胶红酵母的分离鉴定与山苍子油的抑菌研究.pdf

嘉应学院学报（自然科学）46胶红酵母的分离鉴定与山苍子油的抑菌研究黄晓霞1,2，杨东润1，杨世锟1（1.嘉应学院 化学与环境学院，广东 梅州 514015；2.广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514015）摘要：从腐烂变质的花生中分离纯化出一株菌株 E2，通过形态学、生理生化试验及 26SrDNA 测序进行鉴定.结果显示该菌株的 26SrDNA 测序序列与胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的同源性达 100%，其形态特征及生理生化特性与胶红酵母最相似.通过测定抑菌圈直径、抑菌率和最低抑菌浓度（MIC）定性定量研究山苍子油对胶红酵母的抑菌活性，从离子渗漏试验和还原糖利用率探讨了山苍子油对胶红酵母细胞膜通透性的影响.试验结果表明，一定浓度的山苍子油能显著抑制胶红酵母的生长，最小抑菌体积分数（MIC）为 1.200LmL-1，试验还表明山苍子油破坏了胶红酵母细胞膜结构，导致胞内离子流失，还原糖利用率显著降低，干扰其对营养物质的利用.关键词：胶红酵母；菌株鉴定；山苍子油；离子渗漏中图分类号：S188文献标识码：A文章编号：1006-642X(2023)03-0046-07胶红酵母是酵母种属的一种，属子囊菌门/隐形酵母科/红酵母属，是单细胞真核生物，具有较强的环境适应力，广泛存在于不同生态系统环境中，在工业生产中具有一定的重要性和经济价值1.但同时也能造成食物的腐败变质，可使一般细菌不能生长的高糖、高盐食品发酵变质.因而酵母菌也作为评价食品卫生质量的“指标菌”2.另外胶红酵母也是引起真菌病和甲真菌病等多种疾病的机会致病菌3-4.植物精油含有醇类、酚类、醛酮类、萜类等多种活性物质对微生物具有显著的抑菌活性，可代替传统的物理化学抑菌剂5.山苍子油是从山苍子枝叶和果实中分离提取出来的一种芳香油，主要成分柠檬醛是国标 GB2760-2011 中规定可直接使用的食用香料，安全无毒，具有广谱的抗菌和抑菌作用.已有研究表明山苍子油对大肠杆菌、李斯特菌、黄曲霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、绿脓假单抱菌、白色念珠菌等致病真菌和细菌有较强的杀抑作用6-8.山苍子油因来源天然、无毒、强抑菌性和环境友好等优点，可作为食品防腐剂和保鲜剂，但目前尚未有其抑制胶红酵母的研究报道.本研究从自然发霉的花生中分离出一株胶红酵母菌，结合形态学、生理生化实验及 26S rDNA 生物学方法进行鉴定.采用山苍子油对其进行体外抑菌试验和抑菌机理的研究，旨在为山苍子油应用与胶红酵母的防控提供理论依据.1 材料与方法1.1 材料与仪器山苍子油，江西洋浦生物科技有限公司，柠檬醛含量 67.8%.HPX-200 生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；YXQ-LS-75SI 高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD 净化工作台，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；E5 显微镜，宁波舜宇仪器有限公司.马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖培养液（PDB）、糖发酵基础培养基、碳源同化培养基，广东环凯微生物科技有限公司.26srDNA 基因测工作由广东省微生物分析检测中收稿日期：2022-11-20基金项目：2020 年广东省科技专项资金项目（2020A0104003）；2022 年广东省普通高校重点领域专项（2022ZDZX4050）作者简介：黄晓霞（1976-），女，广东梅江区人，高级实验师，主要研究方向：微生物的防治与利用.第 41 卷第 3 期2023 年 6 月Vol.41NO.3Jun.2023嘉应学院学报（自然科学）JOURNAL OF JIAYING UNIVERSITY(Natural Science)第 41 卷第 3 期黄晓霞，杨东润，杨世锟胶红酵母的分离鉴定与山苍子油的抑菌研究47心完成.1.2 试验方法1.2.1 胶红酵母的分离、培养与保存在张金桃9的方法基础上稍作修改进行胶红酵母的分离与纯化试验.准确称取25.0 g霉腐变质的花生，在净化工作台上进行研磨，倒入装有 225 mL 无菌生理盐水中，摇匀，过滤.