苦荞糖基转移酶基因FtUGT143的克隆及表达分析.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):204-212收稿日期：2023-02-08基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK2021重点 035），国家自然科学基金项目（31701494，32260461），国家燕麦荞麦现代农业产业技术体系专项资金（CARS-07-A5）作者简介：王佳蕊，女，硕士研究生，研究方向：荞麦分子生物学；E-mail:通讯作者：李洪有，男，博士，教授，研究方向：荞麦分子育种；E-mail:苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析王佳蕊1，2 孙培媛1，2 柯瑾1，2 冉彬1，2 李洪有1（1.贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵阳 550001；2.贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550025）摘 要：苦荞Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn富含类黄酮 C-糖苷，具有抗氧化、抗癌和消炎等多种保健作用。通过RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）技术从苦荞中克隆得到了一个糖基转移酶基因，命名为 FtUGT143，对其进行生物信息学、分子对接、基因表达、基因表达量与代谢物含量相关性等分析。结果表明，FtUGT143 全长 CDS 序列为 678 bp，编码 226 个氨基酸。密码子偏好分析结果显示，FtUGT143 具有双子叶植物的密码子使用偏好性。多序列比对和进化树分析表明，FtUGT143是植物糖基转移酶基因家族中的C-糖基转移酶亚家族成员。分子对接结果表明，FtUGT143能与合成黄酮C-糖苷（牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素）的底物芹菜素和木犀草素相互作用。RT-qPCR 结果显示，FtUGT143 基因在苦荞的各个组织部位中均有表达，但在芽苗期的根、茎、叶中显著表达，且其在不同组织部位的表达量与 4 种黄酮 C-糖苷积累量具有较好的相关性。研究结果表明 FtUGT143 是 C-糖基转移酶，它可能参与苦荞中黄酮 C-糖苷生物合成，对于揭示苦荞中黄酮 C-糖苷的合成机制具有重要意义。关键词：苦荞；C-糖基转移酶；黄酮 C-糖苷；基因克隆；分子对接；FtUGT143；表达分析DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0098Cloning and Expression Analyses of C-glycosyltransferase Gene FtUGT143 in Fagopyrum tataricumWANG Jia-rui1,2 SUN Pei-yuan1,2 KE Jin1,2 RAN Bin1,2 LI Hong-you1（1.Research Center of Buckwheat Industry Technology,Guizhou Normal University,Guiyang 550001;2.School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550025）Abstract:Tartary buckwheatFagopyrum tataricum（L.）Gaertnis rich in flavonoid C-glycosides,and it has many health effects,such as anti-oxidation,anti-cancer and anti-inflammation.In this study,in order to explore the flavonoid C-glycosyltransferase gene in tartary buckwheat,a glycosyltransferase gene named FtUGT143 was cloned from tartary buckwheat by RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）,and its bioinformatics,molecular docking,gene expression,correlation between gene expression and metabolites content were also analyzed.The results showed that the full-length CDS sequence of FtUGT143 was 678 bp,encoding a protein of 226 amino acids.The codon preference analysis indicated that FtUGT143 had the codon usage preference of dicotyledons.Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis suggested that FtUGT143 belonged to the carbon glycosyltransferase subfamily of plant glycosyltransferase gene family.The molecular docking analysis implied that FtUGT143 interacted with apigenin and luteolin,which were the substrates of flavonoid C-glycosides（vitexin,isovitexin,orientin and isoorientin）.RT-qPCR results showed that FtUGT143 gene was expressed in all tissues of tartary buckwheat,but it was significantly expressed in the roots,stems and leaves at seedling stage,and its expression in different tissues had a good correlation with the accumulation of four flavonoid glycosides.The research results showed that FtUGT143 is a C-glycosyltransferase which may participate in the biosynthesis of flavonoid C-glycosides,revealing the important role of FtUGT143 in the synthesis mechanism of flavonoid C-glycosides in tartary buckwheat.Key words:tartary buckwheat;C-glycosyltransferase;flavonoid C-glycosides;gene cloning;molecular docking;FtUGT143;expression analyses2023,39(8)205王佳蕊等：苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析类黄酮化合物是一类广泛存在于植物中的次生代谢物，在植物生长发育、生物与非生物胁迫抵抗中起着至关重要的作用1-2。此外，类黄酮化合物还具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多种保健功能3-4。根据化学结构差异，将类黄酮化合物分为黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇和花青素六大类5。在植物中，大多数类黄酮化合物以糖苷类化合物形式存在。通常，植物中类黄酮化合物的糖基化由糖基转移酶催化完成，糖基化的位置主要发生在 3-O位或 7-O 位，少部分也发生在 5-O 位和 4-O 位。此外，还有少部分类黄酮化合物直接在苯环上的 6-C位或 8-C 位发生糖基化，这类化合物称为类黄酮 C-糖苷5。目前，植物中已报道的类黄酮 C-糖苷主要有牡荆素（芹菜素-8-C-葡萄糖苷）、异牡荆素（芹菜素-6-C-葡萄糖苷）、荭草素（木犀草素-8-C-葡萄糖苷）、异荭草素（木犀草素-6-C-葡萄糖苷）等6。它们在植物中具有较强的生物活性，不易水解，对植物生长和发育、非生物和生物胁迫的响应以及环境防御等发挥的作用7。在植物中，类黄酮 C-糖苷的生物合成主要是在 C-糖基转移酶的催化作用下，直接将糖基供体转移到底物黄酮的苯环骨架的 C 上。目前，在植物中已有多个 C-糖基转移酶被鉴定6。He 等8在金莲花（Trollius chinensis Bunge）中鉴定到的 C-糖基转移酶 TcCGT1，可以特异性地催化黄酮类、黄酮醇等黄酮类化合物的 8-C 糖基化黄酮类化合物。Wang 等9在大豆（Glycine max（Linn）Merr.）毛状根中过表达葛根（Pueraria montana var.lobata）的 PIUGT43，发现其编码蛋白酶具有将大豆苷元催化为葛根素的活性，且对异黄酮具有底物专 一 性。Mashima 等10将 山 葵（Wasabia japonica（Miq.）Matsum.）的 WjGT1 在大肠杆菌中重组表达发现，该酶可将芹菜素或木犀草素催化合成异牡荆苷或异荭草苷。Brazier-Hicks 等11发现水稻（Oryza sativa L.）OsCGT 可通过与脱水酶协同作用催化 2-羟基黄酮合成黄酮 C-糖苷。在甜荞（Fagopyrum esculentum moench）的研究中发现，糖基转移酶FeCGTa 和 FeCGTb 均以 2-OH 黄烷酮为底物催化生成黄酮 C-糖苷12。苦荞（Fagopyrum tataricum Gaertn）属于蓼科荞麦属，是起源于我国西南地区的一年生小杂粮作物，含有丰富的高活性类黄酮化合物（1.0%-3.0%），具有较高的保健作用3-4。