生物合成外15，其余 bHLH 转录因子均通过直接调控类黄酮生物合成后期结构基因（DFR、LAR、ANS、ARN 和 UFGT）的表达来正调控或负调控原花青素或花青素的合成。此外，几个鉴定的bHLH转录因子，如 玉 米 ZmR5和 ZmIn116、杨 梅（Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc）MrbHLH117、萝 卜（Raphanus sativus L.）RsTT88、钝鳞紫背苔（Plagiochasma）PabHLH110、梨（Pyrus spp.）PpbHLH6414等 除调控类黄酮生物合成后期结构基因表达外，还直接调控了类黄酮生物合成早期结构基因（CHS、CHI、F3H、F3H）的表达，暗示植物 bHLH 转录因子可能还参与调控了原花青素和花青素外的其他类黄酮的生物合成。值得注意的，除羊草的 LcbHLH9215和梨 PpbHLH6414外，所有已鉴定的 bHLH 转录因子均属于植物 bHLH 转录因子家族的 IIIf 亚家族，它们通常需要与 MYB 类转录因子互作后才具有调控类黄酮生物合成的功能1,18。因此，发掘植物中调控类黄酮生物合成的非 IIIf 亚家族 bHLH 转录因子，对拓展人们对 bHLH 转录因子调控植物类黄酮生物合成的分子机制的认识具有重要意义。目前，在苦荞类黄酮生物合成调控研究方面，一些 MYB 转录因子已被鉴定调控了苦荞类黄酮的生物合成。其中，FtMYB1、FtMYB2、FtMYB15 通过正调控 DFR、ANS 和负调控 FLS 基因的表达来正调控原花青素和花青素的生物合成19-20，而 FtMYB3、FtMYB8 和 FtMYB18 则通过抑制原花青素和花青素合成结构基因的表达来负调控原花青素和花青素的生 物 合 成21-23。相 比 较，FtMYB116、FtMYB31、FtMYB6、FtMYBF 通过直接激活黄酮醇生物合成基因 F3H、F3H、FLS 和 UFGT 的表达来正调控黄酮醇芦丁、槲皮素、山奈酚、杨梅素等的生物合 成24-28，而 FtMYB11、FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15 和 FtMYB16 则负调控黄酮醇芦丁的生物合成29-31。虽然苦荞中已有 10 余个 MYB 转录因子被功能鉴定调控了苦荞类黄酮生物合成，但迄今未见其他类型转录因子尤其是 bHLH 类转录因子参与调控类黄酮生物合成相关报道。因此，开展苦荞类黄酮生物合成相关的特别是不属于植物中已报道的全新 bHLH 转录因子的鉴定，对全面解析苦荞类黄酮生物合成的分子调控机制具有重要意义。在前期的研究中，通过转录组和代谢组关联分析，从苦荞中鉴定到一个非 IIIf 亚家族 bHLH 转录因子基因 FtbHLH3（FtPinG0000754600.01），可能参与调控苦荞类黄酮的生物合成32。本研究在此基础上，从苦荞中克隆了该基因，并对其进行了生物信息学、转录特性、亚细胞定位、基因共表达、基因表达量与总黄酮含量间相关性分析，旨在为进一步is a non-IIIf subfamily bHLH transcription factor that was located in the nucleus and has no transcriptional activation activity.It may regulate the flavonoids biosynthesis in tartary buckwheat through interacting with other transcription factors.Key words:tartary buckwheat;FtbHLH3;bHLH transcription factor;gene cloning;subcellular localization;transcriptional activation;flavonoid生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8196研究其生物学功能及其分子调控机制提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料供试植物材料为苦荞品种黑苦 013 号和本 氏 烟 草Nicotiana benthamiana（K.）。质 粒pMD19-T 购自 TaKaRa 公司，pGBKT 和 16318-hGFP质粒由本实验室保存。