将滤液按照 10 倍的梯度进行稀释，分别移取不同稀释梯度（10-4,10-5,10-6）的溶液 0.1 mL 加入马铃薯葡萄糖培养基（PDA）平板中，用涂布棒涂布匀称后，倒置于 30 生化培养箱中恒温培养 48 h.依据酵母菌的特征与鉴定手册10胶红酵母菌落特征，挑取平板上菌落特征与胶红酵母菌相似的单个菌落在平板划线分离培养，重复以上步骤，直到获得纯菌株 E2.将纯化后的菌株制成菌种斜面置于 4 冷藏箱保存备用.胶红酵母菌悬液的制备：在超净工作台下，用无菌接种环挑取试管斜面的菌种接入锥形瓶中 PDB 培养液，于 30，120 rmin-1转速恒温摇床中培养 48 h 后用血球计数板计数，用无菌生理盐水制备成浓度为 103CFUmL-1的菌悬液.1.2.2 菌株的鉴定11-13（1）形态学鉴定11.将分离纯化后菌株从菌落形态特征，个体形态，繁殖方式，子囊孢子的形成，假菌丝的形成，掷孢子的形成等方面进行观察并记录.（2）生理生化特性试验.酵母菌对各种糖类的发酵能力和对各种碳源的利用能力是酵母菌分类鉴定的一个重要依据.在马文锦等12-14方法上有所改动进行糖类发酵试验和同化碳源试验.糖发酵试验方法：将糖发酵基础培养基中的“糖”分别用葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、棉子糖替换，制成糖发酵培养基，然后分装于放置了杜氏小管的的试管中使糖浓度达 2%，121 灭菌 15 min，冷却后接种分离出的胶红酵母菌，置 30 恒温 37 d 培养后观察产酸产气的情况，以不接种作为对照.如试管中培养液呈黄色则表示培养液为酸性，如倒置的杜氏小试管中无液体则培养中已产气.“+”表示产酸产气，“-”表示无变化.同化碳源试验方法：共配制 10 种碳源同化培养基，10 种碳源包括葡萄糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖，阿拉伯糖，海藻糖，乳糖，棉子糖，鼠李糖，蜜二糖，接入分离纯化后的胶红酵母菌，30 培养 35 d 后观察各培养基上胶红酵母的生长状况，进行对比，总结胶红酵母适宜的碳源生长条件.（3）26S rDNA 分子生物学鉴定.将纯化的菌种试管斜面送广东省微生物分析检测中心进行 26S rDNA基因测序，用 blast 程序在 Genebank 中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，并构建系统发育树.1.2.3 山苍子油对胶红酵母抑菌活性测定（1）抑菌圈直径的测定15.用 70%乙醇水溶液将山苍子油稀释成体积分数分别为 3.13、6.25、12.5、25.0、50.0、80.0、100、120 LmL-1的溶液，将干热灭菌后的直径为 6 mm 的滤纸片置于不同浓度的山苍子油中浸泡 2 h.移取胶红酵母菌悬液（103CFUmL-1）0.1 mL 于无菌 PDA 培养基平板，用涂布棒涂布均匀.将浸泡后的滤纸片呈品字形贴附在培养基平板上，用 70%乙醇水溶液浸泡的无菌滤纸片作空白对照.置于 30 恒温培养 48 h 后用游标卡尺准确测量抑菌圈直径，每个浓度取 3 个平行实验的平均数值.（2）山苍子油对胶红酵母的抑菌率和最低抑菌浓度（MIC）的测定.采用刘瑞玲16的方法并稍作修改测定山苍子油对 E2 菌的抑制效果.配制马铃薯葡萄糖培养液（PDB），分装于若干锥形瓶中，灭菌后降温至 60 左右，吸取一定量的山苍子油乙醇稀释液加入锥形瓶中，山苍子油在培养液的最终体积分数分别为：0、0.038、0.075、0.150、0.300、0.600、0.800、1.00、1.20 L mL-1.取 0.1 mL 菌悬液（103CFU mL-1）于每个锥形瓶中，于 30，120 rmin-1转速恒温摇床中培养 48 h 后，分别取 0.1 mL 培养液于 PDA 平板，用涂布棒涂布均匀，倒置于 30 恒温培养 48 h 后观察计算菌落数.根据菌落数计算抑菌率.绘制精油浓度和抑菌率的回归方程，以抑菌率 100%的山苍子油体积分数为其最低抑菌体积分数（MIC）.每个浓嘉应学院学报（自然科学）48度做 3 个平行实验，以 70%乙醇水溶液进行对比参照.抑菌率计算公式为：抑菌率=100%，式中 de为处理组菌落数，dc为对照组菌落数.1.2.4 山苍子油对细胞膜渗透性的影响通过测定离子渗漏来监测山苍子油对胶红酵母细胞膜通透性的影响17.将在 PDB 培养液中 30 培养48 h 的胶红酵母菌液在室温、8 000 r mL-1下离心，除去上清液，将菌体用无菌水洗涤离心后，再用 20 mL生理盐水重新悬浮，取 5 mL 加入不同浓度的山苍子油中，30 恒温振荡 24 h，以无山苍子油为对照组.