基于基因表达数据库的急性髓系白血病细胞焦亡预后分析及GZMB调节机制研究.pdf

3376党庆秀，等基于基因表达数据库的急性髓系白血病细胞焦亡预后分析及GZMB调节机制研究基于基因表达数据库的急性髓系白血病细胞焦亡预后分析及 GZMB调节机制研究党庆秀，李洋？，郭嫣婷，沈洋灵，顾伟英1苏州大学附属第三医院，常州市第一人民医院血液科，江苏常州2 130 0 3；江苏大学医学院，江苏镇江212031【摘要】目的：通过生物信息分析与实验相结合探讨急性髓系白血病（acutemyeloid leukemia，A M L）细胞焦亡相关基因在AML患者的预后价值，并验证AML治疗的新靶点。方法：在基因表达谱数据库（TCGA、GTEx）中选取AML细胞焦亡相关基因表达数据，采用R语言筛选AML患者和健康对照组中细胞焦亡差异表达基因。对差异的基因进行单因素 Cox及Lasso回归分析并构建预后模型。应用单因素和多因素 Cox回归分析风险模型、临床特征与AML患者预后的相关性。Kaplan-Meier法分析预后模型中GZMB表达量与患者生存率的关系,将AML患者分成GZMB高表达组和低表达组并进行基因集富集分析（GSEA）。并采用Westernblot验证AML中GZMB/Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡。结果：45个焦亡相关基因在AML患者组和正常组中存在差异表达（P0.05）。其中7 个基因（BAK1、CA SP3、G ZM B、G PX4、NLRP2、GSDMB和CSDMA)被纳入风险模型构建。年龄、FAB分型、风险评分与AML患者预后相关(P0.05）,且风险评分是AML的独立危险因素（P0.05）。G ZM B高表达组的总生存率显著低于低表达组，差异有统计学意义（P0.05）。G SEA 富集分析显示GZMB主要参与了细胞因子信号通路、NK细胞、B细胞、T细胞免疫调节等信号途径（P0.05,FDR25%）。W e s t e r n b l o t 实验结果初步证实AML中存在GZMB/Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡调节途径。结论：通过生物信息学方法，构建了7 个细胞焦亡相关基因的AML预后模型，GZMB高表达与AML发生发展及不良预后相关，并参与GZMB/Caspase-3/GSDME途径介导的细胞焦亡。【关键词】急性髓系白血病；TCGAGTEx；细胞焦亡；GZMB【中图分类号】R733.71【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.18.008【文章编号】16 7 2-4992-（2 0 2 318-337 6-0 8Prognostic analysis of pyroptosis and molecular mechanism of GZMB in acute myeloidleukemia based on TCGA and GTEx databaseDANG Qingxiu,LI Yang,GUO Yanting,SHEN Yangling,GU WeiyingDepartment of Hematology,the Third Afiliated Hospital of Soochow University,the First Peoples Hospital of Changzhou,Jiangsu Chang-zhou 213003,China;The School of Medicine,Jiangsu University,Jiangsu Zhenjiang 212031,China.Abstract】O b j e c t i v e:Bi o i n f o r ma t i c s a n a l y s i s w a s u s e d t o s c r e e n d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d g e n e s (D EG s)i n a c u t emyeloid leukemia(AML)and further validation and analysis of their prognostic value were performed,in order to i-dentify and validate novel targets for AML therapy.Methods:The expression data and clinical characteristics of AMLand normal samples were downloaded from TCGA and GTEX database.R software was used to screen the DEGs intumor tissues and healthy controls.The DEGs were identified by Cox regression analysis and prognostic