桔皮素与β-环糊精及其衍生物的包合行为研究.pdf

桔皮素与-环糊精及其衍生物的包合行为研究古捷，杨举，鲁佳佳，苏丽娇，陶欣，张郡童，钏永明，杨丽娟*(云南民族大学化学与环境学院，云南省高校智能超分子化学重点实验室，生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程中心，云南昆明650500)摘要：以-环糊精(-CD)、2-羟丙基-环糊精(HP-CD)及 1,3,6-环糊精(TM-CD)为主体，桔皮素(TAN)为客体，通过饱和溶液法成功制备了 3 种新型主客体包合物.采用傅里叶红外光谱(FT-IR)、X 射线粉末衍射分析(XRD)及扫描电镜(SEM)等分析方法对主客体包合物进行了表征.通过核磁共振氢谱(1HNMR、2DNMR)及分子对接计算推测了包合物可能的包合模式.运用紫外可见光谱法(UV-Vis)研究了 TAN 与 3种环糊精的包合比、包合物的水溶性和稳定性.实验结果表明，3 种包合物 TAN/-CD、TAN/HP-CD 及TAN/TM-CD 均制备成功，主客体包合分子比均为 11，TAN 均以 A 环从环糊精的大口端进入空腔，且整个药物分子贯穿在环糊精的空腔中.此外，TAN 包合后的水溶性和稳定性都明显提高，且在 pH=3.0 的条件下更易形成包合物，这为 TAN 的药物制剂研究提供了理论依据.关键词：桔皮素；-环糊精及其衍生物；包合行为；溶解度；稳定性；分子对接中图分类号：O625.42文献标志码：A文章编号：02587971(2023)04090407桔皮素(Tangeretin，TAN)是一种化学骨架上含有 2 个以上甲氧基的黄酮类化合物，TAN 几乎只存在于柑橘类水果中，尤其是其果皮中含量丰富1-3.据报道，TAN 具有抗炎、抗真菌、抗癌、抗糖尿病和神经保护等作用4-8.近年来，TAN 已被应用于临床研究，例如 TAN 能通过 Nrf2/NF-B 和 MAPK/NF-B 介导抑制细胞外基质(ECM)降解来消除骨关节炎(OA)9，对于高脂饮食(HFD)喂养的小鼠，长期补充 TAN 可通过改善脂肪产热、减少全身炎症和肠道菌群失调以改善肥胖表型10.但由于TAN 的溶解性、生物利用度、稳定性较低11-12，导致 TAN 在食品和保健品领域的应用有限，因此选择一种疏水载体包合 TAN 十分有意义.环糊精(Cyclodextrin，CD)作为一种具有疏水空腔的多糖，本身不具有毒性且生物相容性好，常被选作疏水药物的载体，目前尚未见 CDs 对 TAN的包合作用研究报道.因此本文选择了-CD、HP-CD 以及 TM-CD 与 TAN 构筑了 3 种新型主客体包合物（CDs 与 TAN 的结构及包合物 TAN/CDs形成示意图如图 1），通过紫外可见吸收光谱（UV-Vis）、核磁共振（1HNMR、2DNMR）、X 射线粉末衍射（XRD）、傅里叶红外光谱(FT-IR)、扫描电镜（SEM）和分子对接对 3 种包合物进行了表征，研究了-环糊精及其衍生物对 TAN 水溶性和稳定性的改善情况.结果表明，包合后，TAN 的水溶性和稳定均显著提高，这为以-CD 及其衍生物作为药物载体，制备 TAN 的药物制剂提供了理论依据.1实验部分1.1仪器与试剂Aglient8453 紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司）；Quanta200扫描电子显微镜（美国FEI公司）；TTR18kW铜靶转靶X射线衍射仪（日本理学公司）；AvanceDRX500（瑞士Bruker公司）；NICOLETiS10傅里叶红外光谱仪（美国 ThermoFisherScientific 公司）.TAN（宝鸡辰光生物科技有限公司）；-CD、HP-CD、TM-CD（德国 J&KTANientific公司）；所有试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水.收稿日期：2022-06-16；接受日期：2022-09-20；网络出版日期：2022-11-19基金项目：国家自然科学基金（21762051）；云南省高校有机功能分子及材料科技创新团队项目；云南省教育厅科学研究基金（2022Y462）.作者简介：古捷（1996），女，云南人，硕士生，主要研究超分子化学.*通信作者：杨丽娟（1971），女，云南人，教授，主要研究超分子化学.E-mail：.