然后将处理液在室温、8 000 rmL-1下离心，取上清液用原子吸收光度计测定 Ca2+、K+和 Mg2+浓度.1.2.5 山苍子油对胶红酵母利用还原糖的影响将山苍子油用 70%乙醇水溶液稀释后取一定量的稀释液于灭菌冷却后的 PDB 培养液中，培养液中山苍子油的体积分数分别为:0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800、1.00 LmL-1，然后每个实验锥形瓶加入 0.1 mL 菌悬液（103CFUmL-1），于 30，120 rmin-1转速恒温摇床中培养.48 h 后，取培养液于室温、8 000 rmL-1离心 15 min 取上清液，用 3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量18.2 结果与分析2.1 菌株鉴定2.1.1 形态学鉴定如图 1 所示，从霉变花生中分离纯化的菌株 E2 细胞卵圆形，出芽生殖，不形成假菌丝，无子囊孢子，不形成掷孢子.在麦芽汁琼脂培养 3 天，菌落圆形，凸起，表面光滑，有关泽，边缘整齐，橙红色.图 1菌落形态和显微形态图2.1.2 生理生化特性在 30 培养 37 d 的胶红酵母细胞不发酵葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、棉子糖.能够同化葡萄糖，半乳糖，蔗 糖，麦芽糖，阿拉伯糖，海藻糖，棉子糖，鼠李糖，但不能同化乳糖和蜜二糖.综合该菌的菌落特征、显微特征和生理生化特性，采用酵母菌的特征与鉴定手册将该菌株初步鉴定为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）.第 41 卷第 3 期黄晓霞，杨东润，杨世锟胶红酵母的分离鉴定与山苍子油的抑菌研究49表 1酵母菌菌株生理生化试验结果生理生化试验结果生理生化试验结果葡萄糖产酸葡萄糖利用半乳糖产酸半乳糖利用麦芽糖发酵蔗糖利用蔗糖发酵麦芽糖利用海藻糖发酵阿拉伯糖利用乳糖发酵海藻糖利用棉子糖发酵乳糖利用30 生长棉子糖利用37 生长鼠李糖利用40 生长蜜二糖利用(“”表示阳性反应，“”表示阴性反应)2.1.326S rDNA 分子生物学鉴定菌株 E2 测序得到的 26 S rDNA 序列为 489 bp，用 blast 程序在 Genebank 中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，该菌的 26 S rDNA 序列与胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的同源性达 100%，基于ITS 序列邻接法构建得到的系统发育树，结果如图 2.结合其形态特征及生理生化特征鉴定该菌为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）.Rhodotorula babjevae CBS 7808T(AF070420)Rhodotorula glutinis CBS:20T(KX771201)Rhodotorula diobovata CBS 6085T(AF070421)Rhodotorula evergladensis CBS10880T(FJ008048)Rhodotorula kratochvilovae CBS 7436T(AF071436)Rhodotorula mucilaginosa KCTC 7829(AF257267)Rhodotorula mucilaginosa CBS 17(AF189960)Rhodotorula mucilaginosa CBS:6469(KY109112)E2Rhodosporidiobolus colostri CBS 348T(AY372177)1009597960.01图 2菌株 HB2 基于 ITS 序列邻接法构建系统发育树，自展值 10002.2 山苍子油对胶红酵母的抑菌活性通过抑菌圈直径、抑菌率和最小抑菌浓度（MIC）的测定评估山苍子油对胶红酵母的抑菌活性.对胶红酵母抑菌圈大小的测量结果见表 2，试验结果表明滤纸片上的山苍子油向四周均匀扩散而形成一层无菌透明圈，抑菌圈的大小随山苍子油体积分数的增加呈增大趋势.当滤纸片山苍子油体积分数为2580 L/mL 时，抑菌表现为最敏感.由于三个滤纸片中精油的扩散作用，当体积分数大于 100 L mL-1时整个平板已无菌的生长.