克氏原螯虾前列腺素E2受体EP4基因的序列特征及表达分析.pdf

前列腺素E2(P G E2)受体E P 4在动物体的卵巢发育、排卵和生殖调控方面具有重要的作用。利用转录组测序的方法从克氏原螯虾卵巢中获得了P G E2受体E P 4(P c E P 4)基因的具有完整开放阅读框的c D NA序列。为阐明该基因的序列特征及其在克氏原螯虾卵巢中的作用,对该基因的序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量P C R方法对该基因的表达模式进行检测。生物信息学分析结果显示:P c E P 4基因开放阅读框长2 5 0 5b p,编码8 3 5个氨基酸;P c E P 4是一个典型的具有7个跨膜-螺旋结构的G蛋白偶联受体蛋白;克氏原螯虾E P 4氨基酸序列与凡纳滨对虾的相似性最高,亲缘关系最近。基因表达结果显示:P c E P 4基因表达量在克氏原螯虾成熟卵巢中的表达量最高;在期的卵巢中,P c E P 4基因在期卵巢中的表达量最高;P G E2注射后3 6、4 8、6 0h,克氏原螯虾卵巢中P c E P 4基因表达量与对照组相比显著升高(P0.0 5),注射7 2h后克氏原螯虾的抱卵率与对照组相比也升高。试验结果表明,E P 4作为P G E2的受体与P G E2一起在克氏原螯虾的卵巢中具有促进卵子成熟和排卵的重要作用。关键词:克氏原螯虾;前列腺素E2受体;E P 4;基因表达;卵巢中图分类号:Q 7 8 6文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 5 8 5-0 9收稿日期:2 0 2 1-0 3-0 1;修回日期:2 0 2 2-0 1-2 1.基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 1 9 7 2 8 1 2);河南省重点科技攻关项目(1 9 2 1 0 2 1 1 0 0 8 1).作者简介:江红霞(1 9 7 4),女,副教授,博士;研究方向:水生生物遗传资源.E-m a i l:j i a n g h o n g x i a 2 0 0 71 2 6.c o m.前列腺素(P G)广泛存在于动物体的各种组织和体液中,主要包括前列环素I2(P G I2)、前列腺素E2(P G E2)、前 列 腺 素F2(P G F2)、前 列 腺 素D2(P G D2)和血栓素A2(T x A2),由环氧合酶(C O X)途径代谢产生1,在炎症、免疫反应、心血管控制和大多数动物的繁殖中发挥着积极的作用2。而其中的P G E2则与许多雌性节肢动物的卵巢和卵母细胞的发育有关,如:P G E2量的增加可以促进日本囊对虾(M a r s u p e n a e u s j a p o n i c u s)处于卵黄发生阶段的卵巢的发育3;给斑节对虾(P e n a e u sm o n o d o n)饲喂含有P G E2的多毛类动物,卵母细胞发育速度和排卵效率有提高4;给普通黄道蟹(O z i o t e l p h u s as e n e xs e n e x)施加P G E2,其性腺指数和卵母细胞直径以剂量依赖性方式不断增加5。P G E2通过结合其特异性受体发挥功能。现已鉴定出4种不同的P G E2受体,分别为E P 1、E P 2、E P 3和E P 4。早期的研究指出,E P 4分布十分广泛,其mR NA几乎在大鼠(R a t t u sn o r v e g i c u s)所有的组织中都能检测到6。虽然可以与E P 4相结合的前列腺素类似物众多,但是其与P G E2的亲和力是最高的7。已有研究显示,E P 4在动物体的卵巢发育、排卵和生殖调控方面也具有重要的作用,如S e g i等8的研究表明,小鼠(M u sm u s c u l u s)的卵巢在超排过程中表达大量的E P 4mR NA,且其原位杂交结果显示E P 4mR NA信号主要定位于腔前卵泡的卵母细胞,这些结果充分地证明E P 4在排卵反应中起重要的调节作用。B a y n e等9的研究也发现,在人的原始生殖细胞中发现有E P 4的表达,且对一些重要的生殖调控基因的表达具有调节作用。克氏原螯虾(P r o c a m b a r u sc l a r k i i),属节肢动物门甲壳纲十足目螯虾科原螯虾属,俗名淡水小龙虾,是我国重要的淡水虾类养殖品种。