analysis wascarried out by Lasso analysis.Univariate and multivariate Cox regression were applied to analyze the correlation be-tween risk model,clinical traits and prognosis of AML patients.Kaplan-Meier method was used to analyze the rela-tionship between GZMB expression and survival rate in the prognosis model.AML patients were divided into highGZMB expression group and low GZMB expression group,and gene set enrichment analysis(GSEA)was performed.Western blot and ELISA were used to verify GZMB/Caspase-3/GSDME-mediated cell scorching in AML.Results:Forty-five DEGs were analyzed for prognosis,and 7 genes(BAK1,CASP3,GZMB,GPX4,NLRP2,GSDMB and【收稿日期】2023-0304【修回日期】2023-05-21【基金项目】江苏省常州市十四五卫生领军人才工程资助项目（编号：KY20221336）；江苏省卫生健康委员会重点项目（编号：ZD2021043）【作者简介】党庆秀（1991一），女，山东济南人，医师，硕士研究生，主要从事血液肿瘤研究。E-mail:【通信作者】顾伟英（197 2 一），女，江苏常州人，主任医师，博士生导师，主要从事血液科肿瘤临床研究。E-mail：g u w e i y i n g 2 0 0 1 16 3.c o mModernOncology2023,:3376-3383MODERNONC31,No.183377.2023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学GSDMA)were included in the risk model construction.Age,FAB subtypes,and risk score were significantly associat-ed with the prognosis of AML patients.The overall survival rate of the group with high expression of GZMB was lowerthan that of the group with low(P0.05).GSEA enrichment analysis showed that GZMB was mainly involved in cy-tokine signaling pathway,natural killer cell,B cell and T cell immune regulation signaling pathway(P2,adjustP0.051.4预后模型的构及独立预后分析使用“limma”包分别合并TCGA分型差异基因表达数据和生存数据。使用“survival”包对分型差异基因表达数据和生存数据进行单因素Cox回归分析，设置显著性过滤条cox-pfilter=0.05,得到预后相关基因并绘制森林图。使用“glm-net”包和 survival”包对TCGA队列预后相关基因和生存数据构建lasso回归模型，同时对模型进行交叉验证及优化，找到误差最小的点及对应基因（即参与模型构建基因）,并得到基因系数（Coef系数），从而得到风险得分计算公式。风险评分计算公式为：风险评分=ZGii（G i、i分别代表模型中的基因表达水平、系数）。根据风险评分的中位值分别将TC-GA数据分为高风险组和低风险组，使用 pheatmap”包绘制风险曲线、“Rtsne”包和“ggplot2”包进行PCA和t-SNE分析，使用“timeROC”包绘制1、3、5年的ROC曲线，检验分组的可靠性。使用“survival”包和“survminer”包比较高低风险组的生存差异。结合模型中的风险评分，使用单变量和多变量Cox回归分析寻找AML患者的独立预后因素1.5GSEA富集分析按TCGA数据库中AML样本GZMB表达的中位值，将样本分为低表达（C1）组和高表达（C2）组。利用GSEA.4.3.2软件进行KEGG分析，采用缺省加权富集统计的方法，随机组合次数设为10 0 0 次。P0.05和FDR0.25的基因组被认为是显著富集。1.6慢病毒转染工稳定细胞株pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE慢病毒及NC对照GLPNC购自中国和元生物公司，并用其感染MOLM-13和HL-60白血病细胞将细胞收集于15mL离心管中，离心收集。