目前，在苦荞种子中已鉴定到 90 余种类黄酮化合物，其中一半以上为黄酮糖苷类化合物，包括类黄酮 C-糖苷中的牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素等3。在苦荞中，目前已有多个糖基转移酶被功能鉴定催化了黄酮糖苷的合成13-17，但未见参与类黄酮 C-糖苷生物合成的C-糖苷糖基转移酶基因的相关报道。课题组前期对苦荞糖基转移酶基因家族进行系统鉴定，通过系统进化分析发现候选基因与已鉴定功能的 C-糖基转移酶聚在一支（数据未发表）。本研究利用 RT-PCR 技术，从苦荞品种品苦 1 号中克隆一个可能参与苦荞类黄酮 C-糖苷生物合成的 C-糖基转移酶基因FtUGT143，并对其进行生物信息学、系统进化、分子对接、基因表达、基因表达量与类黄酮 C-糖苷含量关系分析，以期为苦荞类黄酮 C-糖苷生物合成中的功能研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料 苦荞品种品苦 1 号，由山西农业大学提供。1.1.2 载体 pMD19-T，购自大连宝日医生物公司。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5 由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 RNA 提取 RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒提取 品苦 1 号 芽苗期的根、茎、叶，6 叶期植株的根、茎、叶，成年期植株的花、种子的总 RNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。1.2.2 cDNA（complementary DNA）获取 以叶片的 总 RNA 为 模 板，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒进行反转录，用于基因全长 CDS 序列克隆的第一链 cDNA。根据 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书，分别以品苦 1 号芽苗期的根、茎、叶，6 叶期植株的根、茎、叶，成年植株的花、种子的总 RNA 为模板，合生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8206成用于荧光定量的第一链 cDNA。1.2.3 FtUGT143 全长 CDS 的克隆 根据已知苦荞基因组数据中注释的 FtUGT143 的核酸序列，BioXM 2.7 和 DNMAN 软件设计扩增目的基因片段全长的CDS 序列的特异性引物 FtUGT143-F 和 FtUGT143-R（表 1），以 1.2.2 中叶 cDNA 为模板，高保真 KOD酶进行 PCR 扩增。PCR 产物加 A 尾反应后，经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收、连接目的产物、连接 pMD19-T 载体、转化大肠杆菌感受态 DH5。PCR 检测阳性菌株后，送至上海生工生物工程股份表 1 本研究中所用引物序列Table 1 List of primerssequences in this study引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence（5-3）用途 UseFtUGT143-FATGGACTGGATGGATGAGATGCTA基因克隆 Gene cloningFtUGT143-RCTGTCAAATTTCGACACTGTCAAG基因克隆 Gene cloningqFtUGT143-FTAAGGAGATGGCTGAAGCTG荧光定量 Fluorescent quantificationqFtUGT143-RCACCGAACTTGGATATCCGA荧光定量 Fluorescent quantificationqFtUPL7-FTTCACGGGCACCATTACTGG荧光定量内参 Fluorescent quantification of internal reference primersqFtUPL7-RAGGTGGAAGCTGAAGGAAGC荧光定量内参 Fluorescent quantification of internal reference primers有限公司测序。1.2.4 FtUGT143 的生物信息学分析 CodonW 1.4.2对 FtUGT143 基因密码子偏好性参数分析；BioXM 2.7查询其最大开放阅读框（open reading frame,ORF），预测其编码的蛋白序列及编码蛋白的等电点和分子量大小；NCBI 中的 BLAST 比对查找 FtUGT143 蛋白的同源蛋白，DNAMAN 进行蛋白序列多序列比对；MEGA 7.0 软件采用 NJ 法构建 FtUGT143 与其他已知的植物黄酮糖基转移酶基因构建系统进化树；AutoDock Vina 1.1.2 对 FtUGT143 与 4 种类黄酮代谢小分子进行分子对接模拟实验，Pymol 2.4.0 可视化分析对接结果。