苦参素对2型糖尿病雄性大鼠生殖损伤及Nrf2_HO-1信号通路的影响.pdf

天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9苦参素对2型糖尿病雄性大鼠生殖损伤及Nrf2/HO-1信号通路的影响*杨芳1，马静芬1，郑聪聪1，韦志坤2（1.邯郸市中心医院，邯郸056008；2.邯郸市第一医院，邯郸056002）摘要：目的探讨苦参素（OMT）对2型糖尿病（T2DM）雄性大鼠生殖损伤及E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）信号通路的影响。方法采用高脂饮食结合腹腔注射链脲佐菌素的方法制备T2DM雄性大鼠模型，设正常（Normal）组、模型（Model）组、二甲双胍（Met）组和OMT低、中、高剂量组，每组8只。Met组每日1次灌胃给药200 mg/kg，OMT低、中、高剂量组分别每日1次灌胃给药25、50、100 mg/kg，Normal组和Model组每日1次灌胃给予生理盐水，疗程4周。检测空腹血糖（FBG）和血清睾酮（T）、促性腺激素释放激素（GnRH）、促黄体激素（LH）、卵泡刺激素（FSH）水平，测量睾丸质量和睾丸体积，苏木精-伊红（HE）染色法观察睾丸组织病理学改变，测量输精管直径（STD）和输精管上皮厚度（TSE），精液分析仪检测精子数量、精子存活率和精子活力，比色法检测睾丸组织抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性和丙二醇（MDA）含量，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）mRNA表达，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达。结果与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组FBG水平降低，血清T、GnRH、LH、FSH水平升高（P0.05）；睾丸质量和睾丸体积升高（P0.05）；睾丸组织病理学改变明显改善，STD和TSE升高（P0.05）；精子数量、精子存活率、（a+b）级活力精子升高（P0.05）；SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低（P0.05）；Nrf2、HO-1 mRNA表达量升高，Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达量升高（P0.05）。OMT低、中、高剂量组上述作用呈剂量依赖性（P0.05）。除FBG、GSH-Px外，OMT高剂量组对其他指标的影响优于Met组（P16.7 mmol/L即可判断造模成功。共造模成功42只大鼠，去除FBG水平最低的2只后，将剩余40只成模大鼠随机分为模型（Model）组、Met组和OMT低、中、高剂量组，每组8只。Met组每日1次灌胃给药200mg/kg10，OMT低、中、高剂量组分别每日1次灌胃给药25、50、100 mg/kg（参照人临床使用剂量，根据大鼠与人剂量换算公式计算，OMT低、中、高剂量组分别相当于人临床剂量的1/2倍、1倍、2倍），Normal组和Model组每日1次灌胃给予生理盐水，疗程4周。1.3.2FBG水平和血清T、GnRH、LH、FSH含量检测治疗完成后，禁食禁水12 h，经尾静脉取血并通过动物血糖仪（JPS-5型，北京怡成生物科技公司）检测FBG水平。麻醉后开腹、经腹主动脉取血5 mL，室温静置30 min后2 000 r/min离心（24D型台式离心机，深圳市赛泰克生物科技有限公司，离心半径10 cm）5 min取血清，遵照ELISA试剂盒说明，通过酶标仪（MB-530型，深圳汇松科技公司）检测血清T、GnRH、LH、FSH含量。1.3.3睾丸质量和睾丸体积测量取左侧睾丸，生理盐水冲洗并拭干后称其质量；测量睾丸上下径（L1）、前后径（L2）和左右径（L3），睾丸体积=L1L2L3/6。1.3.4HE染色法观察睾丸病理学改变及输精管直径（STD）和输精管上皮厚度（TSE）测量将测量后左侧睾丸置于10%中性甲醛溶液中固定48 h，脱水、石蜡埋机（TEC 5型组织包埋机，日本樱花公司）、4 m厚度连续切片（RM-2135型石蜡切片机，德国Leica公司）、展片、烤片、脱蜡处理后，按照试剂盒操作说明进行HE染色，在光学显微镜（CX41型，日本Olympus公司）下观察睾丸病理学改变。在显微镜下，应用目镜测微计测量STD和TSE，每只大鼠随机取15个输精管进行测量，取平均值。1.3.5精子数量、精子存活率和精子活力检测取大鼠右侧附睾，加入37 平衡盐溶液1 mL后剪碎，反复吹打使精子充分游离，取10 L上层液体加入37 平衡盐溶液稀释至1 mL，通过精液分析仪（AS-CASA型，俄罗斯ASL公司）检测精子数量和精子存活率。取1滴新鲜精液和2滴生理盐水置于37 载玻片上，在400倍光学显微镜（CX41型，日本Olympus公司）下选取200个以上精子进行精子活力分级，参照文献11报道的精子活力分级标准：沿直线快速前进为a级，沿直线或曲线缓慢前进为b级，摇尾但不向前移动为c级，不摇尾且不移动为d级。