加人2 mL预热新鲜培养基将其重悬，细胞密度约为110 5 110/mL;加M0I=100的病毒体积至细胞悬液。为提高转染率，添加终浓度为5gmL的Polybrene；轻柔混匀，将混合液放人孵箱培养约30 分钟。取出，8 0 0 g离心30 6 0 分钟离心后吹打混匀细胞病毒混合液，转入6 孔板中，放人孵箱中培养12 2 4h，更换新鲜培养基继续培养48 7 2 h，继续更换为含有嘌呤霉素的培养基进行阳性细胞筛选持续观察细胞转染情况1.7实时荧光定量PCR（RT-q PC R）检测GZMB水平，进行稳转验证利用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA。以cDNA为模板，进行RT-qPCR，以GAPDH为内参，采用AceQ Universal SYBRqPCRMasterMix(Vazyme)试剂完成RT-qPCR反应，每个样品均重复3次，采用相对定量的方法分析相应基因的表达量差异。使用GraphpadPrism8.0统计学软件对数据进行统计分析,RT-qPCR数据用均数标准差（x s）表示，两两比较用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。引物GZMB（上游：AGGTGCCGTGGCTTCCTGATAC；下游:CTGGGTCGGCTCCTGTTCTTTG)3378基于基因表达数据库的急性髓系白血病细胞焦亡预后分析及 GZMB调节机制研究党庆秀，等1.8细胞分组及细胞形态观察将HL-60和MOLM-13细胞分别分为3组：Control组：向未转染的细胞株培养基中加人无菌PBS溶液；LPS+ATP组：向未转染的细胞培养基中加人50 0 ng/mL的LPS诱导2 4h后再加人5mmol/L的ATP刺激4h;LPS+A T P+shGZMB组：向转染的细胞株培养基中加人50 0 ng/mL的LPS诱导2 4h后再加人5mmol/L的ATP刺激4h。1.9Western blot法检测蛋白的表达收集细胞，裂解蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒（中国，碧云天）测定蛋白浓度，按照每孔2 0 mg蛋白量进行SDS-PAGE电泳，并转移至PVDF膜上,5%BSA封闭1 2 h后，与一抗4孵育过夜。加人辣根过氧化物酶（HRP)标记的二抗，室温孵育2 h。加人化学发光剂，曝光显影。GZMB抗体购自英国Abcam公司GADPH抗体、HRP标记二抗购自中国博士德公司，GSDME抗体、Caspase-3抗体、Cleaved-caspase-3抗体均购自美国Proteintech公司。1.10统计学分析Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析，同时在UALCAN（h t t p s:/u a l c a n.p a t h.u a b.e d u）在线分析网站比较候选基因的表达量与AML预后相关性。除RT-qPCR外的统计均使用R语言软件（V4.1.1）完成，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1焦亡相关基因在AML患者和健康对照者中的表达差异在7 0 个健康人和151个AML患者样本中，对51个焦亡相关基因进行差异分析发现45个焦亡相关基因存在表达差异(P1；NLRP2、CA SP1、G ZM B、A I M 2、PYCA RD、CHMP2A、CH M P3、G PX4、CA SP9、BA K 1、CH M P4B 和 GSD-MA）,4个基因为低风险基因（HR1;CASP6、CA SP3、ELA NE和 GSDMB)(图 1)2.3构建并验证AML预后基因模型进行LASSO回归分析（图2 A），同时对模型进行交叉验证及优化（图2 B），找到误差最小的点及对应的7 个基因（BA K 1、CA SP3、G ZM B、G PX4、NLRP2、G SD M B、G SD M A）构建预后模型，各基因系数（Coef系数）如表2 所示。根据风险评分公式计算的中位数，将132 名患者分为低风险亚组（6 7名)和高风险亚组（6 5名）,对所得到的参与模型构建基因进行降维处理后行PCA和t-SNE分析，结果显示，模型可以很好的区分高、低风险组病人（图2 C、D）。根据患者风险评分，对患者由低到高进行排序（图3A）。图3B显示随着风险评分的增加，患者死亡人数增加、生存时间缩短。生存分析显示两组存在显著差异（图3C,P0.001）。1年、3年和5年的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.7 6 2,0.7 0 9,0.7 49（图3D），表明该预后模型具有较好的灵敏度和特异性。