1.2.5 FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达分析 BioXM 2.7 软件和 DNAMAN 软件分析设计FtUGT143 的实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR）引 物 qFtUGT143-F 和 qFtUGT143-R，设计内参基因 FtUPL7 的荧光定量引物 qFtUPL7-F 和qFtUPL7-R（表 1），以 1.2.1 中品苦 1 号芽苗期的根、茎、叶，6 叶期植株的根、茎、叶，成年植株的花、种子的总 RNA 为模板，苦荞的 FtUPL7 作为内参基因，SYBR Premix Ex TaqTM II 试剂盒进行荧光定量分析，伯乐 bio-rad 实时定量 PCR 仪 CFX96扩增，每个样本设置3个生物学重复和3个技术重复。2-Ct法计算基因的相对表达情况。具体操作参照Li 等18的方法进行。参照王璐瑗等19方法提取和测定各组织部位中总黄酮含量。GraphPad Prism 9.0分析 FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间相关性。2 结果2.1 FtUGT143全长CDS的克隆及其编码蛋白特征分析以品苦 1 号叶片 cDNA 为模板，基因特异性引物 FtUGT143-F 和 FtUGT143-R 扩增出一条约 700 bp 的目的条带（图 1）。目的条带经测序比对，发现其与参照序列完全一致，CDS 全长为678 bp，编码 226 个氨基酸。Protparam 在线软件对FtUGT143 进行分析，结果显示，相对分子质量为25.16 kD，理论等电点为 4.76，是稳定的疏水蛋白。M：DNA maker 2000；1：FtUGT143 的扩增片段M:DNA maker 2000.1:Amplified fragment of FtUGT143图 1 苦荞 FtUGT143 基因全长 CDS 克隆Fig.1 Full-length CDS clone of the FtUGT143 gene of buckwheat（Fagopyrum tataricum）2023,39(8)207王佳蕊等：苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析2.2 FtUGT143的生物信息学分析2.2.1 FtUGT143 的密码子偏好分析 Codon W 分析FtUGT143 基因序列的密码子偏好性，其序列的有效密码子数（ENC 值：范围 20-61）为 51.17，表明FtUGT143 的密码子偏好性较弱；密码子适应指数（CAI 值：范围 0-1）为 0.157 4，进一步表明该基因的密码子偏好性较弱。FtUGT143 的 GC 与 GC3s 含量均小于50%，该ORF序列中GC含量小于AT含量，说明苦荞的糖基转移酶基因在编码时偏好使用 A 或T 结尾的密码子。对 FtUGT143 密码子 RSCU 值分析（图 2），其中有 26 个密码子的 RSCU 值大于 1，是FtUGT143 的偏好密码子；有 13 个密码子的 RSCU值大于 1.5，为高频率密码子；而 AGA 和 CCG 的RSCU 值最大（2.67），表明 FtUGT143 基因对 AGA0246AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIleLeuLysMetPheProSerThrTrpTyrValRSCUUUUUUCUCUUCCUCAUCGAGUUUAUUGCUUCUCCUACUGCCACCGUAUUGUUGCUGGCAUCACCAACAGCGAAGAAGGAUUAUCAUAAUGACCACAACGAAUAACAAAAAGGUUGUCGUAGUGGCUGCCGCAGCGGAUGACGAAGAGGGUGGCGGAGGG横坐标下方的图例分别对应上方该密码子的 RSCU 值（反映密码子实际出现次数与预期出现次数的比例关系）The legend below the abscissa axis corresponds to the RSCU value of the codon above（reflecting the proportional relationship between the actual occurrence times of the codon and the expected occurrence times）图 2 FtUGT143 密码子 RSCU 值分析Fig.2 Analysis of FtUGT143 codons RSCU values和 CCG 具有极强的偏好性。2.2.2 FtUGT143 同源蛋白的多序列比对系统进化分析 FtUGT143 蛋白序列在 NCBI 数据库进行BLASTp 比对搜寻发现，FtUGT143 与多种植物的糖基转移酶序列有较高的同源性。蛋白多序列比对发现，FtUGT143 的蛋白序列在 C-末端结构域附近存在一个由 44 个氨基酸组成的 PSPG box（图3-A）。该 PSPG box 中包含高度保守的氨基酸序列HCGWNS（图 3-B），与前期研究的结论一致。PSPG box 区域第 44 个氨基酸是谷氨酰胺（Gln,Q），推测FtUGT143 可能偏好以 UDP-葡萄糖作为糖供体，具体情况还需要进一步研究。根据文献和 NCBI 数据库，获得多种植物已鉴定功能的糖基转移酶，用MEGA7.0 软件构建 NJ 系统进化树。