大肠杆菌（Escherichia coil）DH5、根 癌 农 杆 菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 和酵母菌株 AH109 由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 总 RNA 的提取和第一链 cDNA（complementary DNA）合成 利用多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒（TIANGEN，北京）提取黑苦 013成年植株不同组织部位（茎、顶端 1 叶、顶端 3 叶、花，授粉后 7、13、16 d 的种子）的总 RNA。用 PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（TaKaRa，大连），以顶端 3 叶总 RNA 为模板，反转录合成用于基因克隆的第一链 cDNA。用 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa，大连），以各组织部位的总 RNA 为模板，反转录合成用于荧光定量的第一链 cDNA。1.2.2 FtbHLH3 全长 CDS 序列克隆 根据苦荞基因组中 FtbHLH3 的参照 CDS 序列，利用 Primer Premier 5.0 软件设计扩增目标基因的特异引物 FtbHLH3F1和 FtbHLH3R1（表 1）。利用 KOD 高保真酶，以叶cDNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增完成后用 Tap 酶进行加 A 反应。利用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，回收目的片段并连接 pMD19-T 载体上，转化大肠杆菌感受态 DH5。转化子经 PCR 检测后，送阳性克隆至生工生物工程（成都）股份有限公司测序。1.2.3 FtbHLH3 的生物信息学分析 用在线软件ORFfinder（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）查 询 FtbHLH3 的 开 放 阅 读 框（open reading frame,ORF）；用 BioXM 2.6 软件预测其编码蛋白的等电点和分子量大小；用 ProtScale 软件分析其亲/疏水性；通过 NCBI 数据库进行 FtbHLH3 同源比对和保守结构域查询；用 MEGA 7.0.21 软件，通过最大似然法（ML）构建 FtbHLH3 蛋白的系统进化树。1.2.4 FtbHLH3 的亚细胞定位 设计分别带 Sal I和 BamH I 酶切位点的 FtbHLH3 的上下游特异引物FtbHLH3F2 和 FtbHLH3R2（表 1），以测序正确的pMD19-T-FtbHLH3 质粒为模板进行 PCR 扩增。然后，用 Sal I 和 BamH I 对 PCR 产物和 16318-GFP 空载体进行双酶切，纯化回收酶切产物并用 T4 DNA 连接酶连接，构建 35SFtbHLH3-GFP 亚细胞定位载体。亚细胞定位具体操作参照孙小倩等28的方法进行。1.2.5 FtbHLH3 的转录激活活性分析 设计分别带 EcoR I 和 BamH I 酶切位点的 FtbHLH3 的上下游特异引物 FtbHLH3F3 和 FtbHLH3R3（表 1），以测 序 正 确 的 pMD19-T-FtbHLH3 质 粒 为 模 板 进 行PCR 扩增。随后，通过双酶切法将 FtbHLH3 连接到 pGBKT7 载体上，构建酵母表达载体 pGBKT7-FtbHLH3。将 pGBKT7-FtbHLH3、pGBKT7（阴性对照）和 pGBKT7-53（阳性对照）质粒利用 LiAc 法分别转化酵母菌株 AH109，并在 SD/-Leu-Trp、SD/-Ade-His-Leu-Trp 和 含 有 X-gal 的 SD/-Ade-His-Leu-Trp培养基上培养 5 d，观察并拍照。1.2.6 FtbHLH3 与苦荞类黄酮生物合成结构基因的共表达分析 利用 Li 等32和 Zhang 等33发表的转录组数据，获得 FtbHLH3 和另外 36 个在种子差异表达的 bHLH 转录因子基因及 14 个苦荞类黄酮生表 1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study引物名称 Primer name引物序列Primer