克氏原螯虾营养丰富、肉质鲜美,深受人们的喜爱,近几年的价格也一路攀升,在我国具有非常重要的经济地位,据2 0 2 0中国渔业统计年鉴1 0数据显示,2 0 1 9年,全国克氏原螯虾养殖产量达到2 0 8.9 6 0 4万t,在淡水甲壳动物养殖中位居第一位。随着克氏原螯虾在我国养殖规模的不断扩大,规模化养殖场需要在同一时期内提供规格整齐的苗种,因此,如何促进克氏原螯虾卵巢同步发育和排卵已成为克氏原螯虾规模化养殖产业中重要的研究课题。笔者从 克 氏 原 螯 虾 卵 巢 转 录 组 测 序 中 得 到E P 4基因的包含有完整的开放阅读框的c D NA序列,命名为P c E P 4基因,对该基因的c D NA序列进行生物信息学分析及表达模式的检测,并检测注射P G E2后雌虾卵巢中P c E P 4基因的表达变化和虾的抱卵率变化,以期为克氏原螯虾卵巢同步发育和排卵的调控研究提供一定的基础资料。1 材料与方法1.1 试验材料试验用虾取自河南师范大学水产养殖基地,养殖水温2 0 2 5,每日早晚各投喂商品饲料1次,1周换水1次。采集卵巢发育处于成熟期(期)的雌性克氏原螯虾(2 5 5)g的不同器官、组织样品,包括卵巢、肝胰腺、心脏、胃、肠道、脑、眼柄、肌肉、鳃和腹神经索共1 0种;采集成年雌虾的 期的不同发育阶段的卵巢样品(期:卵原细胞增殖期;期:卵黄发生前期;期:初级卵黄发生期;期:次级卵黄发生期;期:成熟期;期:恢复期),卵巢分期参照李胜等1 1方法进行。每种试验样品采集6尾虾,样品获得后立即放入R N A保存液(天根,北京)中,并于冰箱-8 0保存,直到进行R N A的提取。1.2 P c E P 4基因c D NA序列的获得利用R NA提取试剂盒(Om e g a公司)提取克氏原螯虾期卵巢组织的总R NA,提取步骤按试剂盒说明书进行。利用N a n o D r o p2 0 0 0分光光度计(T h e r m o,美国)和1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测R NA的浓度、纯度和完整性,检测合格后,将卵巢R NA样品(2 0尾虾的混合样)送上海美吉生物医药有限公司进行转录组测序,建立克氏原螯虾卵巢c D NA文库,从文库中获得P c E P 4基因的转录本序列,包含完整的开放阅读框。1.3 P c E P 4基因序列的生物信息学分析使用在线软件对P c E P 4基因进行序列分析,在线网址为:h t t p:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/g o r f/o r f i g.c g i(基因开放阅读框的预测)、h t t p:/w e b.e x-p a s y.o r g/c o m p u t e_p i/(蛋白的理论相对分子质量以及 理 论 等 电 点 的 预 测)、h t t p:/www.d a b i.t e m p l e.e d u/d i s p h o s/(蛋 白 磷 酸 化 位 点 预 测)、h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/N e t NG l y c/(蛋白糖 基 化 位 点 预 测)、h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/TMHMM/(蛋白的跨膜螺旋预测)和h t-t p s:/s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e(蛋 白 三维结构预测)等。通过P r e d i c tP r o t e i n软件对蛋白质进行亚细胞定位,应用C l u s t a l X2程序进行氨基酸多重序列比对,应用ME GA5.0软件构建邻接系统进化树。1.4 P c E P 4基因在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达分析P c E P 4基因在克氏原螯虾成虾的不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达模式利用实时荧光定量P C R法进行。首先利用R N A试剂盒(Om e g a公司)提取克氏原螯虾的不同样品的总R N A。利用N a n o-D r o p2 0 0 0分光光度计(T h e r m o,美国)和1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测R N A的浓度、纯度和完整性。