3379MODERNONCO31.No.182023年0 9 月第31卷第18 期现代肿瘤医学表2 参与模型构建的基因及其Coef系数Tab.2Risk Coefficient of genes in the prognostic gene signatureGeneCoefBAK10.1186CASP3-0.0694GZMB0.1994GPX40.0744NLRP20.1643GSDMB-0.1993GSDMA0.38312.4验证模型的独立预后价值对TCGA队列患者采用年龄（阈值为6 5岁）、性别、FAB分型和风险模型的Risk score进行Cox回归分析。单因素Cox分析显示年龄、风险评分为预后因素（图4A,HR=1.035,95%CI:1.019 1.051;HR=2.262,95%CI:1.738 2.943）。多因素Cox回归分析显示，在纳人其他因素后，年龄、风险评分仍是一个独立因素（图4B,HR=1.025,95%CI:1.008 1.041;HR=2.053,95%CI:1.536 2.743)。PvalueHazardratioBAKI0.0012.085(1.345-3.231)CASP10.0051.287(1.077-1.536)CASP30.0100.668(0.492-0.907)CHMP2A0.0321.690(1.047-2.728)CHMP30.0101.884(1.163-3.052)CHMP4B0.0111.982(1.166-3.370)ELANE0.0050.915(0.860-0.974)GZMB0.0011.315(1.114-1.553)GPX40.0022.005(1.278-3.144)CASP90.0061.953(1.211-3.151)CASP60.0080.653(0.476-0.896)NLRP20.0321.205(1.016-1.429)PYCARD0.0021.601(1.197-2.140)GSDMB0.0360.740(0.558-0.981)GSDMA0.00122.135(3.875-126.434)AIM20.0091.306(1.068-1.597)020 40 6080 100 120Hazardratio图1单因素Cox回归筛选的P0.05的16 个预后相关基因Fig.1 Forest plots showed that the sixteen genes were all significantly correlated with the OS of AML patients according to the univariate Cox regressionanalysis(P0.05)A16141395-B161616141414131311997752CD29.5-1.0-10-9.0-0.5-0-8.580.0-0-0.5-8.0-2-Risk-10-Risk-1.07.5-highhighlow1ow-1.5-7.0-6-54.32-6-5-43-2-2.50.02.515-i0-5F510Log LambdaLog(a)PC1tSNE2图2 Lasso构建AML细胞焦亡预后相关模型A:16个预后相关差异基因的lasso回归分析;B:对模型进行交叉验证及优化;C:基于风险评分的PCA图;D：基于风险评分的t-SNE图。Fig.2Construction of prognostic pyroptosis-related gene modelA:LASSO coefficient profiles of the 16 survival-related genes.B:A coefficient profle plot was produced against the log(lambda)sequence in the LAS-SO model,the optimal parameter(lambda)was selected as the first black dotted line indicated.C:Principal component analysis(PCA)results.D:t-dis-tributed stochastic neighbor embedding(tSNE)results.2.5差异基因的蛋白互作网络构建及关键基因筛选通过 STRING在线软件对差异基因进行分析,将基因间的相互关联系数设置为0.7,并且将孤立基因排除,绘制蛋白互作(PPI)图（图5A）。通过Cytoscape将PPI网络图进一步分析,并且使用其插件挑选出前十的瓶颈基因（图5B）。值得注意的是，瓶颈基因GZMB包含在预后模型中，基于GZMB介导的细胞焦亡与AML之间的关系研究较少，我们选取GZMB基因进行进一步的验证分析。2.6GZMB基因与AML预后关系及GSEA富集分析Kaplan-Meier分析显示，与GZMB低表达的AML患者相比,GZMB高表达患者总生存率显著降低（图6 左,P0.05）；我们一步通过UALCAN在线分析网站验证了GZMB表达与AML预后呈负相关（图6 右,P0.05）。我们根据GZMB表达进行了GSEA分析，结果显示：GZMB主要参与了炎症细胞信号通路、NK细胞、B细胞、T细胞免疫调节等信号途径(图7,P0.05,FDR0.25)2.7敲除GZMB前后细胞mRNA表达量通过慢病毒转染，构建GZMB敲除的稳定表达株。