sequence（5-3）FtbHLH3F1ATGGATAACATCGGTGACGAGTACFtbHLH3R1TCAATTGATCGTAGCGCTATGAGGFtbHLH3F2CAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACATGGATAAC-ATCGGTGACGAGFtbHLH3R2CCTCGCCCTTGCTCACCATGGATCCATTGATCGT-AGCGCTATGAGFtbHLH3F3CCGGAATTCATGGATAACATCGGTGACGAGTACFtbHLH3R3CGCGGATCCTCAATTGATCGTAGCGCTATGAGGFtbHLH3qFGGTGTTTGAATCACTGGAGCFtbHLH3qRTCGTAGCGCTATGAGGTTGAFtActin7FATGTTCACTACCACCGCTGAFtActin7RTGAACCTCTCAGCACCAATC注：下划线序列表示酶切位点Note:Underlined sequences indicate restriction sites2023,39(8)197吕秋谕等：苦荞转录因子基因 FtbHLH3 的克隆、亚细胞定位及表达分析物合成结构基因（3 个 CHS、1 个 CHI、2 个 F3H、2 个 F3H、1 个 F35H、1 个 FLS、1 个 ANS、1 个ANR、1 个 DFR 和 1 个 LAR）在苦荞不同组织（根、茎、叶、花和 3 个发育时期种子）的 FPKM 表达值，用TBtools 进行基因表达聚类分析，确定 FtbHLH3 与苦荞类黄酮生物合成结构基因的共表达关系28,32-33。1.2.7 FtbHLH3 在苦荞不同组织部位中的表达分析及总黄酮提取 设计 FtbHLH3 的实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）引物FtbHLH3qF 和 FtbHLH3qR。利 用 SYBR Premix Ex TaqTM II 试剂盒，以苦荞黑苦 013成年植株的茎顶端 1 叶、顶端 3 叶、花、授粉后 7、13 和 16 d的种子 cDNA 为模板，FtActin7 为内参基因进行荧光定量分析，检测 FtbHLH3 在苦荞不同组织部位的表达情况。各样品的总黄酮的提取及测定参照吕丹等34的方法进行。1.2.8 FtbHLH3 在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析 利用 Excel 中的单因素方差分析法分析 FtbHLH3 表达量在不同组织间的差异显著性和总黄酮含量在不同组织部位间的差异显著性，当 P 0.8，P0.05），且其中 8 个类黄酮生物合成结构基因与 FtbHLH3 和 FtTT8 均存在显著正相关（表 2）。2.6 FtbHLH3在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析利用实时荧光定量 PCR 分析 FtbHLH3 在苦荞成年植株不同组织部位中的表情况，结果如图 6-A 所示，FtbHLH3 在叶、授粉后 13 d 的种子和茎中高表达，与转录组数据相符。总黄酮含量分析表明（图6-B），苦荞顶端 3 叶总黄酮含量最高（5.37%），随后依次为顶端 1 叶（3.90%）、茎（3.68%）、授粉后13 d 种子（3.07%）、授粉后 16 d 种子（2.56%）、授 FtEGL3-2 FtEGL3-1 LcbHLH3 AtGL3 AtEGL3 AtMYC2 FtGL3 VvMYCA1 LcbHLH1 MdbHLH33 ZmB1 ZmLc ZmR1 PabHLH1 DhbHLH1 ZmIN1 RsTT8 AtTT8 Myc-F3G1 LsRLL1 NtAn1b NtAn1a VvMYC1 MtTT8 AcbHLH42 FtbHLH33/FtTT8 MdbHLH3 AtbHLH115 AtbHLH091 LcbHLH92 BnbHLH92 AtbHLH092 AlbHLH92 FtbHLH3 AtbHLH3a AtbHLH3bIIIf?IVd?IIIf subfamilyIVd subfamily0.2图 2 FtbHLH3 与已知的调控类黄酮生物合成的 bHLH 蛋白的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of FtbHLH3 and known bHLH protein regulating flavonoid biosynthesis?Control?Bright?DAPI?GFP?Merge35S:FtbHLH3-GFP图 3 FtbHLH3 亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of FtbHLH3pGBKT7SD/-Leu/-TrpSD/-Ade/-His/-Leu/-TrppGBKT7-53pGBKT7-FtbHLH3SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-gal图 4 FtbHLH3 