1.3.6睾丸组织抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性和MDA含量检测取右侧睾丸部分组织，加入9倍量（质量比）4 生理盐水后研磨匀浆，4、3 500 r/min离心（24D型台式离心机，深圳市赛泰克生物科技有限公司，离心半径10 cm）10 min取上清，采用比色1176天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9表 1引物序列Tab.1Primer sequence引物序列扩增长度（bp）Nrf2上游：5-AACACAAGAGCCCCTGTGTGGC-3112下游：5-TGCCCCTGAGATGGTGACAA-3HO-1上游：5-GGCCTCCCTGTACCACATCT-3177下游：5-CTGCATGGCTGGTGTGTAGG-3GAPDH上游：5-GGTTGTCTCCTGCGACT TCA-3103下游：5-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3表 2OMT 对 T2DM 雄性大鼠 FBG 和血清 T、GnRH、LH、FSH 水平的影响（xs）Tab.2Effects of OMT on FBG and the level of T，GnRH，LH，FSH in serum of male rats with T2DM（xs）组别动物数FBG（mmol/L）T（ng/mL）GnRH（pg/mL）LH（mIU/L）FSH（mIU/L）Normal组84.810.692.880.35134.5416.074.090.535.710.74Model组818.652.74*1.220.17*68.4010.38*2.370.26*2.950.38*Met组86.471.02#1.840.25#97.5312.46#3.010.30#4.170.61#OMT低剂量组814.192.36#1.490.20#80.2411.73#2.680.29#3.220.43OMT中剂量组810.721.84#2.120.26#101.6213.91#3.390.35#4.380.62#OMT高剂量组87.081.15#&2.460.31#&119.5717.04#&3.860.42#&5.500.78#&注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05。法，通过分光光度计（ND2000C型，美国Thermo公司）检测SOD、GSH-Px活性和MDA含量。1.3.7睾丸组织Nrf2、HO-1 mRNA表达检测取部分右侧睾丸组织，TRIzol法提取睾丸组织总RNA并逆转录成cDNA，以cDNA作为模板进行PCR（Quant Studio 5型PCR仪，美国ABI公司）扩增，扩增程序设置为：95 10 min行预变性；95 30 s、60 30 s，重复40个循环。以GAPDH为内参基因，运用公式2-Ct计算Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量。引物序列由北京擎科新业生物公司设计并合成，引物序列见表1。1.3.8睾丸组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达检测取100 mg右侧睾丸组织，加入1 mL 4 RIPA裂解液，组织剪碎后研磨匀浆，冰上静置30 min，4 12000 r/min离心（CR22N型高速低温离心机，日本Hitachi公司，离心半径8 cm）30 min取上清，BCA法测定总蛋白浓度，各组均以30 g总蛋白量上样行10%SDS-PAGE凝胶电泳（1659001型电泳仪，美国Bio-Rad公司）、半干法转至PVDF膜（Turbo型转膜仪，美国Bio-Rad公司）、5%蛋白封闭液37 封闭2 h，洗膜后加一抗稀释液Nrf2（11 000）、p-Nrf2（11 000）、HO-1（11 000）、-actin（12 000）4 孵育过夜，洗膜后加二抗IgG稀释液（12 000）37 孵育1.5 h，洗膜后ECL显影，通过化学发光成像分析仪（Image Quant LAS4000型，美国GE Healthcare公司）拍照，通过Image J软件分析蛋白条带灰度值。1.4统计学方法运用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料符合正态分布以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间多重比较行LSD-t检验（方差齐时）或DunnettT3检验（方差不齐时），P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1OMT对T2DM雄性大鼠FBG水平的影响与Normal组比较，Model组大鼠FBG水平明显升高（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组FBG水平明显降低（P0.05）；OMT低、中、高剂量组该作用呈现剂量依赖性（P0.05）。与Met组比较，OMT低、中剂量组FBG水平明显升高（P0.05）。见表2。2.2OMT对T2DM雄性大鼠血清T、GnRH、LH、FSH水平的影响与Normal组比较，Model组大鼠血清T、GnRH、LH、FSH水平明显降低（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组T、GnRH、LH水平明显升高，Met组和OMT中、高剂量组FSH水平明显升高（P0.05）；OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）。与Met组比较，OMT低剂量组T、GnRH、LH、FSH水平明显降低（P0.05）；OMT中剂量组T、LH水平明显升高（P0.05）；OMT高剂量组T、GnRH、LH、FSH水平明显升高（P0.05）。见表2。