以R N A为模板,使用P r i m e S c r i p tR Tr e a g e n tK i tw i t hg D N AE r a s e r(T a K a R a)试剂盒合成用于q P C R反应的c D N A。依据P c E P 4基因c D N A序列在其开放阅读框区设计荧光定量引物,上、下游引物分别为5 -G C T G G T G G A A C C C T G T C A T C-3 和5 -C C T C A T A-C T C G T G G G C T C G T-3,扩增片段大小为1 5 8b p;以1 8 Sr R N A作为内参基因,上、下游引物分别为5 -T A T A C G C T A G T G G A G C T G G A A-3 和5 -GG G G A G-G T A G T G A C G A A A A A T-3。实时荧光定量P C R使用C F X 9 6实时荧光P C R检测系统(B i o-R a d,U S A)进行操 作,反 应 体 系 按S Y B RP r e m i xE x T a qTM(T a K a R a,大连)试剂的说明书配制;反应条件为:9 5预变性3 0s;9 55s,6 03 0s,共4 0个循环;7 23 0s。其中每个样品的目的基因和内参基因分别进行3次技术重复。采用2-Ct法1 2计算P c E P 4基因在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的相对表达量。利用S P S S2 0.0软件对各数据进行单因素方差分析,并进行L S D多重比较和邓肯多重比较,当P0.0 5时 表 明 具 有 显 著 性 差 异。所 有 图 片 采 用G r a p h P a dP r i s m5软件绘制,结果用平均值标准误表示。1.5 P G E2注射试验P G E2粉剂(购自S i g m a-A l d r i c h公司,美国)溶于磷酸盐缓冲液,配制成2m g/m L的P G E2母液。挑选卵巢发育处于期的克氏原螯虾分成2组,每组8 0尾虾,试验组用微量注射器在第2腹节处按照1.0g/g体质量的剂量1 3肌肉注射2 0L由母液稀释后的不同质量浓度的P G E2溶液,对照组注射同体积的磷酸盐缓冲液。在注射后的0、1 2、2 4、3 6、4 8、6 0、7 2h,每个时间点每组各取6尾未抱卵虾,解685水 产 科 学第4 2卷剖取其卵巢,利用实时荧光定量P C R法检测P G E2注射对克氏原螯虾卵巢中P c E P 4基因表达量的影响。实时荧光定量P C R方法同1.4部分。统计7 2h后各组中所剩的抱卵虾占总虾数的百分比。在整个试验过程中有少量虾的死亡,对照组死亡率为1 5%,试验组死亡率为1 7.5%。总虾数为除去死亡和解剖后所剩的活虾。2 结 果2.1 P c E P 4基因c D NA和氨基酸序列分析P c E P 4基因开放阅读框2 5 0 5b p,共编码8 3 5个氨基酸,推导的蛋白分子质量为9 3.2 4 6k u,理论等电点为8.2 9,分子式为C4 1 2 3H6 3 6 3N1 1 9 7O1 2 1 6S3 4。在其 氨 基 酸 组 成 中,含 量 最 高 的 是 苏 氨 酸,占9.7%,其次是丝氨酸和亮氨酸,各占9.0%和8.6%。另外,在该氨基酸序列上预测到3 5个磷酸化位点,包含1 4个丝氨酸、1 5个苏氨酸、6个酪氨酸,预测到2个糖基化位点,分别位于第4 9位和第1 7 3位氨基酸处。在该氨基酸序列上还预测到有7个跨膜-螺旋结构域序列,分别位于第6 18 7、9 71 2 3、1 3 51 6 5、1 7 71 9 9、2 2 62 5 5、2 8 23 1 2和3 2 33 4 8位氨基酸处。跨膜-螺旋序列及附近共有4 1个氨基酸残基构成配体结合口袋(图1)。