在酵母中转录自激活活性鉴定Fig.4 Identification of transcriptional self-activation activ-ity of FtbHLH3 in yeast2023,39(8)199吕秋谕等：苦荞转录因子基因 FtbHLH3 的克隆、亚细胞定位及表达分析FtbHLH20FtbHLH19FtbHLH21FtbHLH31FtbHLH13FtbHLH23FtbHLH1FtbHLH32FtbHLH27FtbHLH30FtbHLH10FtbHLH26FtFLSFtbHLH9FtbHLH4FtbHLH25FtbHLH12FtEGL3-2FtF3H-2FtANSFtF3H-1FtF3H-2FtbHLH14FtANRFtLARFtEGL3-1FtCHS-3FtbHLH29FtCHS-1FtCHS-2FtCHIFtF3H-1FtbHLH33/FtTT8FtDFRFtbHLH3FtbHLH16FtbHLH35FtbHLH36FtEGL3-3FtbHLH6FtbHLH37FtbHLH28FtbHLH17FtbHLH15FtbHLH34FtbHLH11FtbHLH18FtbHLH22FtbHLH5FtGL3-1FtF35HFtbHLH2FtbHLH8FtbHLH24FtbHLH7FtGL3-2?Root?Stem?Leaf?Flower?1-1 Seed1-1?1-2 Seed1-2?2-1 Seed2-1?2-2 Seed2-2?3-1 Seed3-1?3-2 Seed3-2-3.00-2.00-1.00-0.00-1.00-2.00-3.00种子 1：授粉后 7 d 的种子；种子 2：授粉后 13 d 的种子；种子 3：授粉后 16 d 的种子；-1 和-2 表示生物学重复 1 和 2。红色框表示的是与 bHLH3 共表达的苦荞黄酮生物合成结构基因和 bHLH 转录因子基因Seed 1:Seeds 7 d after pollination.Seed 2:Seeds 13 d after pollination.Seed 3:Seeds 16 d after pollination.-1 and-2 represent biological repeat 1 and 2.The red box shows the flavonoid biosynthesis structure genes and bHLH transcription factor genes co-expressed with bHLH3 of tartary buckwheat图 5 FtbHLH3 与苦荞种子差异表达 bHLH 转录因子基因和类黄酮生物合成结构基因的表达聚类热图Fig.5 Expression cluster heat map of FtbHLH3,differentially expressed transcription factor bHLH genes and flavonoid bio-synthesis structure genes in tartary buckwheat seeds生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8200粉后 7 d 种子（2.09%）和花（1.33%）。FtbHLH3 表达量与总黄酮含量相关性分析显示（图 6-C），在不同组织部位中 FtbHLH3 的表达量与总黄酮含量显著相关（R2=0.81，P=0.01）。3 讨论苦荞是一种重要的小杂粮，其含有丰富的黄酮类化合物，具有极高的保健作用。近年来，有关苦荞黄酮化合物生物合成的分子机制研究已成为苦荞分子生物学领域的研究热点。随着苦荞基因组的解析，苦荞黄酮化合物生物合成途径已基本明晰，大多数黄酮生物合成结构基因已被功能验 证33,35-37。此外，多个调控苦荞黄酮化合物生物合成的调控基因也被鉴定，但它们主要是 MYB 类转录因子19-31。大量研究表明，bHLH 转录因子在植物黄酮化合物生物合成中也具有重要的调控作用3-4。然而，目前苦荞中未见参与调控黄酮化合物生物合成的 bHLH 转录因子报道。本研究在前期研究基础上，克隆了一个调控苦荞黄酮化合物生物合成的候选基因 FtbHLH3，对其进行了生物信息学、转录特性、亚细胞定位、基因共表达、基因表达量与总黄酮含量间相关性等方面的分析和研究。3.1 FtbHLH3是不具有转录激活活性bHLH转录因子家族成员bHLH 转录因子是植物中第二大转录因子家族，其家族所有成员的蛋白序列中均含有一个保守的 bHLH 结构域3,7-8。本研究利用 RT-PCR 方法从苦荞品种黑苦 013中克隆了前期研究鉴定的调控苦荞黄酮化合物生物合成的候选 bHLH 转录因子基因 FtbHLH3。