2.3OMT对T2DM雄性大鼠睾丸质量和睾丸体积的影响与Normal组比较，Model组大鼠睾丸质量1177天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9表 4OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸组织 STD、TSE 的影响（xs）Tab.4Effects of OMT on the STD and TSE of testiculartissue in male rats with T2DM（xs）注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05。组别动物数STD（m）TSE（m）Normal组8201.6412.7538.523.67Model组8145.26 8.69*27.432.24*Met组8168.4910.14#33.763.05#OMT低剂量组8157.33 9.85#30.292.36#OMT中剂量组8180.5111.13#34.083.19#OMT高剂量组8194.0713.28#&38.253.71#&表 3OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸质量和睾丸体积的影响（xs）Tab.3Effects of OMT on the mass and volume of testiculartissue in male rats with T2DM（xs）组别动物数睾丸质量（g）睾丸体积（cm）Normal组81.580.162.640.32Model组81.020.11*0.730.10*Met组81.290.15#1.500.22#OMT低剂量组81.160.12#1.290.18#OMT中剂量组81.340.15#1.710.24#OMT高剂量组81.550.17#&2.300.29#&注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05。和睾丸体积明显降低（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组睾丸质量和睾丸体积明显升高（P0.05）；OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）；OMT高剂量组睾丸质量和睾丸体积明显升高（P0.05）。见表3。2.4OMT对T2DM雄性大鼠睾丸组织病理学改变及STD、TSE的影响Normal组大鼠睾丸组织输精管排列整齐、结构完整，精子发生正常。Model组睾丸组织呈现输精管萎缩、管腔直径变窄、上皮厚度变薄，生精上皮结构紊乱，精原细胞退化、脱落、数量减少等病理学改变。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组睾丸组织病理学改变不同程度改善，OMT低、中、高剂量组改善效果呈现剂量依赖性，OMT高剂量组改善效果优于Met组。与Normal组比较，Model组大鼠睾丸组织STD、TSE明显降低（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组STD、TSE明显升高（P0.05），OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）。与Met组比较，OMT低剂量组STD、TSE明显降低（P0.05）；OMT中剂量组STD明显升高（P0.05）；OMT高剂量组STD、TSE明显升高（P0.05）。见图1、表4。2.5OMT对T2DM雄性大鼠精子数量、精子存活率和精子活力的影响与Normal组比较，Model组大鼠精子数量、精子存活率和（a+b）级活力精子明显降低（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组精子数量、精子存活率、（a+b）级活力精子明显升高（P0.05）；OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）。与Met组比较，OMT低剂量组精子数量明显降低（P0.05）；OMT中剂量组精子数量和精子存活率明显升高（P0.05），（a+b）级活力精子差异无统计学意义图 1OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸组织病理学改变的影响（HE 染色，400）Fig.1Effect of OMT on histopathological changes oftesticular tissue in male rats with T2DM（HE staining，400）Model组Normal组OMT高剂量组OMT低剂量组OMT中剂量组Met组1178天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9表 5OMT 对 T2DM 雄性大鼠精子数量、精子存活率和精子活力的影响（xs）Tab.5Effects of OMT on sperm count，sperm survival rate and sperm motility in male rats with