云南大学学报（自然科学版），2023,45（4）:904910JournalofYunnanUniversity:NaturalSciencesEditionDOI:10.7540/j.ynu.202203071.2实验方法1.2.1 TAN/CDs 物理混合物和包合物的制备首先，按照 CDs 和 TAN 摩尔比为 11.5 准确称取CDs0.02mmol 于 50mL 圆底烧瓶中，加入 16mL超纯水，然后在 50 下搅拌，再称取 TAN0.03mmol 于 50mL 烧杯中，加入 16mL 乙醇，超声辅助使 TAN 充分溶解，然后将 TAN 溶液缓慢加入CDs 溶液中，加完后在 50 下反应 2d，反应结束后用 0.45m 过滤器过滤，旋干溶剂后加入 32mL超纯水超声辅助下使其溶解，经过滤后再次旋干溶剂，真空干燥 24h，即得 TAN/CDs 包合物(均为淡黄色固体粉末).1.2.2 TAN 标准曲线的绘制用乙醇配制浓度分别为 0.010,0.012,0.014,0.016,0.018,0.020,0.022,0.024,0.026mmol/L 的 TAN 溶液，并在 max=323nm处测定各溶液的吸光度值，以 TAN 的浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为 A=28.3641c0.0464，R2=0.9995(n=9).1.2.3 紫外可见吸收光谱(UV-Vis)测定保持 TAN 的浓度为 0.015mmol/L，按照表 S1（见电子版支撑材料）分别配制不同浓度梯度的-CD、TM-CD、HP-CD 溶液，并分别采用 Na2HPO4-柠檬酸和 NaHCO3-Na2CO3缓冲体系控制溶液的 pH 为3.0 和 10.5，用缓冲溶液与乙醇混合液(体积比41)定容，然后在 max=330nm 处测定各组溶液的紫外可见吸收光谱.1.2.4 Job 曲线采用 Job 法13测定 TAN 与 CDs的包合比.使用 Na2HPO4柠檬酸缓冲溶液（pH=3.0）配制系列浓度的 TAN 与 CDs 的混合液，保持混合液的总浓度为 0.015mmol/L，使 TAN 与 CDs 的摩尔比在 01 范围内变化，在 max=330nm 处测定各溶液的吸光度值.1.2.5 TAN/CDs 包合物的水溶性实验采用饱和溶液法14测定包合物在水中的溶解度.将过量的 TAN/CDs 分别溶于去离子水中，超声使其充分溶解，并达到饱和状态.用 0.45m 微孔滤膜过滤除去不溶物，移取 0.05mL 滤液至 5mL 容量瓶中，用乙醇定容，摇匀后，在 max=330nm 处测量各溶液的吸光度.1.2.6 TAN/CDs 包合物的稳定性实验取两组各6 个25mL 的棕色容量瓶，分别加入0.015mmol/LTAN 溶液，在两组中的 5 个容量瓶中分别加入4mmol/L 的-CD、HP-CD 及 TM-CD，并分别采用 KCl-HCl 和 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液控制 pH 值为 1.5（模拟胃液环境）和 7.6（模拟肠液环境），用乙醇缓冲溶液(体积比 14)定容，37水浴孵育 1h 后，每隔(122)h 在 max=330nm 处测定一次各溶液的吸光度.1.2.7 理论计算本研究采用分子对接程序模拟了 TAN 与-CD、HP-CD 和 TM-CD 的包合模式.使用 GaussianView 构建 TAN 的结构，并运用 B3LYP/6-31G(d)对 TAN 的结构进行优化.-CD 的结构来源于剑桥晶体数据库，HP-CD 及TM-CD 的结构通过修饰-CD 得到，3 种环糊精的结构由 PM3 半经验法进行优化.将 TAN 分别对接到 3 种环糊精的空腔中，选择半柔性对接法，设置 CDs 为刚性受体，TAN 为配体，并允许 TAN 分子柔性扭转.然后使用遗传算法，执行 100 次构象搜索.最后通过聚类分析得到一系列 TAN 与 3 种环糊精的包合模式.分子对接及计算采用 AutoDock4(AutoDock4.2.3)程序15完成.2结果与讨论2.1紫外可见吸收光谱(UV-Vis)测定按照图1环糊精与桔皮素的结构及包合物的形成示意图Fig.1Thestructureofcyclodextrinsandtangeretinaswellastheschematicdiagramoftheformationofinclusioncomplexestangeretin/cyclodextrins第45卷古捷等：桔皮素与-环糊精及其衍生物的包合行为研究9051.2.3 的方法分别测定 TAN 与-CD、HP-CD 及TM-CD 在 pH=3.0 和 pH=10.5 的缓冲溶液中的紫外可见吸收光谱(见电子版支撑材料图 S1)，并记录各溶液在 max=330nm 处的吸光度.