嘉应学院学报（自然科学）50表 2山苍子油对胶红酵母抑菌圈的影响体积分数/LmL-103.136.2512.525.050.080.0100抑菌圈直径/mm60.257.890.4210.531.1513.781.6016.682.0619.381.6323.050.89-注：“-”表示无菌生长物.抑菌圈直径15 mm 为最敏感、1015 mm 为中度敏感、79 mm 时为低度敏感、无抑菌者为不敏感19对胶红酵母抑菌率的测定结果见图 3、图 4，由试验结果显示，山苍子油能够明显抑制胶红酵母的生长，随着浓度的增大抑菌率逐渐增强，精油浓度和抑菌率的多项式回归方程为 y=-0.842 5x2+20.247x-14.855（R2=0.965 9），当体积分数为 1.20 LmL-1时，抑菌率达 100%，即山苍子精油对胶红酵母的MIC 值为 1.20 LmL-1.图 3山苍子油对胶红酵母的抑制率abcdef图 4山苍子油对胶红酵母的抑制效果（注：a、b、c、d、e、f 山苍子油在培养液的浓度：0、0.075、0.150、0.300、0.600、0.800 LmL-1）第 41 卷第 3 期黄晓霞，杨东润，杨世锟胶红酵母的分离鉴定与山苍子油的抑菌研究512.3 山苍子油对细胞膜渗透性的影响植物精油由不同组分构成的复杂混合物，其作用于病原菌的方式和靶点很多，抑菌机理较为复杂.有研究表明，山苍子精油主要成分为柠檬醛，可以破坏细胞膜的结构，改变膜的通透性，胞内离子或物质泄漏，并干扰微生物的各种生物进程20.由表 3 结果可知，经不同浓度山苍子油处理后，胶红酵母培养液中 Ca2+、K+和 Mg2+浓度明显增加,当山苍子精油体积分数大于 0.800LmL-1时，培养液中三种离子浓度增长缓慢.离子渗漏试验表明山苍子油对细菌细胞的通透性发生影响，使其通透性增加.表 3山苍子油对胶红酵母离子渗漏的影响Ca2+K+Mg2+对照1.6590.4350.5950.0304.2121.2051.2590.0605.7561.7251.8660.1206.3181.7871.8960.2406.0332.0181.9230.4806.8792.5652.0330.8006.9542.6122.2351.007.0232.6892.2032.4 山苍子油对胶红酵母利用营养物质的影响微生物在正常的增殖过程中更需要吸收利用培养基中的糖类物质，而当膜结构遭到破坏时，糖类等营养物质的利用率会受到抑制21.山苍子精油影响胶红酵母利用培养液还原糖的结果见图 5，随着处理浓度的增加，还原糖的利用率逐渐降低，对照组还原糖的利用率为 66.10%，当山苍子油处理浓度为 0.800LmL-1时，还原糖的利用率仅为 13.8%，说明山苍子油能明显抑制胶红酵母对培养液中还原糖的利用.图 5 山苍子油对菌体还原糖利用率的影响3 结果与讨论本文通过形态学、糖发酵、碳源同化实验及 26S rDNA 生物学方法，鉴定从花生中分离的菌株 E2为胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa），并以其为研究对象，研究山苍子油对其的抑菌效果和抑菌机理.结果表明，山苍子油对胶红酵母有明显的抑制作用，且抑制效果与浓度呈正相关，最低抑菌体积分数为 1.20 LmL-1.山苍子油破坏菌体的细胞膜，引起细胞内部渗透压不稳定，胞内物质泄漏，胞外离子浓度升高，进而影响细胞正常生长和代谢，培养液还原糖的利用率降低，从而表现出抑菌特性.后期可开展山苍子油在相关食品中应用相关研究，扩宽山苍子油的用途，增加其附加值.嘉应学院学报（自然科学）52参考文献：1 NUR F B 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mucilaginosa CM-1 菌株的鉴定及胞外多糖的分离纯化J.食品与发酵工业,2021,47(21):46-52.13 徐文欢,吴若菡,李采婵,等.传统虾酱中酵母菌分离鉴定及碳源利用特性J.中国食品学报,2021,21(4):303-309.14 赫林.食品微生物学实验技术M.北京:中国农业出版社,2016:53-60.15 王雪,梁晓洁,高暝,等.三种山苍子精油化学成分及抑菌效果差异分析J.天然产物研究与开发,2019(31):1847-1856.16 刘瑞玲,郜海燕,陈杭君,等.红肉火龙果采后病原菌分离鉴定与植物精油抑菌研究J.农业机械学报,2018,49(8):338-345.17 杨钦滟.山鸡椒油的抑菌作用及应用研究D.重庆:西南大学,2010.18 王莉丽,梅文泉,陈兴连,等.3,5-二硝基水杨酸比色法测定大米中水溶性糖含量J.中国粮油学报,2020,35(9):168-173.19 闫红秀,刘香萍,任乃芃,等.肉桂精油及其主要组分对饲料中常见真菌的抑菌活性的研究J.