T2DM（xs）组别动物数精子浓度（106个/mL）精子存活率（%）精子活力（%）a级b级c级d级（a+b）级Normal组867.926.5780.868.4564.174.9328.052.324.360.253.420.2192.225.80Model组813.012.24*41.733.93*51.264.87*21.181.64*13.480.95*14.031.07*72.494.63*Met组839.504.63#49.854.71#58.745.10#24.822.09#8.730.65#7.710.62#83.564.91#OMT低剂量组827.243.18#50.645.28#54.084.9525.062.33#8.240.70#13.221.1478.544.86#OMT中剂量组847.015.29#59.175.54#59.575.03#25.462.41#6.590.52#8.380.70#85.035.27#OMT高剂量组861.486.52#&71.086.46#&63.825.17#27.402.85#5.260.49#&3.520.29#&91.225.45#&注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05）；OMT高剂量组精子数量、精子存活率和（a+b）级活力精子明显升高（P0.05）。见表5。2.6OMT对T2DM雄性大鼠睾丸组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响与Normal组比较，Model组大鼠睾丸组织SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA含量明显升高（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组SOD、GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显降低（P0.05）；OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）。与Met组比较，OMT低剂量组GSH-Px活性明显降低、MDA含量明显升高（P0.05）；OMT中剂量组SOD活性明显升高（P0.05）；OMT高剂量组SOD活性明显升高、MDA含量明显降低（P0.05）。见表6。2.7OMT对T2DM雄性大鼠睾丸组织Nrf2、HO-1mRNA表达的影响与Normal组比较，Model组大鼠睾丸组织Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显降低（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显升高（P0.05）；OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）。与Met组比较，OMT低剂量组Nrf2、HO-1mRNA表达量明显降低（P0.05）；OMT高剂量组Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显升高（P0.05）。见表7。2.8OMT对T2DM雄性大鼠睾丸组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达的影响与Normal组比较，Model组大鼠睾丸组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1表达量明显降低（P0.05）。与Model组比较，Met组和OMT低、中、高剂量组Nrf2、p-Nrf2、HO-1表达量明显升高（P0.05）；OMT低、中、高剂量组上述作用呈现剂量依赖性（P0.05）；OMT中、高剂量组Nrf2、p-Nrf2、HO-1表达量明显升高（P0.05）。见图2、表8。3讨论糖尿病患者生殖损伤发病率是非糖尿病患者的510倍，男性发病率高于女性12。随着国家鼓励生育政策相继出台，民众生育欲望升高，糖尿病所致男性生殖损伤甚至不育成为亟待解决的健康问题。睾丸是男性生殖系统主要器官，是T分泌和精子生成的场所，其生理功能受下丘脑-垂体-性腺轴调控。糖尿病可引发多器官并发症，持续高血糖可导致睾丸萎缩、T分泌减少、精子质量降低，最终导致男性生殖功能受损甚至不育13。糖尿病患者中超过90%为T2DM，而T2DM男性患者普遍存在生殖损伤。本研究采用高脂饮食结合注射STZ损伤胰岛细胞的方法构建T2DM雄性大鼠模型，该方法操作简便、成功率高、重复性好，并且成模过程与人类T2DM发病机制及病理特点相似，是国内外普遍认可的T2DM动物模型制备方法14。结果显示，与正常组比较，T2DM雄性大鼠FBG水平明显升高，血清T、GnRH、LH、FSH含量水平明显降低，睾丸质量和睾丸体积明显降低，睾丸组织呈现输精管萎缩、生精上皮结构紊乱、精原细胞退化、脱落、数量减少等病理学改变，STD和TSE均明显降低，与Sudirman等10，15报道一致；精子数量、精子存活率、（a+b）级活力精子明显降低，与Heidari等16报道一致；说明T2DM雄性模型大鼠睾丸组织出现明显的结构和功1179天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9表 6OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸组织 SOD、GSH-Px活性和 MDA 含量的影响（xs）Tab.6Effects of OMT on the activity of SOD，GSH-Px andthe content of MDA of testicular tissue in male ratswith T2DM（xs）组别动物数SOD（U/mg pro）GSH-Px（U/mg pro）MDA（nmol/mg pro）Normal组856.157.31179.6324.5020.082.73Model组829.043.86*76.4211.37*38.495.50*Met组839.155.02#153.8023.15#25.043.19#OMT低剂量组837.474.68#106.5218.36#31.523.74#OMT中剂量组846.086.15#137.8420.72#25.793.26#OMT高剂量组854.737.58#&168.1125.03#&22.362.91#&注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05。