通过非线性最小二乘法16对 pH=3.0 和 pH=10.5 条件下 TAN与-CD、HP-CD、TM-CD 的紫外光谱进行拟合，可得 3 种包合物的稳定常数、Gibbs 自由能变化如表 1 所示.由表 1 可知 3 种包合物在 pH=3.0条件下的稳定常数均大于 pH=10.5 条件下的稳定常数，这表明 TAN 与-CD 及其衍生物在 pH=3.0条件下更易形成配合物，且形成的配合物更稳定.由图 S1 中的插图可知，TAN 与-CD、HP-CD 及TM-CD 的实验值与理论值之间存在良好的线性关系，证明假设是成立的，因此 TAN 与-CD、HP-CD 及 TM-CD 都以 11(摩尔比)形成配合物.表1桔皮素与环糊精形成包合物时的热力学参数Tab.1Thermodynamicparameterswhentangeretinandcyclodextrinsforminclusioncomplexes主体pH稳定常数Ks/（Lmmol1）logKs/（Lmmol1）吉布斯自由能变化G/(kJmol1)-环糊精3.022183.345419.09810.515923.201418.2762-羟丙基-环糊精3.032763.514720.06410.522453.350619.1282,3,6-三甲基-环糊精3.036003.555720.29810.532533.511720.0472.2Job 曲线按照 1.2.4 节的方法测定 TAN 与CDs 的紫外可见光谱.以 TAN 的摩尔分数（xGuest）为横坐标，0.015mmol/LTAN 溶液的吸光度和0.015mmol/LTAN 与不同浓度 CDs 的混合液的吸光度之差（A）乘以 TAN 的摩尔分数（xGuest）为纵坐标，绘制 Job 曲线.如图 2 所示，曲线的最高点对应的横坐标值均为 0.5，可以判断出 TAN 与 CDs的包合比均为 11.该结论与紫外可见光谱的结论相互验证.2.3粉末衍射分析TAN、CD、TAN 与 CDs 物理混合物以及 TAN/CDs 包合物的 XRD 图如图 3 所示，TAN、-CD 及 TAN 与-CD 物理混合物均为晶型结构，HP-CD 及 TM-CD 为非晶形结构.TAN 在 12.48、14.79及 19.36 25.5、28.4229.77范围内均出现了尖锐的特征峰.-CD、HP-CD 及TM-CD 的特征峰主要出现在15.49、7.5837.72及 7.1338.58.TAN 与 CDs 的物理混合物均出现 TAN 及 CDs 的峰.此外，TAN/-CD 包合物在12.54处出现了TAN 的特征峰，在12.9937.87范围内出现了一个较宽的新特征峰；TAN/HP-CD 包合物在 6.8638.17范围内显示出 2 个较宽的特征峰；TAN/TM-CD 包合物出现了 TAN 与TM-CD 的特征峰，但峰的位置发生了蓝移，且强度大大降低.综上所述，3 种包合物的 XRD 图均与TAN 和 CDs 存在差别，且不是简单的物理堆积，证明 3 种包合物制备成功.2.4红外分析TAN、CDs、物理混合物(TAN-CDs)及 TAN/CDs 包合物的 FT-IR 图见电子版支撑材料图 S2.如图 S2A 所示，TAN/-CD 包合物的红外吸收光谱由于受到 TAN 在 1511cm1处的不饱和碳上的 CH 伸缩振动峰(苯环及 C C)的影响，导致-CD 在 1598cm1处的吸收峰红移至图2桔皮素与-环糊精(a)、2-羟丙基-环糊精(b)、1,3,6-三甲基-环糊精(c)在 pH=3.0 时的 Job曲线Fig.2Job plots for tangeretin with-cyclodextrin(a),2-hydroxypropyl-cyclodextrin(b),2,3,6-trimethyl-cy-clodextrin(c)atpH=3.0906云南大学学报（自然科学版）http:/第45卷1673cm1及 1633cm1处，且 TAN/-CD 包合物在1368cm1处出现了 TAN 在 1362cm1处 CH3上的 CH 伸缩振动峰.由图 S2B 可知，TAN 与 HP-CD 形成包合物后，使得 HP-CD 在 1599cm1处的吸收峰红移至 1633cm1处且峰的强度显著增强，并且 TAN/-CD 包合物的红外吸收光谱出现了 TAN 在 2844cm1处 CH3上的 CH 不对称伸缩振动峰及 1362cm1处 CH3上的 CH 对称伸缩振动峰.