图1 P c E P 4基因c D NA序列和氨基酸序列分析F i g.1 S e q u e n c ea n a l y s i s o f t h ec D N Aa n da m i n oa c i do fP c E P 4开放阅读框的起始密码子(A T G)和终止密码子(T GA)用双下划线标注;预测的磷酸化位点用单下划线标注;预测的糖基化位点用波浪线标注;灰色背景部分为7个跨膜螺旋序列;构成配体结合口袋的4 1个氨基酸残基用蓝色标注.T h es t a r t(A T G)a n ds t o pc o d o n(T AA)o f t h eO R Fa r ed o u b l e-u n d e r l i n e d;t h ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e s a r eu n d e r l i n e d;t h eg l y c o s y l a-t i o ns i t e sa r em a r k e dw i t hw a v y l i n e s;s e v e nt r a n s m e m b r a n eh e l i xs e q u e n c e sa r e i n d i c a t e db yg r a yb a c k g r o u n d s;t h e4 1a m i n oa c i dr e s i d u e s t h a tm a k eu pt h e l i g a n db i n d i n gp o c k e t a r em a r k e d i nb l u e.785第4期江红霞等:克氏原螯虾前列腺素E2受体E P 4基因的序列特征及表达分析2.2 P c E P 4氨基酸序列同源性比较及系统进化分析利用美国国家生物技术信息中心B L A S T P软件,将克氏原螯虾与其他已知动物的E P 4氨基酸序列进行同源性比对,结果显示,克氏原螯虾的E P 4氨基酸序列与其他已知动物的相似性为3 2%5 0%,其中:与甲壳动物凡纳滨对虾(L i t o p e n a e u sv a n n a m e i)的相似性最高,为4 9.1%;与鱼类中的斑马鱼(D a n i or e r i o)和软体动物真蛸(O c t o p u sv u l-g a r i s)的相似性次之,分别为3 2.2%和3 2.1%;与哺乳动 物 智 人(H o m os a p i e n s)的 相 似 性 最 低,为3 0.1%(表1)。利用P r e d i c tP r o t e i n软件对E P 4进行了亚细胞定位,E P 4定位于细胞膜部位(图2 a)。利用E x-p a s y在线软件预测了E P 4的三维结构,发现该蛋白具有7个-螺旋结构(图2 b),结合TMHMM软件的跨膜螺旋预测,得知这是7个跨膜-螺旋结构。使用C l u s t a lX 2将克氏原螯虾E P 4氨基酸序列与其他动物的进行多重比对,发现他们均具有7个跨膜-螺旋区,2个半胱氨酸残基形成的1个二硫键,3个配体结合残基和1个能与P G E2的羧基相结合的以精氨酸为中心的三联体,其氨基酸序列结构见图3。利用ME GA5.0构建系统进化树,发现E P 4进化树分为两大支,脊椎动物聚为一支,无脊椎动物聚为一支,克氏原螯虾E P 4与其他无脊椎动物的聚为一支,并与其中的凡纳滨对虾的亲缘关系最近(图4)。表1 克氏原螯虾与其他动物E P 4氨基酸序列的同源性比对 T a b.1 C o m p a r a t i v e i d e n t i t yo fa m i n oa c i ds e q u e n c eo fE P 4b e t w e e nP.c l a r k i ia n do t h e ra n i m a l s物种S p e c i e sG e n B a n k登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o.相似性%I d e n t i t y甲壳动物C r u s t a c e a n s 凡纳滨对虾L.v a n n a m e iX P_0 2 7 2 1 7 2 9 8.14 9.1鱼类F i s h e s 斑马鱼D.r e r i oNM_0 0 1 0 3 9 6 2 9.13 2.2 底鳉F u n d u l u sh e t e r o c l i t u sX P_0 1 2 7 2 9 0 3 4.13 2.0 大西洋鲑S a l m os a l a rA C N 1 1 2 4 3.13 1.9 香鱼P l e c o g l o s s u sa l t i v e l i sAMQ 3 4 8 9 8.13 0.5鸟类B i r d s 家鸡G a l l u