结果（图 4）显示，FtUGT143 和催化黄酮化合物 C 位糖基化的糖基转移酶聚在同一分支上且与金莲花 TcCGT1 亲缘关系最近。2.2.3 FtUGT143 蛋 白 与 底 物 分 子 对 接 SWISS-MODEL 对 FtUGT143 进行同源建模并使用 AutoDock Vina 1.1.2 对 FtUGT143 与山奈酚、表儿茶素、木犀草素、芹菜素（其中芹菜素和木犀草素是苦荞中主要黄酮 C-糖苷的合成底物）进行分子对接分析，结果（表 2）表明，FtUGT143 的最适底物受体为木犀草素，其次是芹菜素。将 FtUGT143 的对接结果导生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8208入 Pymol 中进行可视化分析（图 5）。FtUGT143 与底物木犀草素通过传统氢键与氨基酸残基（Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln123）相互作用；FtUGT143 与底物芹菜素通过OsCGTZmCGTFeCGTaFeCGTbAtUGT89C1At5GlcTFaGT1CaUGT3FtUGT143OsCGTZmCGTFeCGTaFeCGTbAtUGT89C1At5GlcTFaGT1CaUGT3FtUGT143OsCGTZmCGTFeCGTaFeCGTbAtUGT89C1At5GlcTFaGT1CaUGT3FtUGT143OsCGTZmCGTFeCGTaFeCGTbAtUGT89C1At5GlcTFaGT1CaUGT3FtUGT143OsCGTZmCGTFeCGTaFeCGTbAtUGT89C1At5GlcTFaGT1CaUGT3FtUGT143PSPG boxABA：植物 UGT 蛋白氨基酸的序列多重比对（FtUGT143：苦荞；OsCGT（XP_015641684.1）：水稻；ZmCGT（PWZ07394.1）：玉米；FeCGTa（A0A0A1HA03.1）：甜荞；FeCGTb（A0A0A1H7N4.1）：甜荞；GmUGT708D1（NP_001347241.1）：大豆；At5GlcT（NP_193146.1）：拟南芥；FaGT1（AAU09442.1）：草莓；CaUGT3（BAH80312.1）：长春花）；红框标注为糖基转移酶保守序列的 PSPG box；B：PSPG box 比对分析A:Multiple Alignment of amino acid sequences of plant UGT protein（FtUGT143:Fagopyrum tataricum.OsCGT（XP_015641684.1）:Oryza sativa;ZmCGT（PWZ07394.1）:Zea mays;FeCGTa（A0A0A1HA03.1）:Fagopyrum esculentum;FeCGTb（A0A0A1H7N4.1）:Fagopyrum esculentum;GmUGT708D1（NP_001347241.1）:Glycine max;At5GlcT（NP_193146.1）:Arabidopsis thaliana;FaGT1（AAU09442.1）:Fragaria ananassa;CaUGT3（BAH80312.1）:Catharanthus roseus）.The red box indicates the PSPG box,a conserved sequence motif found in glycosyltransferases.B:Comparative analysis of PSPG box 图 3 植物 UGT 蛋白氨基酸的序列多重比对与 PSPG box 比对分析Fig.3 Sequence multi-alignment of plant UGT protein amino acids and comparative analysis of PSPG box2023,39(8)209王佳蕊等：苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析传 统 氢 键 与 氨 基 酸 残 基（Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln122、Gln123）相互作用，推测以上残基是 FtUGT143 与小分子相互作用的关键残基，主要作用力为氢键。这说明了FtUGT143 可以与木犀草素和芹菜素发生相互作用，推测其可能具有催化木犀草素和芹菜素合成黄酮 C-糖苷的功能。表 2 FtUGT143 与 4 种类黄酮代谢小分子的对接结果Table 2 Docking results of FtUGT143 with four flavonoids metabolizing small molecules配体小分子 Ligand small molecule结合能 Binding energy/（kJmol-1）山奈酚 Kaempferol-29.706 4表儿茶素 Epicatechin-31.796 4木犀草素 Luteolin-33.890 4芹菜素 Apigenin-32.216 82.2.4 FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间的相关性分析 实时荧光定量 PCR 检测结果显示，该基因在苦荞芽苗期的叶中表达量最高，其次是芽苗期的茎和根，而在 6 叶期植株的根、茎、叶和成年期植株的花、种子中表达量相对较低（图6-A）。