由图 S2C 可知，TAN 与 TM-CD 结合后，TM-CD 在 1610cm1处的吸收峰强度显著增强，且在 1073cm1处出现了 TAN 结构中苯环上的COC的伸缩振动峰.此外，3 种包合物的红外吸收峰与各自的物理混合物的红外吸收峰都存在峰位置以及峰强度的差异.综上所述，3 种包合物均制备成功，且不是以简单的物理混合方式进行包合.2.5电镜分析TAN、CDs、物理混合物(TAN-CDs)及 TAN/CDs 包合物的 SEM 图见电子版支撑材料图 S3.由图 S3 可知，TAN 为类似长方体的晶型结构，-CD、HP-CD 及 TM-CD 分别呈块状、中空且表面带孔的球状结构及表面有孔隙的无定型结构，TAN 与 CDs 的物理混合物则为二者结构的简单堆积，而 TAN/-CD、TAN/HP-CD 及 TAN/TM-CD 包合物的结构分别呈由小碎块组成的无定型结构、表面平整的块状结构以及不规则的块状结构.综上所述，包合物的结构与 TAN、CDs 及物理混合物的结构存在明显的差异，表明 TAN 与CDs 成功地形成了包合物.2.6核磁共振分析测定了 CDs 及 TAN/CDs 包合物在 D2O 中的1HNMR（见电子版支撑材料图 S4）和 2DNMR 谱图(见电子版支撑材料图 S5).从图S4 可观察到，TAN/CDs 包合物在 7.387.53范围 内 出 现 了 TAN 的 H3、H3及 H5的 峰，表 明TAN/CDs 包合物制备成功.表 S2(见电子版支撑材料)为 CDs 与 TAN 包合前后的化学位移.由表 S2 可知，-CD、HP-CD以及 TM-CD 包合 TAN 后，所有质子的化学位移均发生了变化，其中-CD、HP-CD 及 TM-CDH3 的化学位移分别移动了：0.02，0.06，0.05；H5 的化学位移分别移动了：0.01，0.03，0.04.3 种包合物中环糊精 H3 的化学变化均大于 H5 的化学位移变化，而 H3 位于 CDs 的大口端，H5 位于 CDs 的小口端，因此可推断出 TAN 均从 CDs 的大口端进入空腔.为了推断 TAN 与-CD、HP-CD 及 TM-CD的结合模式，测定了 3 种包合物的 ROESY 谱(电子版支撑材料图 S5).图 S5 显示，TAN 的 H3 与-CD 的 H3 相关，H3、H5和 H3 与-CD 的 H5 相关；TAN 的 H3、H5与 HP-CD 的 H3 相关，H3 与 HP-CD 的 H3 相关；TAN 的 H3、H5和 H3 与 TM-CD 的 H5 相关.可推断出，TAN 的 A 环均从 CDs的大口端进入空腔，并且整个药物分子贯穿在CDs 空腔中，其可能的络合模式如图 S6(电子版支撑材料)所示.2.7水溶性分析通过 1.2.5 中的方法，将所测吸光度带入 TAN 的线性方程(A=28.3641c0.0464),图3桔皮素(a)、环糊精(b)、桔皮素与环糊精物理混合物(c)桔皮素/环糊精包合物(d)的 XRD 图Fig.3XRDpatternsoftangeretin(a);CDs(b);physicalmixtureoftangeretinandCDs(c);tangeretin/CDsinclusioncomplexes(d)(A:-cyclodextrin,B:2-hydroxypropyl-cyclodextrin,C:2,3,6-trimethyl-cyclodextrin)第45卷古捷等：桔皮素与-环糊精及其衍生物的包合行为研究907计算得到 TAN、TAN/-CD、TAN/HP-CD 及 TAN/TM-CD 的溶解度分别为0.108、0.156、0.219mg/mL及 0.517mg/mL(具体数据见表 S3)，表明 TAN 经CDs 包合之后溶解度得到改善.2.8稳定性分析电子版支撑材料中图 S7 为TAN 及 TAN/CDs(-CD、HP-CD 及 TM-CD)包合物在模拟人体胃液(pH=1.5)和模拟人体肠液(pH=7.6)中的稳定性测定结果.由图 S7A 可明显观察到，在 pH=1.5 的环境中，TAN 在 024h 内的相对吸光度值急剧下降，2448h 缓慢升高，48h后又开始下降，6072h 内下降更为明显，直到72h 时共下降了 18.11%，而 TAN/CDs 包合物的相对吸光度值波动趋势均比 TAN 缓慢，TAN/-CD、TAN/HP-CD 及 TAN/TM-CD 包合物最终分别变化了 7.66%、1%以及 2.93%.