sg a l l u sA BM 9 2 9 4 2.13 0.5哺乳动物M a mm a l s 猕猴M a c a c af a s c i c u l a r i sAA L 1 5 0 4 1.13 0.6 豚尾狒狒P a p i ou r s i n u sAA L 1 5 0 4 0.13 0.6 智人H.s a p i e n sAA I 1 3 5 2 4.13 0.1软体动物M o l l u s c s 真蛸O.v u l g a r i sQHX 4 1 5 5 4.13 2.1图2 预测的E P 4的亚细胞定位(a)和三维结构(b)F i g.2 T h ep r e d i c t e ds u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n(a)a n dt h r e e-d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e(b)o fE P 4图a中预测的E P 4定位部分以绿色进行突出显示.T h ep r e d i c t e dp o s i t i o n i n gp a r to fE P 4 i nf i g u r e(a)i sh i g h l i g h t e d i ng r e e n.885水 产 科 学第4 2卷图3 克氏原螯虾E P 4氨基酸序列与其他动物的比对F i g.3 A l i g n m e n t o fE P 4i nP.c l a r k i iw i t ht h o s eo f o t h e rk n o w na n i m a l s实线框内为7个跨膜-螺旋(TM 1TM 7);“”指示糖基化位点;“”指示形成二硫键的半胱氨酸残基;“*”指示配体结合残基;虚线框内为以精氨酸为中心的三联体.S e v e nt r a n s m e m b r a n e -h e l i x r e g i o n s(TM 1TM 7)a r eb o x e dw i t hs o l i d l i n e s;“”i n d i c a t e s g l y c o s y l a t i o ns i t e s;“”i n d i c a t e s c y s t e i n er e s i d u e s f o r m i n gd i s u l f i d eb o n d;“*”i n d i c a t e s l i g a n db i n d i n gr e s i d u e s;a na r g i n i n e-c e n t e r e dt r i p l e t i sb o x e dw i t ht h ed a s hl i n e s.985第4期江红霞等:克氏原螯虾前列腺素E2受体E P 4基因的序列特征及表达分析图4 基于E P 4氨基酸序列的邻接系统进化树F i g.4 N e i g h b o r-j o i n i n gp h y l o g e n e t i c t r e eb a s e do na m i n oa c i ds e q u e n c e s o fE P 4线的长度与遗传距离成正比,克氏原螯虾用“”表示.T h e l e n g t ho f t h ep h y l o g e n e t i c t r e e i d e n t i f i e dt h eg e n e t i cd i s t a n c e,a n dt h eE P 4o fP.c l a r k i iw a sm a r k e db y“”.2.3 P c E P 4基因的组织表达模式P c E P 4基因 在 成 体 克 氏 原 螯 虾 不 同 组 织 中的表达模式见图5。由图5可见,P c E P 4基因在所检测的1 0个组织中均有 表达,但在成 熟期卵巢中的相对表达量最高,其 次是脑,在鳃 中的表达量最低。P c E P 4基 因 在 成 熟 期 卵 巢 中 的 表 达量显著高于其他9种组织(P0.0 5)。图5 P c E P 4基因在成年克氏原螯虾各组织中的表达模式F i g.5 E x p r e s s i o np a t t e r no fP c E P 4g e n e i nd i f f e r e n t t i s s u e so f a d u l tP.c l a r k i i1.