GZMB在AML细胞株中的表达：在HL-60和MOLM-13细胞株中,转染后GZMBmRNA表达水平明显低于对照组（P0.05,图8)。Forestplotof univariate(A）and multivariate(B)cox regression of AML in TCGA cohortFig.4图4预后模型的Cox回归分机单因素（A）及多因素（B）模型森林图Hazardratio0.512Hazardratio0.50.0012.053(1.536-2.743)0.001 2.262(1.738-2.943)RiskscoreRiskscore0.8610.960(0.606-1.520)0.8641.039(0.669-1.614)GenderGender0.4071.062(0.921-1.226)0.5001.951(0.821-1.101)FABFABHHHHAgeAge0.0031.025(1.008-1.041)0.001 1.035(1.019-1.051)APvaluePvalueHazardratioHazardratioB3380.党庆秀，等基于基因表达数据库的急性髓系白血病细胞焦亡预后分析及GZMB调节机制研究ABCRiskHighriskLowriskD4.51.00-1.0Highrisk8Dead4.0-.LowriskAlive0.8-3.5-60.75-3.0-0.60.502.540.42.020.25-0.21.5AUCat1years:0.762P0.001AUCat1 years:0.7091.00.000.0AUCat1years:0.7490020406080100120020406080.1001200一-2-345-6-780.00.20.40.60.81.0Patients(increasingrisk socre)Patients(increasingrisksocre)Time(years)1-SpecificityHighrisk652611741000Lowrisk6743301912641001234568Time(years)图3预后模型效能分析A：T CG A 样本风险得分;B：患者生存状态（虚线左侧为低危人群，虚线右侧为高危人群）;C：不同组别患者的Kaplan-Meier曲线（P0.001)；D：RO C 曲线验证构建模型预测的准确性。Fig.3Validation of a pyroptosis-related gene prognostic signature in the TCGA cohortA:TCGA sample risk score.B:The survival status of the patient(the left side of the dotted line is the low-risk group,the right side of the dotted line isthe high-risk group).C:Kaplan-Meier curves analysed the OS of patients in different risk groups(P0.001).D:ROC curves were used to evaluatethe predictive power of the model.ABHMGB1IL6ILIBTP53CASP4CASP3CASP1CASP8AURKAGZMB图5蛋白互作网络的构建及关键基因的筛选A：差异基因的蛋白互作网络；B：蛋白互作网络中的瓶颈基因。Fig.5 Construction of protein interaction network and screening of core genesA:The protein in interaction network of specific mutated genes in DEGs.B:Top 10 Bottle neck genes in the network.Survivalcurve(P=0.017)EffectofGZMBexpressionlevel1.00-onLAMLpatient survival1.0-GZMBhighexpressionGZMBlowexpressionExpressionlevel0.80.75High expression(n=42)Low-Mediumexpression(n=121)0.60.500.40.25H0.2P=0.00210.00.00502468100020003000Time(years)Timeindays图6 AML患者GZMB高表达组与低表达组的Kaplan-Meier曲线Fig.6The Kaplan-Meier curve between GZMB high-and low-expression group of AML patients3381MODERNONCOL31.No.182023年0 9 月现代肿瘤医学第31卷第18 