蛋白序列保守结构域和亚细胞定位分析显示，FtbHLH3 含有 bHLH 转录因子家族的保守结构域3,7-8，其蛋白亚细胞定位于细胞核，具有典型的转录因子亚细胞定位特性，表明其是一个bHLH 转录因子家族成员。FtbHLH3 的转录激活活性分析表明，其不具有转录激活活性，暗示其可能通过与其他具有转录激活作用的转录因子互作来调控下游靶基因表达。3.2 FtbHLH3可能是植物中调控类黄酮生物合成的全新bHLH转录因子植物 bHLH 转录因子在类黄酮生物合成中具有极其重要的调控作用3-4。目前已报道的调控类黄酮生物合成的 bHLH 转录因子主要通过调控类黄酮生物合成结构基因表达来调控类黄酮生物合成，表 2 FtbHLH3 与类黄酮生物合成结构基因表达相关系数Table 2 Correlation coefficient between FtbHLH3 and flavonoid biosynthesis structure gene expression基因名称Gene nameFtbHLH3FtbHLH14FtbHLH29FtbHLH33/FtTT8rPrPrPrPFtCHS-10.948 40.032 70.640 40.028 50.722 80.046 40.898 60.045 8FtCHS-20.961 40.002 50.746 70.002 10.746 10.004 20.930 40.004 1FtCHS-30.760 00.000 50.615 40.000 40.911 90.001 00.947 50.001 0FtCHI0.890 80.001 70.752 60.000 90.833 70.011 10.975 70.008 4FtF3H-10.849 80.000 20.825 20.000 20.676 10.000 30.880 30.000 3FtF3H-20.522 43.15E-050.589 32.1E-050.701 60.000 10.798 48.19E-05FtF3H-10.810 20.001 00.595 80.000 70.929 60.002 60.976 70.002 3FtF3H-20.859 40.000 20.825 10.000 20.678 30.000 30.884 20.000 3FtF35H0.631 90.048 00.257 70.019 50.528 50.301 80.719 80.262 8FtFLS-0.239 66.36E-050.179 15.78E-050.144 78.18E-050.042 08.05E-05FtDFR0.946 40.002 40.786 50.002 00.694 90.004 00.937 00.003 9FtANS0.700 00.000 10.747 00.000 10.760 80.000 20.852 20.000 2FtANR0.955 60.006 90.921 10.006 00.476 90.010 30.773 40.010 1FtLAR0.923 60.014 70.782 20.011 40.754 40.028 10.947 80.026 92023,39(8)201吕秋谕等：苦荞转录因子基因 FtbHLH3 的克隆、亚细胞定位及表达分析如 玉 米 ZmR5和 ZmIn116、杨 梅 MrbHLH117、萝 卜 RsTT88、钝 鳞 紫 背 苔 PabHLH110和 梨PpbHLH6414已被功能和生化实验证实通过直接调控黄酮化合物生物合成结构基因 CHS、CHI、F3H、F3H、ANS、ARN、DFR、LAR 和 UFGT 的 表 达 来调控黄酮化合物的生物合成。在本研究中，利用公共可用的转录组数据进行基因共表达分析发现，FtbHLH3 与调控拟南芥黄酮化合物生物合成的关键bHLH 转录因子基因 TT8 的同源基因 FtTT8 和 12 个类黄酮生物合成结构基因（3 个 CHS、1 个 CHI、2个 F3H、2 个 F3H、1 个 ANS、1 个 ANR、1 个 DFR和 1 个 LAR）共表达。RT-qPCR 分析显示，FtbHLH3在苦荞不同组织部位中的表达模式与来自转录组数据的表达模式高度相似。此外，FtbHLH3 在不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析显示，其表达量与总黄酮含量间存在极高的正相关性。这表明，FtbHLH3 是苦荞中一个重要的黄酮化合物生物合成调控基因，其可能通过正调控黄酮化合物生物合成结构基因的表达来正调控黄酮化合物的生物合成。在植物中，目前已鉴定的调控黄酮化合物生物合成的 bHLH 转录因子，除羊草 LcbHLH9215和梨 PpbHLH6414外，均属植物 bHLH 转录因子家族的 IIIf 亚家族成员18。