成熟期卵巢;2.肝胰腺;3.心脏;4.胃;5.肠道;6.脑;7.眼柄;8.肌肉;9.鳃;1 0.腹 神 经 索;不 同 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著(P0.0 5),下同.1.o v a r y;2.h e p a t o p a n c r e a s;3.h e a r t;4.s t o m a c h;5.i n t e s t i n e s;6.b r a i n;7.e y e s t a l k;8.m u s c l e;9.g i l l;1 0.v e n t r a ln e r v ec o r d;m e a n sw i t hd i f f e r e n tl o w e r c a s el e t t e r sa r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s(P 0.0 5),e t s e q u e n t i a.2.4 P c E P 4基因在不同发育阶段的卵巢中的表达模式P c E P 4基因表达量随着克氏原螯虾卵巢的发育呈现出先升后降的趋势(图6)。P c E P 4基因的表达量在期的卵巢中随着卵巢的发育逐渐升高,在期卵巢中达到最大值,然后在期卵巢中又下降。期卵巢中P c E P 4基因的表达量显著高于其他5个时期的卵巢(P0.0 5)。图6 P c E P 4基因在克氏原螯虾不同发育时期卵巢中的表达模式F i g.6 E x p r e s s i o np a t t e r no fP c E P 4g e n e i nd i f f e r e n t o v a r i a ns t a g e so fP.c l a r k i i2.5 P G E2注射对克氏原螯虾卵巢中P c E P 4基因表达和抱卵率的影响P G E2注射3 6h后,卵巢中的P c E P 4基因表达量与对照组相比极显著上升(P0.0 1),注射4 8、6 0h后,P c E P 4基因表达量与对照组相比显著上升(P0.0 5)(图7 a)。P G E2注射7 2h后,对照组有1 1.7%的虾抱卵,而注射组有4 0.0%的虾抱卵,P G E2注射组虾的抱卵率高于对照组(图7 b)。095水 产 科 学第4 2卷图7 P G E2对克氏原螯虾卵巢中P c E P 4基因表达(a)及抱卵率(b)的影响F i g.7 E f f e c t o fP G E2o nP c E P 4g e n e e x p r e s s i o n i no v a r y(a)a n dh o l d i n ge g gr a t e(b)o fP.c l a r k i i*表示与对照组相比差异极显著(P0.0 1),*表示与对照组相比差异显著(P0.0 5).*r e p r e s e n t e x t r e m e l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a t t h e l e v e l o fP0.0 1 f r o mc o n t r o l,*r e p r e s e n t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e a t t h e l e v e lo fP0.0 5f r o mc o n t r o l.3 讨 论虾蟹类作为我国重要的水产养殖甲壳动物,其性腺发育的调控机制越来越受到人们的重视。目前,在水产甲壳动物的规模化繁育中,人工摘除眼柄的方法由于其有效性和方便性而广泛应用,以促进雌性虾蟹的卵巢的同步发育、快速成熟并提高其抱卵量1 4-1 8。但眼柄摘除会使亲虾亲蟹失去性腺抑制激素的调控,进而使后期卵巢发育成熟和排卵的速度过快,导致卵黄积累不足,卵子质量降低,生产的虾蟹苗容易死亡。同时眼柄摘除手术对亲虾亲蟹的损伤较大,死亡率也较高1 9。因此,从基因水平上来寻找新的人工调控水产甲壳动物卵巢发育的方法已成为研究的重点。目前,有关克氏原螯虾卵巢发育和产卵的调控基因的研究已有一些报道2 0-2 2,但有关P G E2受体E P 4基因在该虾卵巢发育和产卵过程中的调控作用的研究迄今尚未见报道。