各组织部位中的 4 种 C-黄酮-牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素相对含量分析结果显示芽苗期植株的叶、茎和根含量相对最高，在其他时期的不同组织部位中含量较低（图 6-B）。FtUGT143在不同组织部位中的表达量与 4 种 C-黄酮相对含量间的相关性分析显示，FtUGT143 的表达量与牡荆素（R2=0.961 4）、异牡荆素（R2=0.964 9）、荭草素（R2=0.971 4）和异荭草素（R2=0.963 0）4 种 C-黄酮含量间显著正相关（图 6-C），表明 FtUGT143 可能参与这 4 种 C-黄酮的合成。3 讨论苦荞药食同源，富含高生物活性的黄酮类化合物。黄酮糖苷化合物的生物合成主要由糖基转移酶完成20。黄酮 C-糖苷是苦荞类黄酮生物合成途径中的次级代谢产物，因此，研究苦荞中 C-糖基转移酶基因，对于深入了解苦荞中黄酮 C-糖苷的生物合成机制具有重要意义。3.1 FtUGT143是C-糖基转移酶 本研究通过 RT-PCR 技术成功克隆到一个可能参与苦荞中黄酮 C-糖苷生物合成的糖基转移酶基因 FtUGT143，其编码蛋白序列由 224 个氨基酸残At3RhaTGGT CladeCGT Clade3GT Clade7GT and 3GT5GT Clade图 4 FtUGT143 系统进化树分析Fig.4 FtUGT143 phylogenetic tree analysisABA：FtUGT143 和木犀草素对接示意图；B：FtUGT143 和芹菜素对接示意图A:Schematic diagram of FtUGT143 and luteolin docking.B:Schematic diagram of FtUGT143 and apigenin docking图 5 FtUGT143 和木犀草素、芹菜素对接示意图Fig.5 Schematic diagram of FtUGT143 docking with lute-olin and apigenin生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8210基组成，是一个稳定的疏水蛋白。对 FtUGT143 的密码子偏好模式进行分析，ENC 值为 51.17，CAI值为 0.157 4。FtUGT143 的 GC 与 GC3s 含量均小于50%。为后续 FtUGT143 蛋白结构预测与定向突变功能鉴定提供了理论基础。黄酮苷元主要包括芹菜素及其羟基或甲基化产物木犀草素、黄芩素等5，其被 UGT 作为底物催化其糖基化形成黄酮糖苷。例如，水稻21的 OsUGT706D1 和 OsUGT707A2 分别以芹菜素作为底物，在 7-O 和 5-O 位置催化形成黄酮糖苷。长春花22（Catharanthus roseus（L.）G.Don）的CaUGT3 以黄芩素作为底物在 7-O 位置催化形成龙胆糖苷。黄酮 C-糖苷主要为牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷和异荭草苷，分别是芹菜素和木犀草素在 C-6位或者 C-8 位在 C-糖基转移酶作用下连接一分子的葡萄糖形成的黄酮 C-糖苷23。目前，C-糖基转移酶在金莲花8、葛根9、山葵10、甜荞12等多种RootStemLeafRootStem?Sprouts6?6-leaf stage plants?Mature plants?VitexB?Isoorientin?Orientin?Isovitexin?Leaf?Vitex relative content?Relative expression0.51.01.52.00246810?Isovitexin relative content?Relative expression0.51.01.52.00246810?Isoorientin relative content?Relative expression0.51.01.52.00246810?Orientin relative content?Relative expression0.51.01.52.00246810Y=2.662 X+3.932?R2=0.961 4P0.000 1Y=2.675 X+3.930?R2=0.964 9P0.000 1Y=2.737 X+3.302?R2=0.971 4P0.000 1Y=2.740 X+3.312?R2=0.963 0P0.000 1C?Relative expressionsRoot Stem Leaf Root Stem Leaf Flower Seed?Sprouts6?6-leaf stage plants?Mature plantsA?0.00.51.01.52.0Flower?Seed?abcdeeeeA：FtUGT143 在不同组织部位中的表达；B：4 种 C-黄酮在不同组织部位的相对含量；C：FtUGT143 在不同组织部位表达量与 4 种 C-黄酮含量间的相关性A:Expression of FtUGT143 in different