组别动物数Nrf2/GAPDHHO-1/GAPDHNormal组81.350.231.620.29Model组80.260.05*0.380.07*Met组80.880.17#0.970.18#OMT低剂量组80.570.11#0.640.12#OMT中剂量组80.840.16#1.030.20#OMT高剂量组81.160.21#&1.410.24#&表 7OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸组织 Nrf2、HO-1mRNA 表达的影响（xs）Tab.7Effects of OMT on the mRNA expression of Nrf2and HO-1 of testicular tissue in male rats with T2DM（xs）注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05。表 8OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸组织 Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响（xs）Tab.8Effects of OMT on the protein expression of Nrf2，p-Nrf2，HO-1oftesticulartissueinmaleratswithT2DM（xs）组别Nrf2/-actinp-Nrf2/-actinHO-1/-actinNormal组0.980.180.480.070.450.10Model组0.160.03*0.110.02*0.080.02*Met组0.310.06#0.180.03#0.200.04#OMT低剂量组0.210.04#0.140.03#0.180.03#OMT中剂量组0.400.08#0.240.05#0.280.06#OMT高剂量组0.580.12#&0.370.06#&0.390.07#&注：与Normal组比较，*P0.05；与Model组比较，#P0.05；与Met组比较，P0.05；与OMT低剂量组比较，P0.05；与OMT中剂量组比较，&P0.05。图 2OMT 对 T2DM 雄性大鼠睾丸组织 Nrf2、p-Nrf2、HO-1 蛋白表达的影响Fig.2Effects of OMT on the protein expression of Nrf2，p-Nrf2，HO-1 of testicular tissue in male rats with T2DM能损伤，下丘脑-垂体-性腺轴功能受损。OMT能够剂量依赖性降低T2DM雄性大鼠FBG水平，提高血清T、GnRH、LH、FSH含量水平，减轻睾丸萎缩和睾丸组织病变，提高精子质量，并且OMT高剂量组对除FBG外其他指标的作用均优于Met组，提示OMT对T2DM雄性大鼠生殖损伤及下丘脑-垂体-性腺轴功能具有保护作用。氧化应激是糖尿病所致生殖损伤等发生发展的重要机制。高血糖引发线粒体过度生成ROS，致使SOD、GSH-Px等内源性抗氧化酶被过度消耗，破坏“ROS生成-还原清除”平衡，ROS蓄积而攻击生物膜脂质双分子层结构并生成具有生物毒性的MDA，并且ROS可破坏蛋白质、DNA等生物大分子结构，造成氧化应激损伤17。Nrf2是一种核转录因子，在机体抗氧化系统中发挥着重要作用。正常状态下存在于细胞质的Nrf2通过Neh2结构域与其抑制剂Keap-1结合而无生理活性18。ROS可诱导Nrf2磷酸化并促使“Nrf2-Keap-1”复合体解离，p-Nrf2核转位后能够诱导SOD、GSH-Px等抗氧化酶转录与表达，提高ROS还原清除能力，降低氧化应激损伤19。Nrf2下游靶蛋白HO-1为血红素降解限速酶，可促使血红素降解生成胆绿素IX、CO、Fe2+等内源性抗氧化剂20-21。本研究发现，OMT能够剂量依赖性提高T2DM雄性大鼠睾丸组织SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，提高Nrf2、HO-1 mRNA表达和Nrf2、p-Nrf2、HO-1蛋白表达，并且OMT高剂量组对除GSH-Px外其他指标的作用均优于Met组，提示OMT对T2DM雄性大鼠睾丸组织氧化应激损伤具有保护作用，可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。综上所述，OMT对T2DM雄性大鼠生殖损伤具有保护作用，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路，抑制氧化应激，改善下丘脑-垂体-性腺轴功能有关。本研究为OMT用于防治T2DM男性生殖损伤提供了理论依据。氧化应激也是T2DM雌性大鼠1180天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9生殖损伤的重要机制22-23，因此OMT可能对T2DM雌性大鼠生殖损伤也具有保护作用，但尚需进行实验验证。参考文献：1SUN H，SAEEDI P，KARURANGA S，et al.IDF Diabetes Atlas：global，regional 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