笔者从克氏原螯虾卵巢转录组测序文库中得到克氏原螯虾E P 4(P c E P 4)基因的c D NA序列,包含有2 5 0 5b p的完整的开放阅读框,编码8 3 5个氨基酸。截至目前,甲壳类E P 4基因,仅凡纳滨对虾在美国国家生物技术信息中心数据库中登录有完整的编码序列,但尚无相关研究报道。3.1 P c E P 4基因序列特征前列腺素受体是细胞表面七重跨膜受体的亚家族,是G蛋白偶联受体。G蛋白偶联受体是膜内在蛋白,受体内包含7个-螺旋组成的跨膜结构域,这些结构域将受体分割为膜外N端、膜内C端、3个膜外环和3个膜内环。受体的膜外部分常带有糖基化修饰。膜外环上包含有2个高度保守的半胱氨酸残基,它们可以通过形成二硫键稳定受体的空间结构2 3-2 4。笔者将P c E P 4基因所编码的E P 4氨基酸序列与其他已知无脊椎动物的E P 4氨基酸序列进行多重比对后发现,这些动物E P 4的氨基酸序列均具有7个跨膜-螺旋、2个半胱氨酸残基形成的二硫键,以及N端的糖基化位点。这些结构特点符合G蛋白偶联受体的特征,说明P G E2与受体E P 4结合后激活G蛋白,从而启动不同的细胞内信号传导通路,引起生物体的各种生理反应。另外,在E P 4的TM 3中还有1个X-精氨酸-X的三联体。研究表明,在E P 4细胞质末端与G蛋白的相互作用中,三联体是重要参与者,与信号转导有关2 5。3.2 P c E P 4基因组织表达和不同时期卵巢中的表达P c E P 4基因组织表达模式分析发现,在雌性克氏原螯虾成虾的各组织中,P c E P 4基因在成熟期卵巢中的表达量显著高于其他9种组织,表明E P 4受体在克氏原螯虾的卵巢中起着重要的作用。P c E P 4基因在克氏原螯虾不同发育阶段的卵巢中的表达结果显示,该基因表达量在 期的卵巢中随着卵巢的发育逐渐升高,在期卵巢中达到最大值,然后在期卵巢中又下降,期卵巢中该基因的表达量显著高于其他时期的卵巢(P 0.0 5)。卵巢的整个发育周期中伴随着卵子的发生、发育、成熟和排出。在克氏原螯虾 期的卵巢发育中,其主要事件为卵原细胞分化为卵母细胞和卵母细胞的发育,在期卵巢中,卵母细胞已发育为成熟的卵子即将排出,而期则为卵子排空后的卵巢。据此推测E P 4受体可能在克氏原螯虾卵巢中卵子的发育成熟和排卵中起重要的作用。在克氏原螯虾卵巢发育的卵黄发生期间,高效液相色195第4期江红霞等:克氏原螯虾前列腺素E2受体E P 4基因的序列特征及表达分析谱法检测到其体内的P G E2持续增加2 6;斑节对虾的卵巢和血淋巴中的P G E2的含量也随着卵巢的发育而不断增加2 7。这与本研究中P c E P 4基因在克氏原螯虾 期的卵巢中表达量随卵巢的发育逐渐升高的规律一致。表明E P 4作为P G E2的受体,其在克氏原螯虾卵巢内的多寡是受P G E2含量影响的,P G E2含量越高,卵巢中所需要的E P 4受体也越多。3.3 P G E2对卵巢中P c E P 4基因表达和抱卵率的影响为进一步确定P G E2与E P 4之间的关系,笔者检测了P G E2注射后克氏原螯虾卵巢中P c E P 4基因表达和虾的抱卵率的变化,结果发现,P G E2注射后4 8、6 0h,P c E P 4基因表达量与对照组相比显著上升(P0.0 5),P G E2注射后7 2h,注射组虾的抱卵率也高于对照组。此结果进一步验证了克氏原螯虾卵巢内E P 4的多寡受P G E2含量的影响,P c E P 4基因表达水平与P G E2含量一致。另外研究表明,P G E2具有促进动物排卵的作用3,5,本试验中P G E2注射后7 2h虾的抱卵率提高的研究结果也证实了这一点。以上研究结果均表明,E P 4作为P G E2的受体,其在克氏原螯虾卵巢中含量和作用均与P G E2一致,且具有促进卵巢中卵子成熟和排卵的作用。4 结 论笔者通过转录组测序的方法从克氏原螯虾卵巢中得到了P c E P 4基因c D N A序列,包含2 5 0 5b p的开放阅读框,编码8 3 5个氨基酸,其编码的蛋白是1个典型的具有7个跨膜-螺旋结构的G蛋白偶联受体蛋白。在克氏原螯虾各组织中,卵巢中的P c E P 4基因表达量最高,并在不同发育阶段的卵巢中,期卵巢中的表达量最高。P G E2注射会促进克氏原螯虾卵巢中P c E P 4基 因 的 表 达 和 虾 的 排 卵。E P 4作 为P G E2的受体在卵巢中与P G E2一起具有促进克氏原螯虾卵子的成熟和排卵的重要作用。本试验结果可为克氏原螯虾卵巢发育的分子调控机制的深入研究提供基础的分子生物学资料。