由图 S7B 可知，在pH=7.6 的环境中，TAN 在 072h 内相对吸光度值一直呈下降趋势，到 72h 时共下降了 14.33%，而 TAN/CDs 包合物的相对吸光度值呈缓慢下降的趋势，TAN/-CD、TAN/HP-CD 及 TAN/TM-CD包合物最终分别下降了 3.09%、5.14%以及 6.34%.综上所述，TAN 经 CDs 包合之后稳定性均得到了显著提高，且包合物在酸性环境中更稳定.2.9分子对接分析程序将均方根偏差相近的构象进行聚类分析，通过对接结果图 4 可以发现：TAN 贯穿在 3 种环糊精的空腔中，说明 TAN 与CDs 成功形成了主客体包合物.对 3 种包合物的最优构象进行分析可得：TAN 均以 A 环从 CDs 的大口端进入空腔中，均能与核磁共振结果相对应.此外，TAN 与 CDs 之间形成了氢键：TAN7 号位的羟基与-CD2 号位上的氧形成了一条 2.855nm 的氢键，与 HP-CD2 号位上的氧形成了一条 2.957nm的氢键，以及与 TM-CD2 号位上的氧形成了一条 2.027nm 的氢键，表明 TAN 与 CDs 之间通过氢键作用和疏水作用形成包合物.图4桔皮素与环糊精分子对接最稳定的包合模式Fig.4ThemoststableinclusionmodeofdockingbetweenTANandcyclodextrinsmolecules(-cyclodextrin(a);2-hydroxypropyl-cyclodextrin(b);2,3,6-trimethyl-cyclodextrin(c)3结语本文采用饱和溶液法成功制备了 TAN 与-CD、HP-CD 和 TM-CD 的包合物，通过 Job 曲线 推 断 出 了 TAN 与 CDs 的 主 客 体 包 合 比 为11.利用非线性最小二乘法对紫外可见滴定数据拟合后，发现 TAN 于 CDs 在 pH=3.0 的溶液中的稳定常数比 pH=10.5 溶液中的稳定常数大，说明 TAN 与 3 种环糊精在 pH=3.0 的条件下更易形成包合物.此外，还采用了 XRD、FT-IR、SEM、和NMR 等手段对包合物进行了表征.实验结果表明TAN/CDs 包合物制备成功，而 NMR 的测试结果显示 TAN 以 A 环从 CDs 的大口端进入空腔，且整个药物分子贯穿在环糊精的空腔中，这与分子对接结果相吻合.最后，通过饱和溶液法对 TAN 包合前后在水中的溶解度进行了考察；还探究了包合物在pH=1.5(模拟人体肠液)和 pH=7.6(模拟人体胃液)环境中的稳定性，结果表明 TAN 经 CDs 包合后溶解度和稳定均得到改善，这为制备 TAN 的药物制剂提供了理论基础.参考文献：RazaW,LuqmanS,MeenaA.Prospectsoftangeretinasamodulatorofcancertargets/pathwaysJ.Pharma-cologicalResearch,2020,161:105202.DOI:10.1016/j.phrs.2020.105202.1ZhanF,YanX,LiJ,etal.Encapsulationoftangere-tin in PVA/PAA crosslinking electrospun fibers byemulsion-electrospinning:Morphologycharacterization,2908云南大学学报（自然科学版）http:/第45卷slow-release,and antioxidant activity assessmentJ.FoodChemistry,2021,337:127763.DOI:10.1016/j.foodchem.2020.127763.Seo J,Lee H S,Ryoo S,et al.Tangeretin,a citrusflavonoid,inhibitsPGDF-BB-inducedproliferationandmigrationofaorticsmoothmuTANlecellsbyblockingAKTactivationJ.EuropeanJournalofPharmacology,2011,673(1/3):56-64.DOI:10.1016/j.ejphar.2011.10.011.3HFT-IRanoT,AbeK,GotohM,etal.Citrusflavonetangeretininhibits leukaemic HL-60 cell growth 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