tissue sites.B:Relative content of four C-flavonoids in different tissue sites.C:Correlation between the expression of FtUGT143 and the content of four C-flavonoids in different tissue sites图 6 FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达量与 4 种 C-黄酮含量间的相关性Fig.6 Correlation between the expressions of FtUGT143 in the different tissue sites of buckwheat and the content of four C-flavonoids2023,39(8)211王佳蕊等：苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析植物中被功能鉴定。研究表明糖基转移酶基因家族在 C 端有 44 个氨基酸所组成的高度保守 PSPG box序列24。本研究通过对蛋白氨基酸序列进行多重比对发现，FtUGT143 具有相同的保守序列。系统进化树分析表明，FtUGT143 与玉米、大豆、水稻、甜荞的 C-糖基转移酶聚在一支，表明 FtUGT143 是糖基转移酶基因家族的 C-糖基转移酶成员，这暗示该基因可能具有直接催化黄酮化合物骨架的 C 位形成黄酮糖苷的功能。3.2 FtUGT143可能参与苦荞中黄酮C-糖苷生物 合成研究认为当蛋白与底物分子的自由结合能（G）小于-29.288 kJ/mol 有强烈的结合能力6,25。为了解苦荞 FtUGT143 在 C-黄酮生物合成中可能催化的底物及功能，本研究对 FtUGT143 蛋白进行同源建模与分子对接模拟，结果显示 FtUGT143 能与合成 C-黄酮糖苷牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的底物木犀草素（G=-33.890 4 kJ/mol）和芹菜素（G=-32.216 8 kJ/mol）相互作用，这与课题组前期在苦荞与甜荞的代谢组比对分析中的结论相同3，进一步表明 FtUGT143 可能具有催化苦荞中这 4 种 C-黄酮生物合成的功能。通过 Pymol 分析后推测 FtUGT143受体蛋白与芹菜素相互作用的关键氨基酸残基为Thr21、Gln22、Arg84、His98、Trp101、Asn102、Glu106、Gln123，这些关键残基位于配体与大分子结合的活性口袋中，为后续对 FtUGT143 的活性位点研究提供了参考价值。荧光定量表达分析显示，FtUGT143 主要在苦荞芽苗期的叶、茎和根中表达，与甜荞中 C-黄酮糖基转移酶同源基因 FeCGTa 和 FeCGTb 表达模式相似12。研究发现在甜荞的体外酶活实验中以 2-OH黄烷酮为底物催化生成黄酮 C-糖苷12。进一步分析显示，FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达量与 4 种 C-黄酮牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的含量显著正相关。有关 FtUGT143 在苦荞 C-黄酮生物合成中的详细功能还需进一步地研究。4 结论苦荞 FtUGT143 是糖基转移酶基因家族的一员，具有 C-糖基转移酶的特征，可能催化苦荞中 C-黄酮牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素的生物 合成。参 考 文 献1Baskar V,Venkatesh R,Ramalingam S.Flavonoids（antioxidants systems）in higher plants and their response to stressesM/Antioxidants and Antioxidant Enzymes in Higher Plants.Cham:Springer,2018:253-268.2Kumar V,Suman U,et al.Flavonoid secondary metabolite:biosynthesis and role in growth and development in plantsM/Recent Trends and Techniques in Plant Metabolic Engineering.Singapore:Springer,2018:19-45.3Li HY,Lyu QY,Liu AK,et al.Comparative metabolomics study of Ta-rtary（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn）and common（Fagopyrum esculentum Moench）buckwheat seedsJ.Food Chem,2022,371:131125.4Huda MN,Lu S,Jahan T,et al.Treasure from garden:Bioactive compounds of buckwheatJ.Food