参考文献:1C AUGHE YGE,C L E L AN DLG,P E NG L I SPS,e ta l.R o l e so fc y c l o o x y g e n a s e(C O X)-1a n dC OX-2i np r o s t a n o i dp r o d u c t i o nb yh u m a ne n d o t h e l i a lc e l l s:s e-l e c t i v eu p-r e g u l a t i o no f p r o s t a c y c l i ns y n t h e s i sb yC O X-2J.J o u r n a l o f I mm u n o l o g y,2 0 0 1,1 6 7(5):2 8 3 1-2 8 3 8.2S T AN L E YD.P r o s t a g l a n d i n sa n do t h e re i c o s a n o i d s i ni n s e c t s:b i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eJ.A n n u a lR e v i e w o fE n t o m o l o g y,2 0 0 6,5 1:2 5-4 4.3T AHA R A D,YANOI.D e v e l o p m e n to fh e m o l y m p hp r o s t a g l a n d i n sa s s a ys y s t e m sa n dt h e i rc o n c e n t r a t i o nv a r i a t i o n sd u r i n go v a r i a n m a t u r a t i o ni nt h ek u r u m ap r a w n,P e n a e u sj a p o n i c u sJ.A q u a c u l t u r e,2 0 0 3,2 2 0(1/2/3/4):7 9 1-8 0 0.4M E U N P O LO,D U A N G J A IE,Y O O N P U NR,e t a l.D e-t e c t i o no f p r o s t a g l a n d i nE_2 i np o l y c h a e t eP e r i n e r e i ss p.a n di t s e f f e c t o nP e n a e u sm o n o d o no o c y t ed e v e l o p m e n ti nv i t r oJ.F i s h e r i e sS c i e n c e,2 0 1 0,7 6(2):2 8 1-2 8 6.5R E D D YPS,R E D D YPR,NAG A R A J UGPC.T h es y n t h e s i sa n de f f e c t so fp r o s t a g l a n d i n so nt h eo v a r yo ft h ec r a bO z i o t e l p h u s as e n e xs e n e xJ.G e n e r a la n dC o m p a r a t i v eE n d o c r i n o l o g y,2 0 0 4,1 3 5(1):3 5-4 1.6S U G I MO T OY,N AM B AT,S H I G E MO T OR,e t a l.D i s-t i n c t c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no fm R N A sf o rt h r e es u b t y p e so fp r o s t a g l a n d i nE r e c e p t o ri n k i d n e yJ.T h e A m e r i c a nJ o u r n a l o fP h y s i o l o g y,1 9 9 4,2 6 6(5P t 2):F 8 2 3-F 8 2 8.7K O N G E RRL,B I L L I N G SSD,T HOM P S O NAB,e t a l.I mm u n o l o c a l i z a