期Enrichmentplot:Enrichmentplot:Enrichmentplot:Enrichmentplot:KEGG_B_CELL_RECEPTOR_SIGNALINGPATHWAYKEGG_CYTOKINECYTOKINE_RECEPTOR_KEGGNATURALKILLERCELL_MEDIATEDKEGG_T_CELL_RECEPTOR_SIGNALING_PATHWAYINTERACTIONCYTOTOXICITY0.60.60.60.50.50.40.50.40.40.30.30.30.20.30.20.20.10.20.10.10.10.00.00.00.01.5C2(positivelyeomelated)1.01.01.01.00.5Zero cross at96350.5Zerocross at96350.5Zero.cross.at96350.5Zero.cross:at96350.00.00.00.00.5cl(negativelycorrelated)0.5rCI(negativelycorrelated)0.5Ct(argativelyerrelated)0.5cnegatively correlated)20004000600080001000120001400016000180002000002000400060008000 10000 1200014000 1600018000200000200040006000800010000120001400016000180002000002000400060008000100001200014000160001800020000RankinOrderedDatasetRank inOrderedDatasetRankinOrderedDatasetRankinOrderedDatasetEnrichment profle-HitsRanking metric scoresEnrichment profle-HitsRanking.metric scoresEnnichment profile-HitsRankingmetric scoresEnrichment profile-HitsRanking metric scores图7对高表达和低表达GZMB的DEGs进行CSEAC2kegg数据集的富集分析Fig.7The gene-set enrichment analysis(GSEA)of high-/low GZMB expression1.0P0.0011.50.8P0.0011.00.60.40.50.20.00.0NCsh-GZMBNCsh-GZMBHL-60MOLM-13图8GZMB在HL-60和MOLM-13中敲除前后mRNA表达Fig.83 The expression of GZMB in HL-60 and MOLM-132.8细胞形态变化将细胞分为NC、LPS+A T P组、LPS+ATP+shGZMB组，光镜下观察示：相较于对照组，LPS+ATP组、LPS+ATP+shGZMB组HL-60和MOLM-13细胞株的细胞体积胀大；气泡突出物增多；部分细胞膜破裂、胞质皱缩，均为焦亡细胞的形态变化（图9）。2.9GZMB的细AML调节胎通过慢病毒转染，构建GZMB敲除的稳定表达株。Westernblot实验分析发现，与对照组相比，GZMB敲除组的AML细胞中Caspase-3、G SD M E表达均升高，Caspase-3裂解片断有减低的趋势（图10）。表明AML细胞株中，GZMB可通过切割GSDME诱导细胞焦亡；同时GZMB可以活化Caspase-3，诱导Caspase-3介导的焦亡级联反应。AControl(400)ATP+LPS(400)ATP+LPS+shGZMB(400)BControl(400)ATP+LPS(400)ATP+LPS+shGZMB(400)图9HL-60（A)和MOLM-13(B)两株细胞中：对照组、LPS+ATP组、LPS+ATP+shCZMB组细胞形态学变化(ElivisionTM Plus400)Fig.9The morphological dfferences among NC,LPS+ATP,LPS+ATP+shGZMB of HL-60(A)and MOLM-13(B)(ElivisionM Plus 400)3讨论AML作为高度异质性的血液恶性肿瘤，虽然诊断和治疗方法在不断改进，但患者的生存期仍然很短、预后差。因此，迫切需要研究更多有效的生物标志物，以便尽早诊断、治疗和评估预后。过去几年,CAR-T疗法在抗癌治疗中取得了令人瞩目的效果,LIU等研究发现CAR-T细胞可诱导B型白血病细胞颗粒酶B的释放，快速激活靶细胞中的Caspase-3，进而激活Caspase-3/GSDME介导的焦亡途径，导致广泛的细胞焦亡7 。细胞焦亡在白血病患者的治疗中发挥重要作用，但目前关于细胞焦亡与AML发生发展及预后的研究相对较少。本研究收集基因表达谱芯片及二代高通量测序数据，联合进行AML细胞焦亡预后分析，寻找AML治疗的新型分子靶点。本研究通过对TCGA和GTEx数据库中AML的焦亡基因进行差异表达分析，获取到45个焦亡差异基因。并通过生存分析构建了7 个细胞焦亡相关基因（BAK1、C A SP3、GZMB、G PX4、NLRP2、G SD M B、G SD M A）生存风险模型。