本研究中，系统进化分析显示，FtbHLH3 与已知的调控黄酮化合物生物合成的 bHLH 转录因子 IIIf 亚家族和 IVd 亚家族成员不聚为一支，暗示其可能是植物中一个调控黄酮化合物生物合成的全新 bHLH 转录因子。在植物中，大多数调控黄酮化合物生物合成的 bHLH 转录因子需要与 MYB 转录因子互作来调控黄酮化合物的生物合 成6-15。本研究中，FtbHLH3 的蛋白结构域分析显示，其不含有与 MYB 蛋白互作的结构域。此外，转录激活活性分析结果显示，FtbHLH3 不具有转录激活活性。这些结果表明，FtbHLH3 可能通过与其他类型的转录因子互作来调控苦荞黄酮化合物的生物合成。然而，有关 FtbHLH3 的功能及调控黄酮化合物生物合成的分子机制有待进一步研究。4 结论FtbHLH3 是一个非 IIIf 亚家族 bHLH 转录因子茎Stem Leaf 1Leaf 2FlowerSeed 1Seed 2 Seed 3465432103.532.521.510.50叶1叶2花 种子1 种子2种子3相对表达量Relative expression总黄酮含量Total flavonoid content/%茎Stem Leaf 1Leaf 2FlowerSeed 1Seed 2 Seed 3叶1叶2花 种子1 种子2种子36543210总黄酮含量Total flavonoid content FtbHLH3相对表达量Relative expression of FtbHLH3Y=1.12X+1.68R2=0.81;R=0.90P=0.01ABCabdfecfbbafecdA：FtbHLH3 在苦荞不同组织部位中的表达情况；B：苦荞不同组织部位的总黄酮含量；C：FtbHLH3 在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性。叶 1：成年植株顶端 1 叶；叶 2：成年植株顶端 3 叶；种子 1：授粉后 7 d 种子；种子 2：授粉后 13 d 种子；种子 3：授粉后 16 d 种子。图中不同小写字母表示在 P 0.05 水平差异显著A:Expression of FtbHLH3 in different tissues of tartary buckwheat.B:Total flavonoid contents in different tissue parts of tartary buckwheat.C:Correlation between the expressions of FtbHLH3 in different tissues of tartary buckwheat and the contents of total flavonoids.Leaf 1:Top 1 leaf of adult plant.Leaf 2:Top 3 leaf of adult plant.Seed 1:Seeds at 7 d after pollination.Seed 2:Seeds at 13 d after pollination.Seed 3:Seeds at 16 d after pollination.Different lower letters indicate significant differences at P 0.05 level图 6 FtbHLH3 在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性Fig.6 Correlation between the expressions of FtbHLH3 in different tissue parts of tartary buckwheat and the contents of total flavonoids生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8202成员，其编码蛋白定位于细胞核、不具有转录激活活性，其可能通过与非 MYB 转录因子互作来调控苦荞黄酮化合物生物合成结构基因的表达来调控黄酮化合物的生物合成。参 考 文 献1Zhang KX,He M,Fan Y,et al.Resequencing of global Tartary buckwheat accessions reveals multiple domestication events and key loci associated with agronomic traitsJ.Genome Biol,2021,22（1）:23.2Li HY,Lyu QY,Liu AK,et al.Comparative metabolomi