饲料工业,2022,43(17):47-53.20 杨海莹,张应龙,丁新丽,等.植物精油在控制真菌及其毒素方面的应用进展J.粮食与饲料工业,2014(5):23-26.21 图尔荪阿依图尔贡,王帆,付龙龙,等.丁香酚对水产品中普罗威登斯菌的抑制作用J.食品与机械,2020,36(11):118-121.责任编辑：陈先军Isolation and Identification of Rhodotorula Mucilaginosa and Antimicrobial Activity ofLitsea Cubeba OilHUANG Xiao-xia1,2,YANG Dong-run1,YANG Shi-kun1(1.School of Chemistry and Environment,Jiaying University,Meizhou 514015,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Conservation and Precision Utilization of Characteristic AgriculturalResources in Mountainous Areas,Meizhou 514015,China)AbstractAbstract:A strain E2 was isolated and purified from decayed peanut.Morphological,physiological and biochemical tests,and 26SrDNA sequencing were used to classify and identify the strain.The results showed that the 26SrDNA sequencingsequence of this strain had 100%homology with Rhodotorula mucilaginosa,and its morphological,physiological andbiochemical characteristics were most similar to Rhodotorula mucilaginosa.The antimicrobial activity of litsea cubeba oilagainst Rhodotorula mucilaginosa,was qualitatively and quantitatively studied by measuring the diameter of thebacteriostatic ring,the bacteriostatic rate,and the minimum inhibitory concentration(MIC).The effects of litsea cubebaoil on the permeability of Rhodotorula mucilaginosa cell membrane were discussed from the perspective of ion leakagetest and reducing sugar utilization rate.The results showed that a certain concentration of litsea cubeba oil couldsignificantly inhibit the growth of Rhodotorula mucilaginosa,with a minimum inhibitory volume fraction(MIC)of 1.200LmL-1,the test also showed that Litsea cubeba oil damaged the membrane structure of Rhodotorula mucilaginosa,resulting in the loss of intracellular ions,significantly reducing the utilization of reducing sugar,and interfering with itsutilization of nutrients.KeyKey words:words:Rhodotorula mucilaginosa;isolation and identification;Litsea cubeba oil;ion leakage