辽宁部分地区猪圆环病毒3型cap蛋白的测序和遗传进化分析.pdf

收稿日期:作者简介:牛知音()女 高级农艺师 :通讯作者:龚商羽()女 硕士 高级农艺师 从事基础病理学研究 :辽宁部分地区猪圆环病毒 型 蛋白的测序和遗传进化分析牛知音 姜 卓 龚商羽(锦州市农业农村综合服务中心(锦州市植物保护中心)辽宁 锦州 大连市金普新区动物疫病预防控制中心 辽宁 大连 锦州市动物疫病预防控制中心(锦州市动物卫生监督中心)辽宁 锦州)中图分类号:文献标志码:文章编号:()摘 要:为了解辽宁地区猪圆环病毒 型 基因序列的遗传变异情况 以辽宁地区从检测为 阳性的 份病料中 选择 份阳性样品进行 基因扩增和序列测定 经过扩增和测序比对 共获得了 条 基因序列 条 完整 基因全长 没有发生碱基的缺失或插入 株 核苷酸序列的同源性为 和 为一个分支 作为一个独立分支 与参考序列相比 三者之间亲缘关系更加相近 说明近几年辽宁地区 毒株存在一种新的进化方向关键词:猪圆环病毒 型 基因序列 遗传进化分析 最近发现的猪圆环病毒 型()与其他三种猪圆环病毒、和 一起属于圆环病毒科的圆环病毒属 据报道 可以感染猪、野猪和其他几种中间宿主导致受影响动物的单个或多个感染 感染可导致呼吸系统疾病、消化系统疾病、生殖系统疾病、多系统炎症和免疫反应 到目前为止 感染 以及由 引起的疾病已经在世界范围内的许多养猪场中被报道 并且阳性率很高 这表明该病毒可能是养猪业中的另一种重要病原体 因此 了解辽宁地区猪 遗传变异情况 为辽宁地区 的疫苗研究、免疫防控提供参考 材料与方法 材料 年 月至 年 月 从辽宁省部分地区采集具有腹泻、呼吸或繁殖障碍等临床症状的仔猪、母猪或死胎中收集了 份组织标本 包括淋巴结 脾脏 肾脏和肺脏 所有样品均送至昌图县现代农业发展服务中心实验室进行病原检测 主要试剂配方 琼脂糖凝胶电泳用溶液 电泳缓冲 液:分 别 称 量 碱 冰 乙 酸 蒸 馏 水 定 容 至 常温避光保存 (上海唯地生物)感受态细胞制备及转化所需液体 /氯化钙溶液:取 的无水 用蒸馏水定容至 再用浓 调节 后 高压灭菌氨苄青霉素()贮存液(/):第 期 养猪 灭菌去离子水完全溶解 粉剂无菌处理后 条件下储存 培 养 基:分 别 称 量 的 的 和 的 溶于 的去离子水中 用 /的 调节 定容到 高压灭菌 条件下保存备用/培养基(/):按 比例向高压后的液体 培养基中加入 贮存液 混匀后 保存 荧光 检测 样品 前 处 理 每 份 组 织 样 品 剪 取 放入 圆底离心管中 每个离心管中加入 直径钢珠一个 放入 组织匀浆机中 将研磨好的组织匀浆反复冻融 次 /离心 收集上清液装入 离心管中 保存备用 病毒 提取 使用磁珠法病毒/提 取 试 剂 盒 提 取 组 织 样 品 中 的/操作按照试剂盒说明书进行 提取的 或 用封口膜封好并保存于 或 荧光 检测用 的实时荧光 检测试剂盒(上海之江)检测 病毒 此外 其他病原体包括猪瘟病毒()、猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒()、伪狂犬病毒()、猪细小病毒()、猪流行性腹泻病毒()、传染性胃肠炎病毒()使用商业化的荧光定量聚合酶链反应()检测试剂盒或逆转录()检测试剂盒(世纪元亨)检测 基因序列分析 全基因引物设计与合成基于 中已发布的 分离株基因组进行多序列比对 用 与 软件设计了 对 引 物 引 物 ()、()用于扩增 完整的 基因组序列 引物由上海生工合成 合成的引物室温 转离心 后 用 溶解为 /使用液备用 样品总 提取对样品重新进行总 提取 进行 检测 目的基因序列扩增以 步骤中提取的总 为模板 使用全基因序列引物分别进行 扩增 扩增反应 体系如下:模板 上游引物 下游引物 扩增反应程序如下:预反应 个循环 延伸 全基因序列 产物纯化回收操作步骤参照 柱式 胶回收试剂盒()(上海生工)目的基因与克隆载体连接将 中回收纯化后的 产物分别与 载体()连接 建立的连接体系()如下:连接反应体系:连接 前天 点到第二天 点 连接产物转化 感受态细胞(上海唯地生物)置于冰上 完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮 加入 连接液 轻轻混匀 冰上放置 水浴热激 冰上放置 加 培养基 振荡培养 小时室温下 离心 分钟 用枪头吸掉 上清液 用剩余的培养基将细胞悬浮将细菌涂布在预先用 和 /涂布的含有氨苄抗生素的平板上 倒置培养过夜 对菌液进行 检测:将 检测为阳性的菌液送往测序公司进行序列测定养猪 ()基因序列分析将测序结果在 网站上进行 比对 确定基因序列为正确序列后 将序列与从 数据库中下 载 的 参 考 序 列 进 行 序 列 分 析 使 用 程序中的最大似然法(次重复)构建 基因序列的系统进化树 使用 中的 进行同源性分析 结果与分析 混合感染情况对 混合感染情况进行统计分析 发现 与其他病原体存在 种病感染和 种病原混合感染 与、和 的两种病原混合感染率分别为 (/)、(/)、(/)、(/)、(/)和 (/)种病原混合感染中、和 的合并感染率较高 为 (/)样本中 的单病原感染率为 (/)以上结果进一步显示了 对生猪养殖业的潜在威胁(表)表 不同临床症状中不同病原混合感染情况病原呼吸腹泻繁殖障碍其他检测样品数/()/()/()/()/()/()/()/()/()/()/()/()基因序列分析从检测为 阳性的病料中 选择部分材料进行 基因扩增和序列测定 经过扩增和测序比对 共获得了 条 基因序列 从 下载了 条具有代表性的国内外的 基因组序列 借助 软件中的最大似然法(次重复引导)构建遗传进化树(图)基因序列的比对结果显示 本试验获得的 条 完整 基因全长 没有发生碱基的缺失或插入 和 为一个分支 作为一个独立分支 他们三者之间亲缘关系很近 说明近年辽宁地区 毒株存在一种新的进化方向 基因同源性分析对 株 分离株及 条下载的参考毒株用 软件中的 软件进行同源性分析(图)发现 株 核苷酸序列的同源性为 与 下载的 个参考毒株的核苷酸同源性为 、序列与参考序列 的同源性最低()、序列与 序列的同源性最高()的比对结果较 来说同源性更高 说明变异程度较低 更加保守 小结与展望 感染可能与生殖障碍、呼吸系统疾病和多器官炎症密切相关 与对养猪业造成巨大危害的 相似 感染发生在猪和野猪以及众多中间宿主中 导致水平和垂直传播值得注意的是据报道该病毒可以感染经 第 期 牛知音 等.辽宁部分地区猪圆环病毒 型 蛋白的测序和遗传进化分析图 全基因序列进化树、表示本实验获得的毒株图 基因序列同源性比较产母猪和活产仔猪 表现出明显的临床症状或亚临床症状 表明该病毒对养猪业也有潜在的危害 因此 我们应该继续密切监测 的流行和与其他猪病原体的混合感染 以及疾病表现的共同因素 应持续跟踪 优势毒株的遗传多样性和分子流行病学的动态变化 此外 最近有研究证明了使用原代猪肾细胞成功分离 然而 有限的病毒培养细胞限制了病毒的体外繁殖和研究 因此 通过反向遗传学可能为研究 的致病机制和防控该疾病提供有用的信息(编辑:杨文超)养猪 ()