肿瘤坏死因子联合HY-10087（针对Bcl-2的抑制剂)以及放线菌酮均可诱导结肠癌细胞通过BAK/BAX-Caspase-3-GSDME信号通路诱发细胞焦亡，其焦亡过程受GSDMEC3382：基于基因表达数据库的急性髓系白亡预后分析及GZMB调节机制研究川烟细胞焦党庆秀，等端结构域的棕榈酰化修饰调控8 。邵峰研究团队发现，在高表达GSDME的肿瘤细胞中,致DNA损伤的化疗药物（多柔比星、依托泊苷和顺铂等）可促进Caspase-3活化识别内源GSDMEDEVD（靶位点），导致细胞焦亡9。LINC02474可通过抑制颗粒酶B基因（GZMB）的表达调节结直肠癌的凋亡和转移10 。KANG等人研究表明，谷胱甘肽过氧化物酶4（CPX4）是巨噬细胞焦亡的关键负调控蛋白，GPX4能够抑制Caspase-1、Ca s p a s e-11和PLCG1的活性,从而防止GSDMD-N的产生,抑制细胞焦亡的发生。NLRP3-炎性小体诱导的细胞焦亡可导致骨髓增生异常综合征（MDS）造血干/祖细胞的无效造血，抑制该焦亡途径可以恢复低危MDS的部分有效造血【12 。JOHNSON等研究发现,DPP8/DPP9抑制剂可引起AML细胞焦亡，并且可以抑制AML患者来源的异种移植瘤小鼠的生长13。此外,研究发现CSDMD可通过抑制胃癌细胞PI3K/AKT、ERK 等信号通路，进而降低周期蛋白依赖性激酶2（CDK2)和细胞周期蛋白cyclinA2的表达抑制细胞周期S/C,转变,导致细胞焦亡发挥抗肿瘤作用14-15杀伤细胞（killercells）释放的颗粒酶B(GzmB）能够直接切割GSDME，激活癌细胞细胞焦亡，而细胞焦亡的发生进一步激活抗肿瘤的免疫反应,抑制肿瘤生长16 。NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL)可释放颗粒酶A（G z m A）切割GSDMB，通过切割后的GSDMB的成孔活性诱发细胞焦亡，进而杀伤GSDMB+靶细胞。与此同时IFN-可促进GSDMB的表达，促进焦亡17 。CHRISTOPHER N LAROCK课题组最新研究发现，GSDMA可被蛋白酶SpeB直接切割，从而激活细胞焦亡；同时GSDMA缺陷的小鼠易受链球菌的感染，揭示了GSDMA在对抗可分泌SpeB的病原体的防御中发挥重要作用18 。我们通过对高风险、低风险分组的患者采用单因素及多因素Cox回归分析验证风险模型的预后效能,结果显示年龄、风险得分与AML患者预后都是显著相关。HL-60MOLM-13sh-GZMB+GZMB32kDGSDME55kDCASP-332kDCleaved-CASP-319kDGADPH36kD图10Westernblot检测GZMB敲除前后AML细胞中焦亡相关蛋白的表达Fig.10Expression of GZMB and pyroptosis-related protein in differentsamples虽然来自杀伤细胞的GzmB能够直接切割GSDME，激活癌细胞细胞焦亡，但是在Perforin缺失/杀伤淋巴细胞减少/免疫功能缺陷的小鼠中，则能够完全抑制杀伤细胞产生的GzmB诱导的细胞焦亡17 。此外，GzmB也可通过介导T细胞受体信号通路促进宫颈癌等肿瘤发展19。因此,GzmB对抗肿瘤免疫的研究具有重要意义。基于以上研究，我们进一步选取预测模型中GZMB基因为靶点，研究其表达与AML患者细胞焦亡之间的相关性。研究发现其在AML患者中高表达，与患者预后呈负相关。CSEA富基分析发现GZMB主要富集于AML细胞的细胞因子调节、B细胞、T细胞信号传导等过程，揭示AML中，GZMB可通过T淋巴细胞和NK细胞途径发挥作用。Westernblot结果显示，敲除GZMB后AML细胞中Caspase-3、G SD M E表达均升高，Caspase-3裂解片断有减低的趋势。这与光镜下观察到的敲除GZMB后细胞焦亡受抑结果一致，表明AML中存在GZMB诱导的CSDME介导的细胞焦亡途径。本研究中,GZMB敲除组的Caspase-3表达升高，初步表明AML中GZMB可以通过活化Caspase-3调节AML的进展，然而GZMB表达与AML预后呈负相关,其对AML发生发展的调控机制仍需进一步研究。综上所述，本研究通过联合TCGA和GTEx数据库的数据分析筛选出了AML细胞焦亡相关的差异基因，并对差异基因的功能和预后进行分析和验证，构建了7 个差异基因的预后风险模型，该模型对于AML患者预后具有良好的预测能力，相关细胞焦亡基因可能成为AML诊断及预后的生物标志物。通过GSEA富集分析、细胞形态学分析，确定GZMB可通过细胞焦亡参与AML细胞功能调节。Westernblot实验进一步验证了AML中存在GZMB/Caspase3/G SD M E介导的细胞焦亡途径，然而GZMB在AML发生发展中的作用机制仍需进一步研究探索。期待本研究结果能为AML患者预后评估及治疗提供新思路【参考文献】1ZWAAN CM,KOLB EA,REINHARDT D,et al.Collaborative ef-forts driving progress in pe